Congenital heart defects (CHDs) возникают ~1% живорожденных (Hoffman and Kaplan, 2002), пока знания лежащих в основе генетических причин специфических структурных дефектов довольно ограничены (Olson, 2006; Bruneau, 2008). Более того, отсутствует понимание как клетки кардиальных предшественников обновляются и дифференцируются in vivo, это препятствует прогрессу в лечении сердечно-сосудистых болезней за счет кардиальной регенерации с использованием эндогенных кардиальных предшественников.

Drosophila Numb, внутриклеточный адапторный белок, стал первой молекулой, обнаружившей влияние на выбор клеточных судеб благодаря его асимметричной сегрегации во время клеточного деления (Rhyu et al., 1994) и путем ингибирования передачи сигналов Notch (Uemura et al., 1989; Frise et al., 1996; Spana and Doe, 1996; Petersen et al., 2002). У мышей Numb имеется два гомолога, Numb и numb-like (Numbl), известные как Numb family proteins (NFPs). NFPs экспрессируются почти повсеместно во время эмбриогенеза (Zhong et al., 1997) и , как известно, участвуют как детерминанты клеточных судеб путем поддержания судеб нейральных стволовых клеток и регуляции их дифференцировки (Verdi et al., 1996; Petersen et al., 2002; Li et al., 2003; Petersen et al., 2004). NFPs участвуют также в спецификации и дифференцировке гематопоэтических стволовых клеток (Wu et al., 2007), мышечных сателлитных клеток (Conboy and Rando, 2002), раковых стволовых клеток (Ito et al., 2010) и гемангиобластов (Cheng et al., 2008). Недавно выявлены дополнительные механизмы передачи сигналов Numb на молекулярном уровне. Numb функционирует в качестве компонента слипчивых соединений, чтобы регулировать клеточную адгезию и миграцию (Rasin et al., 2007; Wang et al., 2009; Wu et al., 2010), и участвует в убиквитилировании p53 (Trp53) (Colaluca et al., 2008) и Gli1 (Di Marcotullio et al., 2006), чтобы регулировать инициацию рака. Numb был также описан в комплексе с β-catenin (Rasin et al., 2007; Wu et al., 2010; Kwon et al., 2011), чтобы регулировать передачу сигналов Wnt. Кроме того, Numb взаимодействует с интегриновыми β субъединицами (Calderwood et al., 2003) и способствует их эндоцитозу для направленной клеточной миграции (Nishimura and Kaibuchi, 2007).

Развитие сердца это регулируемый в пространстве и времени многоступенчатый процесс, который зависит от добавления клеток предшественников из 4-х источников, включая клетки из первого поля сердца и второго поля сердца first heart field and second heart field (FHF and SHF), клетки, происходящие из cardiac neural crest cells (CNCCs), и клетки, происходящие из про-эпикардиального органа (Kelly et al., 2001;Mjaatvedt et al., 2001; Waldo et al., 2001; Verzi et al., 2005; Vincent and Buckingham, 2010). Клетки предшественники из SHF мигрируют в предсуществующий каркас в виде линейной сердечной трубки и вносят вклад в миокард правого желудочка, тракта оттока (OFT) и в некоторую часть эндокарда на день эмбриогенеза (E) 8.5-10.25 (Kelly and Buckingham, 2002; Buckingham et al., 2005; Verzi et al., 2005; Ward et al., 2005). Пертурбации в развертывании SHF и дифференцировке предшественников приводят к спектру CHDs (Kelly, 2012) и ответственны за большинство CHDs (Buckingham et al., 2005; Bruneau, 2008). Задняя часть SHF вносит вклад в dorsal mesenchymal protrusion (DMP), важную структуру разделения камер (Snarr et al., 2007a). Аномалии дифференцировки и развития задней части SHF оказались ассоциированы с дефектами морфогенеза сердца, такими как atrial septal defect (ASD) и atrioventricular septal defect (AVSD) (Briggs et al., 2012).

Знание функции NFP в сердце млекопитающих ограничено, а специфическая роль NFPs в развитии сердца всё ещё неясна. У Drosophila, Numb участвует в контроле судеб миогенных клеток путем вмешательства в передачу сигналов Notch (Han and Bodmer, 2003). У рыбок данио, Numb необходим для лево-правостороннего асимметричного морфогенеза посредством регуляции передачи сигналов Notch (Niikura et al., 2006). У мышей, Numb, как известно, экспрессируется в клетках кардиальных предшественников у взрослых и асимметрично распределяется во время асимметричных делений предшественников (Cottage et al., 2010; Mishra et al., 2011). Кроме того, мы показали, что NFPs важны для эпикардиальных клеток, проникающих в миокард (Wu et al., 2010). Недавняя работа показала, что NFPs регулируют миокардиальную компакцию путем ингибирования Notch2 (Yang et al., 2012).

