Сердце начинает функционировать на ранних ст. эмбрионального развития, поддерживая эмбриональную и постнатальную жизнь. Регуляция пролиферации кардиомиоцитов (CMs) важна для развития, функции и регенерации сердца.

Регуляция пролиферации CMs необходима для нормального морфогенеза и предопределяет соотв. размер сердца, который необходим для прокачивания соотв. объема крови во время развития. У млекопитающих клеточная пролиферация и гипертрофия CMs увеличивает размер сердца перед и после рождения, соотв., следовательно, регуляция пролиферации CMs важна, по крайней мере, на эмбриональных ст. у млекопитающих. Кроме того, размер при рождении, по-видимому, влияет на размер на последующих ст. Как регулируется пролиферация CMs? Как предопределяется размер сердца? CMs выходят из своего клеточного цикла после рождения. Недавно получены доказательства, что CMs у взрослых млекопитающих могут усиливать свою пролиферацию. Однако соотношение очень низко. Как клетки выходят из клеточного цикла и выход сохраняется в большинстве CMs? Каково значение этого?

Сердца новорожденных мышей и взрослых рыбок данио могут регенерировать после повреждений посредством пролиферации уже существующих CMs (Jopling et al. 2010; Kikuchi et al. 2010; Porrello et al.2011b). Однако взрослые млекопитающие не способны к кардиальной регенерации из-за ареста клеточного цикла в большинстве CMs. Что детерминирует различия между видами?

В целом клеточная пролиферация и дифференцировка обнаруживают обратные взаимоотношения во время развития. Существуют ли такие взаимоотношения для CMs? Если да, то как это взаимоотношение регулируется?

The cell cycle system

Клеточный цикл, с помощью которого клетки делятся, состоит из 4-х фаз (Fig. 1): S-фазы, когда происходит репликация ДНК; M-фазы, когда происходят кариокинез и цитокинез; и G1 и G2-фазы, когда клетки подготавливаются к последующим фазам, напр., синтез РНК и белка, и проверка клеточного статуса для вступления в последующую фазу. Клеточный цикл тонко регулируется с помощью аппарата клеточного цикла.

Figure 1. The cell cycle system.

Сутью аппарата (machinery) клеточного цикла являются циклины и cyclin-dependent kinases (CDKs) (Fig. 1). CDKs активируются с помощью формирования комплексов с циклинами, вследствие чего они фосфорилируют специфичные для комплекса субстраты. Последовательная активация CDKs продвигает клеточный цикл. У млекопитающих комплексы представлены cyclin D-CDK4/6 (G1-phase), cyclin E-CDK2 (G1/S-phase), cyclin A-CDK2/1 (S/G2-phase) и cyclin B-CDK1 (M-phase). Белковый синтез и деградация этих основных циклинов и определяет время активации партнерских CDKs. Кроме того, активности CDK регулируются с помощью ингибиторов CDK; семейства INK4 (p15, p16, p18 и p19) и семейства Cip/Kip family (p21, p27 и p57).

Proliferation pattern of CMs during development and adult stages

Паттерны пролиферации CMs были изучены на разных животных. У млекопитающих эти паттерны описаны у мышей и крыс (Rumyantsev 1977). Здесь мы рассмотрим паттерн у мыши (Fig. 2).

Figure 2. Proliferation pattern of cardiomyocytes (CMs) during cardiac development and questions.

Уровни пролиферации мышиных CMs высокие во время раннего эмбриогенеза и начинают снижаться приблизительно на день эмбриогенеза 10-12 (E10-12) (Erokhina 1968; Toyoda et al. 2003). Большинство CMs вступает в митозы без цитокинеза, давая двуядерные CMs во время первых двух недель постнатального развития (Soonpaa et al. 1996), вследствие этого CMs выходят из клеточного цикла.

Экспрессия, комплексов и активность основных циклинов и CDKs изменяются синхронно во время эмбриональной и постнатальных стадий (Ikenishi et al. 2012). Эти уровни снижаются от середины беременности к рождению и затем обнаруживается одна волна, пик которой приходится приблизительно на 5 день постнатального развития (P5). Анализ этого и паттерна распределения клеточных циклов в моно- и двуядерных CMs показал, что волна экспрессии или активности регулятора клеточного цикла во время постнатальных стадий в основном дает двуядерные клетки из одноядерных клеток (Ikenishi et al. 2012).

Эти исследования поставили следующие вопросы о механизмах характера пролиферации CM (Fig. 2). (i) Как CMs замедляют свою пролиферацию? (ii) как CMs выходят из своего клеточного цикла? (iii) как CMs поддерживают свой выход из клеточного цикла? и (iv) сколько CMs могут пролиферировать на взрослой стадии? Ответы на эти вопросы важны для создания и поддержания паттерна пролиферации CM. Кроме того, возникают др. интересные вопросы: (v) какое биологическое значение выхода из клеточного цикла у большинства CMs? и (vi) как продуцируются двуядерные CMs и каково их биологическое значение?

