Эмбриональный головной мозг позвоночных является первым органом развивающимся и образующим полую структуру, похожую на баллон, быстро расширяющийся во время раннего эмбриогенеза. Этот рост проявляется в виде активного взаимозависимого синергизма между увеличением спинномозговой жидкости (CSF) в полости и пролиферацией клеток, представляющих нейроэпителий (Gato & Desmond, 2009). Первоначально эмбриональный головной мозг представлен открытой трубкой, которая становится постепенно запечатанной с переднего конца и сзади за счет закрытия переднего нейропора и закупорки спинномозгового нейроцеля (Desmond & Schoenwolf 1984). Когда трубка закрывается, она образует также три пузыря: prosencepalon/передний мозг, mesencephalon/средний мозг и rhombencephalon/задний мозг. Экспансия головного мозга происходит теперь быстро, по-видимому, регулируется за счет увеличения давления внутри просвета, создаваемого за счет увеличения CSF (Desmond & Jacobson, 1977; Pacheco et al., 1986; Desmond & Levitan, 2002). В то же самое время, когда головной мозг расширяется, нейроэпителий подвергается быстрой пролиферации и последующей дифференцировке. Клеточная выстилка просвета состоит из зародышевых нейронов, которые пролиферируют, чтобы сформировать наружные слои. Клетки внутреннего слоя также мигрируют в наружные слои и начинают дифференцироваться в промежуточные и окончательные нейроны.

Накопление CSF посредством осмотического градиента не только создает внутреннее давление (Desmond & Jacobson, 1977; Gato et al., 1993; Desmond et al., 2005), но и также снабжает трофическими факторами, такими как FGF-2 для нейроэпителия (Gato et al., 2005; Martin et al., 2006; Parada, et al., 2008). Снижение внутрипросветного давления в эмбриональном головном мозге кур приводит к 50% уменьшению как объема ткани, так и количества клеток (Desmond 1985; Desmond & Jacobson 1977). Напротив, увеличение внутрипросветного давления в течение часа вызывает двукратное увеличение количества клеток в нейроэпителии (Desmond et al., 2005). Эти находки подтверждают, что внутрипросветное давление регулирует клеточную пролиферацию, что немедленно приводит нас к вопросу, как механистически это может происходить. Имеются ли вообще-то молекулы на поверхности просвета эмбрионального нейроэпителия, которые действуют как механотрансдукторы, такие как те, что найдены на просветной поверхности кровеносных сосудов s (Lehoux et al., 2003, 2005)?

Эти механотрансдукторы или focal adhesion kinases (FAKs), как было установлено, увеличивают апикальную поверхность сегментов perfused аорты кроликов, при удвоении внутреннего давления вдвое в сегменте (Lehoux, et al., 2005). Они также показали, что они локализованы на апикальной поверхности пигментного эпителия сетчатки во время фагоцитоза (Finneman 2003); на внутренних волосковых клетках маточки во внутреннем ухе (Evans & Muller 2000); и в neointima новых кровеносных сосудов (Cai et al., 2009). Др. исследования показали, что они активируются в культурах клеток легочного эпителия при натяжении, что коррелирует с увеличением клеточной пролиферации, при этом активируются Src и ERK (Chaturvedi, et al., 2007). Локализация FAKs не была обнаружена исследователями легких. Наиболее вероятно, что FAKS находятся на базальной поверхности легочного эпителия, как и в большинстве эпителиев иных, чем те, что окружают жидкость, наполняющую полости, такие как кровеносные сосуды и эмбриональный головной мозг. Фактически, значительно более известно об экспрессии FAK на базальной поверхности по сравнению с её экспрессией на апикальной поверхности. Несмотря на это достаточно доказательств апикальной экспрессии в кровеносных сосудах и др. тканях.

Т.к. давление, будучи примененным к нейроэпителию, продолжает воздействовать неуклонно, то мы предположили, что путь механо-детекции в нейроэпителии может быть инициирован фосфорилированием FAK. Эмбриональный головной мозг это в первую очередь заполненная жидкостью полость и поэтому сходна с аортой за исключением отличий в величине внутрипросветного давления. Фактически, внутрипросветное давление внутри аорты, по крайней мере, в 23 раза больше, чем в эмбриональном головном мозге, исходя из измерений статического давления в аорте и головном мозге. Внутреннее статическое давление в аорте 80 mm Hg (Lehoux, et al., 2005) по сравнению со средним статическим давлением в 3.5 mm Hg CSF в пузырях эмбрионального головного мозга (Desmond, et al., 2005). Значительное отличие в величине внутреннего давления может означать, что механо-рецепторы на поверхности аорты более приспособлены отвечать на изменения в давлении, чем в эмбриональном головном мозге. Т.о., мы предположили, что имеются изменения в фосфорилировании FAKs на поверхности нейроэпителия в ответ на увеличение внутрипросветного давления, но эта реакция может быть не столь выраженной, как в эндотелии аорты. FAK является протеин киназой, которая образует фокальные комплексы на цитоплазматической стороне клеточной мембраны и аутофосфорилируется в ответ на передачу сигналов интегринов (Katsumi et al., 2004; Mitra et al., 2005). Она является подсемейством не рецепторных тирозин протеин киназ (PTK) и обеспечивает двунаправленную передачу сигналов или во внеклеточный матрикс (Swartz, 2001) на базальной поверхности или во внеклеточную жидкость, такую как кровь в сосудах на просветной поверхности, как описывалось выше.