Ранее мы установили, что условная делеция NFPs в эпикардиальных клетках приводит к дефектам эпителиально-мезенхимного перехода эпикардиальных клеток (Wu et al., 2010). В данном исследовании мы делетировали NFPs посредством Nkx2.5^Cre/+, чтобы получить мышей с двойным миокардиальным нокаутом Numb и Numbl (MDKO) и установили, что NFPs необходимы для трабекуляции миокарда, дифференцировки кардиальных клеток предшественников, пролиферации кардиомиоцитов, разделения перегородкой OFT и атриовентрикулярного соединения и для расположения OFT alignment. Делеция NFPs в SHF восоздает морфогенетические дефекты MDKO. Дальнейших биохимический и генетический анализ выявил, что передача сигналов Notch1 активируется в миокарде MDKOs, а супрессия передачи сигналов Notch1 частично устраняет дефекты трабекуляции и пролиферации у MDKOs. Итак, NFPs ингибируют Notch1, чтобы регулировать пролиферацию кардиомиоцитов и толщину трабекул и обеспечивают дифференцировку клеток кардиальных предшественников зависимым от эндоцитоза и независимым от Notch1 способом.

DISCUSSION

NFPs play multiple roles during cardiac development and their disruption results in multiple CHDs

Дефекты в трабекуляции, пролиферации, дифференцировке предшественников, разделении перегородкой OFT и атриовентрикулярного соединения и расположения OFT в сердце MDKO, вместе с недавним сообщением, что NFPs ингибируют Notch2, чтобы регулировать компакцию (Yang et al., 2012), продемонстрировали, что NFPs являются важными для развития и морфогенеза сердца. Эти находки расширяют наш предыдущий анализ, что NFPs важны для развития эпикарда (Wu et al., 2010). Настоящий анализ с использованием NFP нокаутных моделей, опосредованных c помощью Tie2-Cre, Wnt1-Cre, SM22-Cre, WT1CreERT2, Mef2c-Cre и Nkx2.5Cre/+ подтвердил, что ключевые функции NFPs в развитии сердца являются стадио- и тип-специфическими. Нокауты NFP обеспечиваемые c помощью Tie2-Cre, WT1CreERT2 и Wnt1-Cre не выявляли каких-либо заметных морфогенетических дефектов в сердце (supplementary material Fig. S2), демонстрируя что функции NFP в эндокардиальных клетках, эпикардиальных клетках и в CNCCs не важны для морфогенеза сердца. SM22-Cre-обусловленный нокаут NFP в кардиомиоцитах частично фенокопирует проявления у MDKO, при этом наблюдаются нарушения трабекуляции, но не обнаруживаются дефекты в дифференцировке и морфогенезе. (supplementary material Fig. S2). Mef2c-Cre-обусловленные NFP нокауты воспроизводят дефекты морфогенеза MDKO, показывая, что NFPs в SHF важны для кардиального морфогенеза (Fig. 3; supplementary material Fig. S2). Различия в фенотипах между SM22-Cre-обусловленными и Nkx2.5Cre/+-обусловленными мутантами могут быть обусловлены различиями во времени индукции и в типах клеток, в которых делетированы NFPs. Nkx2.5^Cre/+ были активны в кардиомиоцитах, происходящих из FHF и SHF, в некоторых эндокардиальных клетках из OFT и AVC (supplementary material Fig. S1A,B), и очень мало в эндокардиальных клетках желудочков (supplementary material Fig. S1C, Movie 1) и оказывались активными начиная с E7.5 исходя из Nkx2.5^Cre/+; mTmG. Напротив, SM22-Cre активен в некоторых кардиомиоцитах на ст. E8.5 в сердечной трубке, но не во всех кардиомиоцитах вплоть до ~E9.0, стадии, на которой клетки кардиальных предшественников уже инициируют процессы дифференцировки.