How do CMs slow down their proliferation?

Клетки д. постепенно замедлять свою пролиферацию прежде чем арестовать или выйти из клеточного цикла. Уровень пролиферации мышиных CMs начинает снижаться приблизительно на ст. E10-12 (Erokhina 1968; Toyoda et al. 2003). Что запускает замедление? Мутантные мыши jumonji (jarid2) обнаруживают гиперпролиферацию и избыточную экспрессию cyclin D1 в CMs на ст. E10 (Takeuchi et al. 1999; Toyoda et al. 2003), а молекулярный и генетический анализ показал, что jumonji прерывает пролиферацию CM путем репрессии экспрессии cyclin D1 (Toyoda et al. 2003). Ген jumonji первоначально был идентифицирован с помощью стратегии ловушек генов у мыши (Takeuchi et al. 1995), он выполняет важные роли в развитии многих тканей (Takeuchi et al. 2006). Белок Jumonji имеет несколько законсервированных доменов. Домен jmjC катализирует деметилирование гистона и большинство гистоновых деметилаз было идентифицировано в семействе белков jmjC (Takeuchi et al. 2006). Интересно, что Jumonji не обладает активностью гистоновой деметилазы; однако, Jumonji обнаруживает транскрипционную репрессорную активность путем рекрутирования гистоновых H3-K9 метилтрансфераз, G9a и GLP, на промотор cyclin D1 (Shirato et al. 2009). Мы также показали, что путь Jumonji-cyclin D1 необходим для точной координации выхода из клеточного цикла и миграции вовремя нейрогенеза в заднем мозге мыши (Takahashiet al. 2007).

Интересно, что мутантные мыши Tsc1 и Tsc2, чьи генные продукты являются факторами пути TOR, обнаруживают сходные фенотипы с таковыми для CMs мутантных jumonji мышей (Kobayashiet al. 1999, 2001), подтверждая, что Tsc1/2 и TOR путь действуют как триггеры. Интересно и важно знать, что детерминирует время, когда работать jumonji и Tsc1/2 и каковое взаимодействие между этими молекулами.

How do CMs exit their cell cycle?

Некоторые системы нуждаются в аресте клеточного цикла или выходе из него. Почти все CMs мыши входят из клеточного цикла на ст. P5-14. Что заставляет выходить из клеточного цикла? Анализ экспрессии активности комплексов cyclin E-CDK2 и cyclin A-CDK1/2 показывает, что активности начинают ингибироваться со ст. P5 перед тем, как уровни белка начинают снижаться на ст. P10 (Ikenishi et al. 2012), подтверждая, что факторы, такие как CKIs подавляют активность CDK и вносят вклад с выход из клеточного цикла. Фактически экспрессия двух CKIs, p21^Cip1 и p27^Kip1, достигает пика приблизительно на ст. P5, когда активности cyclin E- и cyclin A-CDK начинают снижаться. Кроме того, постнатальные CMs у нокаутных по p21^Cip1 и ^p27Kip1 мышей обнаруживают неспособность к выходу из клеточного цикла в фазе G1 (Taneet al. 2014).

Транскрипционный фактор, Meis 1, также регулирует выход из клеточного цикла CMs (Mahmoud et al. 2013). Пролиферация CMs уMeis 1 KO мышей продолжается на постнатальных стадиях. Интересно, что Meis 1 активирует экспрессию CKIs, p15 ^ink4b, p16 ^ink4a и p21^Cip1 (Mahmoud et al. 2013). Вместе с результатами по p21^Cip1 KO мышам эти данные подтверждают, что Meis 1 запускает выход из клеточного цикла путем активации транскрипции p21Cip1. Потребность в p15^ink4b и p16 ^ink4a для выхода из клеточного цикла CMs, детальные молекулярные механизмы действия Meis1 на p21^Cip1 и вышестоящие системы для p27^Kip1 всё ещё неизвестны.

Недавно описана регуляция выхода из клеточного цикла с помощью микроРНК. Напр., miR-195, как полагают, подавляет пролиферацию путем репрессии генов, таких как Chek1 (Porrello et al. 2011a). Eulalio et al. осуществили функциональный скрининг микроРНК человека, которые способствуют пролиферации. Они показали, что 40 микроРНК способствуют пролиферации CM новорожденных мышей. Интересно, что miR-590 и miR-199a способствуют также повторному вступлению в клеточный цикл CMs у взрослых (Eulalio et al. 2012). Эти микроРНК могут быть использованы в качестве лекарств для лечения потери CM, поскольку они являются активаторами, но не репрессорами пролиферации CM. С др. стороны, вклад этих микроРНК в выход из клеточного цикла CMs интересен. Паттерны экспрессии этих микроРНК во время развития и анализ потери функции может помочь понять их вклад.