Аутофосфорилирование, а, следовательно, активация FAK происходит, когда интегрин-связывающие белки, такие как paxillin и talin поставляются на сайты активного интегрина на клеточной поверхности. FAK как протеин тирозиновая киназа жертвует фосфатную группу др. белкам, чтобы активировать или деактивировать их. FAK сама по себе может быть фосфорилирована, чтобы инициировать активный внутриклеточный сигнальный каскад. В ответ на передачу сигналов integrin, FAK мигрирует в места фокальных адгезий, где она может само-активировать себя путем образования димера с др. белком FAK, процесс наз. авто- или транс-фосфорилирование. Как только FAK оказывается активированной она рекрутирует и затем фосфорилирует др. внутриклеточные белки, такие как Src и Grb2, чтобы инициировать различные сигнальные каскады внутри клетки (Zhao and Guan, 2011). Src и ERK 1/2 были идентифицированы как нижестоящие по отношению к FAK сигнальные молекулы, которые активируются в ответ на растяжения клеток, чтобы индуцировать клеточную пролиферацию (Chaturvedi, et al., 2007). Большинство из нас знают о пути передачи сигналов FAK на базальной поверхности.

Согласно нашему предположению повышенное давление, генерируемое с помощью CSF на нейроэпителий детектируется с помощью FAK на его просветной поверхности, это в свою очередь передает сигнал в ядро посредством Src-зависимого каскада ERK1/2 (Cho et al., 2005; Lehoux, et al., 2005). В данном исследовании мы сфокусировались на том, находится ли FAK в самом деле на просветной поверхности, как в кровеносных сосудах.

Исходя из настоящего понимания FAK и нашей гипотезы, что внутрипросветное давление создает позитивный пролиферативный сигнал, которые передается с помощью FAK, мы тестировали несколько предсказаний, исходя из того, что FAK в самом деле располагается на просветной поверхности нейроэпителия в раннем заполненном жидкостью эмбриональном головном мозге и отвечает на изменения внутреннего давления жидкости. Во-первых, мы намеревались иммунологически локализовать FAK на апикальной и базальной поверхностях нейроэпителия в трех фазах роста эмбрионального головного мозга: в период, непосредственно предшествующий закрытию нервной трубки, непосредственно после закрытия и в период быстрого увеличения головного мозга. Во-вторых, намеревались иммунологически оценить фосфорилирование FAK по двум остаткам тирозина, tyr 397 и tyr 861. Наконец, мы намеревались продемонстрировать различия в количестве FAK и её состояние активации на просветной и базальной поверхности эпителия в головном мозге, когда внутреннее давление увеличивалось.

Discussion

Главной находкой данного исследования стало то, что FAK, также, как и его активированная форма, были иммунологически локализованы впервые в нейроэпителии во время периода роста головного мозга, управляемого внутренним давлением. FAK, механотрансдуктор в др. физиологических системах, как известно, детектирует давление и передает сигналы в ядро посредством src-Erk каскада. Более важно, мы показали, что увеличение внутрипросветного давления вызывает достоверное увеличение p-FAK на просветной поверхности мезэнцефалона с соотв. снижением уровней на базальной поверхности (Fig. 6). Итак, наши находки подтвердили увеличение внутрипросветного давления дает отличающийся паттерн активации FAK на базальной и просветной поверхности, это предположительно облегчает передачу сигнала, который в конечном итоге приводит к пролиферативному ответу в нейроэпителии.

Наши результаты подтверждают гипотезу, что система нейроэпителиальных рецепторов внутрипросветного давления работает во время раннего развития, чтобы приспособить полость головного мозга к росту стенки нейроэпителия.