Однако, экспрессия Nkx2.5^Cre/+ в эндокардиальных клетках, по-видимому, не является причиной AVSD и дефектов разделения OFT у MDKO, т.к. Tie2-Cre-вызываемая делеция NFP не вызывает какого-либо дефекта. Более того, делеция NFP вызываемая посредством Mef2c-Cre, которая неактивна в эндокардиальных клетках AVC (Fig. 3B), вызывает AVSD, указывая, что отсутствие NFP в эндокардиальных клетках AVC не вызывает AVSD у мутантов. Вместо этого, дефекты морфогенеза в MDKOs могут быть обусловлены дефектами дифференцировки клеток предшественников SHFt, как это подтверждается активацией Isl1, Fgf8, Hoxa3 и Tbx1 у MDKOs. Это согласуется с предыдущими сообщениями, что подавление или активация Fgf8/Fgf10 (Kelly et al., 2001; Ilagan et al., 2006; Park et al., 2006), Isl1 (Ai et al., 2007; Kwon et al., 2007; Lin et al., 2007; Ueno et al., 2007) и Tbx1 (Vitelli et al., 2002) участвуют в дифференцировке клеток предшественников SHF и, следовательно, вызывают кардиальные морфогенетические дефекты или CHDs (Buckingham et al., 2005; Black, 2007; Rochais et al., 2009). Дальнейшие исследования показали, что NFP-нулевые клетки неспособны формировать миокардиальные шипы (spikes), ориентированные перпендикулярно к стенке сердца (Fig. 3E), и неспособны мигрировать в подушки OFT, что может приводить к дефектам разделения перегородкой OFT.

NFPs regulate ventricular trabeculation and compaction

Трабекуляция и компакция желудочков это два родственные, но отличающиеся биологические процессы во время кардиального морфогенеза. Трабекуляция начинается на ст. E9.0-9.5, а компакция миокарда происходит ~E14.5 (Samsa et al., 2013; Zhang et al., 2013). Отсутствие трабекуляции ведет к эмбриональной летальности у мышей, а избыток трабекуляции вызывает кардиомиопатию и сердечную недостаточность у людей (Jenni et al., 1999; Weiford et al., 2004;Breckenridge et al., 2007). Несмотря на фундаментальную природу этих морфогенетических процессов, молекулярные и клеточные механизмы, контролирующие трабекуляцию и компакцию изучены неполностью. Пути, которые регулируют трабекуляцию, включают сигнальные пути Notch1 и Notch2. Глобальная или специфичная для эндотелия делеция Notch1 вызывает гипоплазию желудочков и дефекты трабекуляции (Grego-Bessa et al., 2007). Активация Notch1 в раннем клоне кардиальных клеток с помощью Mesp1-Cre-обусловленной избыточной экспрессии NICD1 приводит к тяжелым кардиальным морфогенетическим дефектам, включая аномальную морфологию желудочков, сходную с отсутствием компакции в желудочках (Watanabe et al., 2006). Однако, избыточная экспрессия NICD1 в кардиомиоцитах на поздних стадиях посредством Mlc-2v-Cre не вызывает обычного морфогенеза трабекул (Croquelois et al., 2008). Расхождение может быть вызвано активацией Notch1на разных стадиях развития или в разных популяциях клеток.

Внутриклеточный домен Notch2 (N2ICD) выявляется по всему миокарду до ст. E11.5, но на более поздних стадиях активность Notch2 специфически подавляется в компактной зоне и ограничивается трабекулярным миокардом во время компакции желудочков (Yang et al., 2012). Глобальный нокаут Notch2 вызывает гипоплазию желудочков (McCright et al., 2001). Делеция Notch2 в сердце посредством SM22-Cre приводит к цианозу при рождении из-за сужения артерий, но не описано влияет ли оно на процесс трабекуляции (Varadkar et al., 2008). Однако, анализ потери функции Notch1 или Notch2 в кардиомиоцитах не смог определить, участвуют ли они в морфогенезе трабекул, т.к. все 4 Notch рецептора экспрессируются на относительно высоких уровнях в сердце (supplementary material Fig. S6B) и делеция одного из Notch рецепторов к кардиомиоцитах может быть компенсирована за счет функции др. , хотя они могут не экспрессироваться в кардиомиоцитах при наормальных условиях. Yang et al. (Yang et al., 2012) сообщили, что N2ICD продолжает присутствовать в компактной зоне на ст. E12.5 и E13.5, но он не обнаруживается в контроле и мы наблюдали, что NICD1 присутствует в кардиомиоцитах в компактной и трабекулярной зоне у MDKO, указывая тем самым, что NFPs регулируют морфогенез трабекул путем ингибирования Notch1 и Notch2.