How do CMs maintain their cell cycle exit?

Что используют клетки для поддержания выхода из клеточного цикла? У мышей все уровни экспрессии и активации основных cyclin-CDK комплексов становятся чрезвычайно низкими или не определяются после ст. P14, и эти уровни сохраняются в течение всей жизни (Ikenishi et al. 2012). Клеточный цикл почти всех CMs арестовывается в G1-фазе (Erokhina 1968; Ikenishi et al. 2012). Эти результаты подтверждают возможность, что подавление экспрессии в G1 cyclin-CDKs запускает подавление экспрессии всех остальных главных cyclin-CDKs, и всё это подавление поддерживается в течение жизни с помощью неизвестных механизмов. Поддержание подавления, скорее всего, необходимо для поддержания выхода из клеточного цикла CMs. Фактически экспрессия только одного G1 циклина была обнаружена, чтобы вступать в клеточный цикл у большинства дифференцированных CMs взрослых (Tane et al., unpubl. data).

Если это предположение корректно, то что запускает подавление? Вероятно, p21^Cip1, p27^Kip1 и Meis 1, как описано в (2), близко родственны, как вышестоящие сигналы; однако механизмы неизвестны. Интересно, также как поддерживается подавление. Поскольку CMs взрослых могут пролиферировать у млекопитающих в очень ограниченном количестве (Soonpaa & Field 1998), то подавление должно поддерживаться строго. Эпигенетическая регуляция может быть одним из механизмов. Её участие может быть выявлено с помощью анализа гистоновых модификаций и метилирования ДНК.

Интересно, что neuregulin индуцирует повторное вступление в клеточный цикл в основном в одноядерных CMs у взрослых мышей (Bersell et al. 2009), подтверждая, что подавление экспрессии основных cyclin-CDK может быть устранено в части одноядерных CMs путем активации пути neuregulin-ErbB4. Являются ли эти CMs главными или второстепенными, очень важно.

How many CMs can proliferate in adult stages?

Пролиферация CMs у взрослых млекопитающих описана давно; однако точный процент остается спорным. Soonpaa et al. рассмотрели большое количество данных и показали, что процент CMs с синтезом ДНК был равным 0-.0006% и 0-0.0083% в нормальных и поврежденных CMs взрослых мышей, соотв. (Soonpaa & Field 1998). Определение процента, скорее всего, зависит от методов и токсических эффектов радиомеченного тимидина и halogenated аналогов нуклеотидов. Senyo et al. использовали мечение стабильным изотопом и мульти-изотопную imaging масс-спектрометрию, чтобы подсчитать процент и сообщили о 0.007-0.015% и 0.06% в день у нормальных и поврежденных взрослых мышей, соотв. (Senyo et al. 2013). Даже принимая во внимание ежегодную величину, т.e. 5.5% (=0.015 х 365), эти CMs составляют небольшое количество, а большинство CMs не может вступать в клеточный цикл.

Пролиферация CMs у взрослых млекопитающих описана также у многих генетически измененных мышей (Ahuja et al. 2007). Процент также ограничен (самое большое 1% в нормальных взрослых CMs, у c-Myc трансгенных мышей, (Xiao et al. 2001)). Кроме того, генетические манипуляции осуществлялись с оплодотворенных яиц почти во всех исследованиях. Следовательно, эффекты во время эмбриогенеза д. учитываться. Напр., возможно, что экспрессия или нокаут генов мишеней изменит характеристики CMs, такие как поддержание незрелого состояния и CMs смогут пролиферировать. Следовательно, необходим анализ условных состояний, позволяющий генетические манипуляции только на взрослых, дифференцированных CMs.

Др. важный вопрос, могут ли вступающие в клеточный цикл взрослые CMs делиться в нормальных и генетически изменённых мышах. Недавние исследования сообщили, что небольшие количества CMs могут завершать митоз на постнатальной и взрослой стадии (Bersellet al. 2009; Eulalio et al. 2012; Mollova et al. 2013; Senyo et al. 2013). Оценка кариокинеза и цитокинеза в некоторых исследованиях в основном зависела от иммуноокрашивания с помощью pH3-S10 или Aurora B в срезах сердца. Однако невозможно с определенностью установить завершенность кариокинеза или цитокинеза, базируясь только на этом окрашивании. Оценка с помощью более надежных методов, таких как пульсовое мечение с обнаружимыми нуклеотидами и измерением ДНК на ядро, необходима, чтобы получить точный ответ.