FAK expression in the neuroepithelium

FAK была описана ранее на эмбриональном нейроэпителии позвоночных (Hens & DeSimone, 1995), но наши результаты впервые показали, что FAKs обнаруживают специфический паттерн локализации в нейроэпителии, особенно на поверхности. Рассматривая наши результаты в контексте раннего роста головного мозга, увеличение объема полости связано с увеличением размера нейроэпителия. Оба увеличения в размере связаны. Объем полости увеличивается за счет позитивного давления CSF и рост нейроэпителия увеличивается за счет клеточной пролиферации. Ранее мы показали корреляцию между увеличением внутрипросветного давления и увеличением митозов в эмбриональном головном мозге (Desmond et al., 2004); однако связь между двумя не была установлена, т.к. существуют и др. физиологические системы, регулируемые с помощью внутрипросветного давления. Такой системой является аорта. Аорта изучалась экстенсивно Lehoux, et al., 2005. Они показали, что увеличение внутрипросветного давления увеличивает активацию FAK, Src и Erk. При удвоении постоянного давления в сегментах культивируемой аорты Lehoux et al., 2003, 2005 показали с помощью иммуногистохимической локализации, что фосфорилирование FAK повышается на просветной стороне, т.е. в эндотелии плюс расположенным рядом слое сосудистых гладкомышечных клеток. Кроме того, лизаты аорты, подвергнутой устойчивому давлению, обнаруживали втрое увеличение фосфорилированной FAK и ERK1/2 относительно общей иммунопреципитированной FAK или Erk по сравнению с контролем. Высокое внутрипросветное давление (150 mm Hg) активирует FAK по нескольким остаткам тирозина: Tyr-397, Tyr-407, Tyr- 861 и Tyr-925. Исследователи далее показали, что активация FAK, индуцируемая постоянным высоким давлением частично снижается в присутствии ингибитора семейства киназ Src и что FAK иммунопреципитируется совместно с Grb2. Т.о., они оказались способны частично охарактеризовать путь активации FAK, индуцируемой устойчивым высоким давлением. Наши результаты отличаются от Lehoux, et al., 2005 тем, эмбриональный головной мозг подвергался хроническому воздействию высокого давления, выявили отличный паттерн активации FAK, но не действительное увеличение количественно. Наше объяснение такому отличию может быть таковым, что высокое давление, вносимое нами в эмбриональный головной мозг во много раз меньше, того, что у Lehoux, et al. в аорте.

FAK активация также наблюдалась как в эндотелиальных клетках, так и сосудистых гладкомышечных клетках в условиях культивирования, после воздействия постоянного растяжения (Yano, et al., 1996; Li, et al., 2003). Эти эксперименты in vitro были параллельны др. исследованиям с использованием культур человеческих легочных эпителиальных клеток, показавшими, что Src и FAK обеспечивают механическим растяжением индуцированную клеточную пролиферацию и фосфорилирование ERK1/2 (Chaturvedi, et al., 2007). Это исследование H144 легочных эпителиальных клеток тонко коррелирует с увеличением клеточной пролиферации с увеличением фосфорилирования FAK, Src и ERK1/2, но не продемонстрировали локализацию FAK, или тотальной или фосфорилированной. FAK остатки, которые были активированы с помощью циклических растяжений были tyr 397 и tyr 576.

FAK expression in the neuroepithelium modified by intra- luminal pressure

Две находки в наших результатах поддерживают идею, что активация FAK неотъемлемой частью роста головного мозга. Одна то, что p-FAK увеличивается рано во время роста головного мозга, как только нервная трубка оказывается закрыта в результате закупорки спинального нейроцеля она оказывается под давлением (Desmond & Schoenwolf, 1985). Др. то, что имеется увеличение p-FAK на просветной поверхности в ответ на увеличения внутрипросветного давления.

FAK as a mechanotransducer of intraluminal pressure that promotes mitosis

В др. модельных системах связь между давлением и митозами была установлена в виде рецепторных комплексов, в основном идентифицированных как интегрины, ассоциированные с внутриклеточным каскадом, состоящим из FAK, Src и Erk. Фосфорилирование этих элементов определяет степень стимулирования митозов. Интегрины на апикальной поверхности нейроэпителия ранее были описаны др. (Caprila, et al., 2009). В нашем исследовании мы показали, что FAK присутствует внутри нейроэпителиальных клеток и обнаруживает паттерн фосфорилирования, ассоциированный с закрытием нервной трубки и становлением закрытой системы давления (Desmond and Jacobson, 1977; Desmond, 1982). Однако, когда мы индуцировали изменения во внутреннем давлении, осуществляемом на просветную поверхность, мы не выявили изменений в величине фосфорилирования FAK, но мы нашли перемещение активации FAK на просветную сторону с базальной стороны. Мы полагаем, что эти механотрансдукторы связывают внутрипросветное давление и увеличение митозов, как показано на модели, представленной на Рис. 7.