Морфогенез трабекул это многоступенчатый процесс, который включает, но не ограничивается инициацией трабекул, пролиферацией/ростом,дифференцировкой и компакцией. Notch1 и Notch2 могут регулировать разные ступени морфогенеза трабекул. Исследования генетического эпистаза могут определить, функционируют ли рецепторы Notch ниже NFPs в регуляции определенных ступеней морфогенеза трабекул. MDKOs обнаруживают низкий уровень экспрессии p57, более высокую скорость пролиферации и более толстые трабекулы. Когда один из аллелей Notch1 делетирован у MDKO, то экспрессия p57 и пролиферация частично восстанавливались (Fig. 7F,G) , а толщина трабекул уменьшалась по сравнению с таковой у MDKO (Fig. 6F). Однако, делеция Notch1 не устраняла дефекты в инициации трабекуляции и отсутствия компакции (supplementary material Fig. S5A,B; data not shown). Это указывает на то, что NFPs ингибируют Notch1, чтобы регулировать пролиферацию кардиомиоцитов и рост и толщину трабекул, но не инициацию образования трабекул и компакцию. Избыточная экспрессия NICD2 в кардиомиоцитах, обусловленная αMHC-Cre? приводит к избыточной трабекуляции и отсутствию компакции, указывая, что Notch2 участвует в компакции и что NFPs могут ингибировать Notch2, чтобы регулировать компакцию (Yang et al., 2012). Однако, многие вопросы относительно регуляции морфогенеза трабекул с помощью Notch1 и Notch2 остаются. Активность Notch2 ограничена трабекулами, где клетки более дифференцированы, более зрелые и менее пролиферативные по сравнению с кардиомиоцитами компактной зоны, остается ряд вопросов, таких как ингибирует ли Notch2 пролиферацию кардиомиоцитов и способствует ли их дифференцировке, чтобы регулировать компакцию и каковы уникальные нижестоящие мишени для Notch2, регулирующие компакцию. Наблюдения, что как делеция Notch1 (Grego-Bessa et al., 2007), так и избыточная экспрессия (Venkatesh et al., 2008) в эндокардиальных клетках снижает трабекуляцию, указывает на то, что необходимы дальнейшие исследования для выявления как Notch1 регулирует морфогенез трабекул.

NFPs regulate Notch1 signaling during cardiac development

Одним из хорошо изученных путей, с помощью которого NFPs регулируют, является передача сигналов Notch1. Показано, что Numb ингибирует передачу сигналов Notch1 в клетках Drosophila и млекопитающих (Guo et al., 1996;Spana and Doe, 1996; Zhong et al., 1996; McGill and McGlade, 2003; Cheng et al., 2008;McGill et al., 2009; Beres et al., 2011). Однако, Numb-Notch1 взаимоотношение во время эмбриогенеза пз остается загадкой (Zhong et al., 1996; Petersen et al., 2006). Хотя фенотип после глобального нокаута NFP сходен с таковым у мутантов с нарушенным путем Notch1, это приводит к предположению, что передача сигналов Numb и Notch1 ассоциированы, мишени для Notch1 не активируются при глобальном нокауте NFP во время развития млекопитающих, как это предполагается, если Numb ингибирует передачу сигналов Notch1 (Petersen et al., 2006). Точное взаимоотношение между Numb и Notch1 во время эмбриогенеза поэтому неясно. Необходимы генетические инструменты для тестирования взаимодействия между Numb и Notch1, чтобы выявить это взаимоотношение. Мы использовли трансгенную Notch репортерную линию и др. методы, чтобы четко показать, что каноническая передача сигналов Notch активируется в сердцах MDKO. Существенно, что делеция одного аллеля Notch1 частично устраняет фенотип MDKO, включая экспрессию p57, пролиферацию кардиомиоцитов и толщину трабекул (Fig. 6). Это показывает, что NFPs регулируют пролиферацию и рост трабекул и их толщину посредством передачи сигналов Notch1.

Передача сигналов Notch1 является локальной и только клетки, которые соседствуют с лигандом будут активированы. Транскрипцияя Notch1 была самой высокой в эндокардиальных клетках и слабой в кардиомиоцитах. Было предположено, что jagged 1 в кардиомиоцитах может активировать Notch1 в эндокардиальных клетках, так что NICD1 обычно обнаруживается в эндокардиальных клетках (Grego-Bessa et al., 2007). Активированная передача сигналов Notch1 в эндокардиальных клетках затем может усиливать пролиферацию кардиомиоцитов путем ингибирования p57 посредством Bmp10 в миокарде (Chen et al., 2004; Grego-Bessa et al., 2007; Chen et al., 2013; Lux?n et al., 2013). В сердцах MDKO, уровень транскрипцияи Notch1 не отличается от того, что в контроле, исходя из определения последовательностей мРНК и Q-PCR (data not shown), а NICD1 бцл обнаружен как в эндокардиальных клетках, так и кардиомиоцитах, указывая, что Notch1 экспрессируется и в кардиомиоцитах и что NFPs необходимы, чтобы ингибировать NICD1 на посттранскрипционном уровне, это согласуется с тем, что они функционируют как эндоцитотиические белки. Более того, Nkx2.5^Cre/+-обусловленная Notch1^fl/fl делеция уменьшает NICD1до~46% от контрольных уровней при western blot, использующем лизаты желудочков на ст. E12.5 (supplementary material Fig. S6C,D), и, по-видимому, оставшиеся Notch1 белки вносят вклад в эндокардиальные и эпикардиальные клетки. Это подтверждает, что Notch1 экспрессируется в кардиомиоцитах на ст.E12.5, принимая во внимание, что Nkx2.5^Cre/+ активен во всех кардиомиоцитах и в очень немногих эндокардиальных клетках желудочков. Это согласуется с предыдущим сообщением, что NICD1 обнаруживается в кардиомиоцитах на ст. E13.5 и позднее (Kratsios et al., 2010). Мы полагаем, что Notch1, который в кардиомиоцитах, активируется с помощью Delta4 (delta-like 4) в эндокардиальных клетках и/или с помощью jagged 1 в кардиомиоцитах, чтобы продуцировать NICD1, который деградируется с помощью NFP-обеспечиваемого эндоцитоза и не выявляется поэтому в кардиомиоцитах контрольных сердец. В кардиомиоцитах сердец MDKO NFP-обеспечиваемая деградация NICD1 устраняется, это приводит к накоплению NICD1 до обнаружимого уровня. Это накопление NICD1 в кардиомиоцитах активирует Notch1-related передачу сигналов, включая ингибирование экспрессии p57, чтобы способствовать пролиферации клеток в миокарде автономным способом у MDKO (Fig. 8A).

NFPs regulate Notch1-independent signaling pathways

NFPs выполняют разнообразные роли в нормальных и болезннеых условиях зависимым от клеточного контекста способом (Gulino et al., 2010). Numb является эндоцитотическим белком (Santolini et al., 2000), а NFPs выполняют свои функции в основном посредством их участия в эндоцитозе и во взаимодействии с др. белками. Белок Numb действует как компонент слипчивых соединений, чтобы регулировать клеточную адгезию и миграцию нейрального эпителия и эпикарда (Rasin et al., 2007; Wang et al., 2009; Wu et al., 2010), регулировать инициацию раковых опухолей путем контроля стабильности p53 (Colaluca et al., 2008) и Gli1 (Di Marcotullio et al., 2006), регулировать спецификацию нейробластов в клетках Drosophila SOP путем ингибирования передачи сигналов Notch (Guo et al., 1996), и регулировать рост аксонов в нервных клетках (Nishimura and Kaibuchi, 2007). Numb также взаимодействует с передачей сигналов Notch и Wnt, чтобы специфицировать гемангиобласты в примитивный эритроидный клон (Cheng et al., 2008). Из всех путей, с помощью которых NFPs взаимодействуют, наиболее изучен путь Notch1. Однако, супрессия Notch1 не устраняет всех дефектов у MDKOs, показывая, что NFPs действуют выше Notch1-независимых сигнальных путей, чтобы регулировать кардиальный морфогенез и дифференцировку кардиальных предшественников.

Для выявления механизмов, с помощью которых вызываются дефекты морфогенеза и дифференцировки предшественников, мы исследовали данные последовательности мРНК. Из 814 генов, с нарушенной регуляцией у MDKO, 36.9% кодируют ассоциированные с мембранами белки, 30.4% кодируют гликопротеины и 26.8% кодируют сигнальные пептиды (supplementary material Fig. S7A), показывая, что NFPs участвуют во множественных сигнальных путях, это согласуется с предыдущими находками, что Numb является адапторным белком, участвующим в эндоцитозе многих белков (Santolini et al., 2000; Krieger et al., 2013). В самом деле, возможно, что NFPs регулируют кардиальный морфогенез и дифференцировку предшественников посредством эндоцитоза множественных белков. Анализ трансгенных линий, экспрессирующих дефектные по эндоцитозу Numb, мог бы помочь в определении, как NFPs регулируют кардиальный морфогенез и дифференцировку предшественников.