Открытие FAK в нейроэпителии чрезвычайно важно, поскольку давно известно, что рост эмбрионального головного мозга нуждается в деликатном балансе между увеличением размера полости посредством накопления жидкости, чтобы поддерживать внутрипросветное давление и увеличивать тканевой объем посредством клеточной пролиферации (Desmond & Jacobson 1977; Pacheco et al., 1986; Alonso et al., 1998, 1999; Desmond et al., 2005; Gato & Desmond, 2009; Levitan & Desmond, 2010). Вообще-то это лучше всего понять в свете

Fig. 6. The neuroepithelium exhibits a significant increase in PCNA labeled cells even when b-d-xyloside is in the culture medium sug- gesting that b-d-xyloside used to increase the intraluminal pressure has no deleterious effects on normal metabolism of the cells. The photomicrographs are from untreated (A) and treated embryos (B) with b-d-xyloside which is in our experiments to increase intraluminal pressure. The data includes 36 embryos. The magnification bar represents 15 mm.

того факта, что ранний эмбриональный головной мозг позвоночных - это в основном полость (70%), окружённая относительно тонким нейроэпителием (30%). Баланс между ростом двух компонентов нуждается в поддержании нормальной архитектуры эмбрионального головного мозга. При неспособности ткани к росту увеличивающееся давление часто приводит к истончению нейроэпителия и сильному расширению полости с характерной гидроцефалией.

Если рост ткани значительно выше и превосходит баланс внутреннего давления в полости, то ткань образует складки внутрь полости, характерные для дефекта, известного как Chiari II malformation (McLone & Knepper, 1989). Т.о., неспособность поддерживать баланс между ростом двух взаимозависимых систем приводит к врожденным дефектам. Хотя много известно о скорости роста эмбрионального головного мозга, давление, генерируемое накоплением CSF в полости и роль FGF-2 в стимуляции пролиферации и дифференцировки нейронов неизвестна в отношении молекулярно-клеточных механизмов, с помощью которых внутрипросветное давление индуцирует клеточную пролиферацию. Данное исследование показало впервые, что известные механотрансдуктор, FAK, активен в нейроэпителии во время периода быстрого роста.

FAK as a facilitator of neuronal cell alignment

Помимо индукции митозов, FAK может выполнять и д. важную роль во время роста нейроэпителия, а именно может участвовать в интеркаляции вновь образующихся дочерних клеток в нейроэпителий. Тот факт, что мы находим p-FAK по всему нейроэпителию, также, как и на обеих поверхностях, подтверждает, что p-FAK может оказывать поддержку интеркаляции вновь формируемых дочерних клеток в результате митозов. Это может облегчаться потерей мембранных соединений с внеклеточным матриксом (ECM), что также характерно клеткам перед метастазированием (Chalkiadalki et al., 2009). Несколько исследований подтвердили роль FAK в качестве модулятора между адгезией клеток с ECM и пролиферацией, обнаруживаемой в эндотелии (Ishida et al., 1996; Lehoux & Tedgui 2003; Pirone et al., 2006). Разборка фокальных адгезий перед хемотаксисом не только использует FAK, но и также FGF-2 посредством др. не рецепторной протеин киназы, Fes (Kanda et al., 2006). Эти исследования показали, что FGF-2 действует на Fes, чтобы модулировать активацию Src с помощью FAK. Мы полагаем, что это может быть также верным для эмбрионального нейроэпителия, для которого ранее мы показали, что и внутрипросветное давление и FGF-2 повышают клеточную пролиферацию (Desmond et al., 2005; Gato et al., 2005; Martin et al., 2006).

Multiple mechanisms of regulating epithelial cell replication

Многие исследования показали, что имеются рецепторы для факторов роста на просветной стороне нейроэпителия (Parada, et al., 2008). Эти факторы возникают изнутри нейроэпителиальных клеток и CSF (Lehtinen, et al., 2011). Здесь мы описали комплементарный механизм регуляции роста эмбрионального головного мозга. Этот механизм, скорее всего, появляется в период быстрого роста головного мозга как добавочный путь для индукции митозов, чтобы приспособиться к быстрому росту.

Perspectives on the pressure-FAK regulation system in brain growth

В данном исследовании подчеркивается важность механо-физических свойств в морфогенезе. Несмотря на важность молекулярных механизмов, механо-физические механизмы имеют отношение к пониманию сложности эмбрионального развития. Молекулярные функциональные эксперименты необходимы, чтобы проверить гипотезу, что p-FAK является важным механотрансдуктором в нейроэпителии, которые посылает сигналы в ядро посредством пути MEK. Дальнейшие эксперименты необходимы, чтобы исследовать эффект специфических ингибиторов фосфорилирования FAK, а также иммунолокализацию Src и ERK в тот же самый период быстрой экспансии эмбрионального головного мозга.