What is the biological significance of the cell cycle exit in many CMs?

Как было описано выше, пролиферация очень редка в CMs взрослых мышей. Хотя процент слегка увеличивается у поврежденных мышей, но он всё ещё достаточно низкий (see [4]). Даже если CMs могут вступать в клеточный цикл, только чрезвычайно небольшие количества CMs могут делиться. Эти факты указывают на то, что выход из клеточного цикла строго поддерживается в большинстве CMs взрослых.

Предполагается, что выход из клеточного цикла необходим для гомеостаза кардиальной функции у млекопитающих. Напр., разборка миофибрилл, наблюдается у эмбриональных и постнатальных CMs млекопитающих во время митозов (Rumyantsev 1977; Ahujaet al. 2004). Возможно, что деконструкция многих CMs вызывает сердечную недостаточность у взрослых млекопитающих. Эта возможность должна быть исследована и оценена с учетом всех ингибирующих систем. Если это имеет место, то тщательные манипуляции необходимы для устранения выхода при регенеративной терапии.

How are binucleated CMs produced and what is the biological significance?

Образование двуядерных постнатальных CMs наблюдается, по крайней мере, у некоторых млекопитающих. Финальный процент составляет 80-90%, 32% и 25-57% у мышей/крыс, свиней и человека, соотв. (Grabner & Pfitzer 1974; Schmid & Pfitzer 1985; Olivetti et al. 1996; Soonpaa et al. 1996; Ikenishi et al. 2012). Двуядерность возникает в результате митозов без цитокинеза. Как блокируется цитогенез на постнатальной, но не эмбриональной стадии? Интересно, что CMs крыс в культуре обнаруживают контрактильные кольца (Li et al. 1997), указывающие на раннюю ступень, предшествующую цитокинезу, тогда как более поздние стадии блокируются. Сообщалось, что anillin, регулятор борозды деления, не локализуется в области посреди тела клетки и что p38 MAP киназа ингибирует его локализацию (Engel et al. 2006). Более того, ингибирование p38 CMs взрослых способствует цитокинезу (Engel et al. 2005). Этот результат не согласуется с давно существующей идеей, что обильные и зрелые миофибриллы ингибируют цитокинез в окончательно дифференцированных CMs и что двуядерные CMs не могут делиться. Недавно было установлено, что двуядерные гепатоциты могут делиться в две одноядерные клетки во время регенерации печени посредством конденсации хромосом переде митозом (Miyaoka et al. 2012). Этот результат подтверждает также возможность, что взрослые двуядерные CMs делиться.

Каково биологическое значение двуядерности CM? Имеются ли некоторые функциональные отличия между одноядерными и двуядерными CMs? Или это скорее результат неспособности к цитокинезу? Хотя мы не имеем удовлетворительных ответов, предполагается, что удвоенные транскрипты из двух ядер имеют преимущества в поддержании функции в гипертрофических CMs. Если мы установим механизмы двуядерности, то станет возможным манипулирование в процентом двуядерности и стане возможным понять значение двуядерности и функциональных отличий.

CM proliferation and size control of the heart

Размер сердца контролируется в основном пролиферацией CMs во время эмбриональной стадии и с помощью гипертрофии CMs после выхода из клеточного цикла. Сердце важный насос и необходим соотв. размер на каждой эмбриональной стадии. Кроме того, размер сердца при рождении влияет на размер после рождения. Следовательно, регуляция пролиферации CM во время эмбриональных ст. важна не только для определения соотв. размера сердца, но также и функции сердца. Что же регулирует пролиферацию?

Исходя из функции пути jumonji-cyclin D1 и Tsc1/2 (TOR пути), эти белки, по-видимому, регулируют размер сердца. Кроме того, путь hippo контролирует размер сердца у эмбрионов путем репрессии пролиферации CM (Heallen et al. 2011). Путь hippo регулирует размер ткани у многих животных, контролируя клеточную пролиферацию и апоптоз (Pan 2010). Путь является киназным каскадом, включающим опухолевой супрессор Hippo (Mst1/2 у млекопитающих), Wts (Lats1/2 у млекопитающих) и Yki (Yap/Taz у млекопитающих). Хотя усиление пролиферации наблюдается в CMs jumonji и Tsc1/2 KO мышей, которые погибают приблизительно на ст. E10-11 (Kobayashi et al. 1999, 2001; Takeuchi et al. 1999; Toyodaet al. 2003), KO мыши пути hippo доживают вплоть до постнатальных стадий (Heallenet al. 2011), подтверждая, что время и/или степень различны в этих системах. Интересно, что путь hippo регулирует пролиферации CM с помощью ингибирования передачи сигналов Wnt (Heallen et al. 2011). Важно понять др. критические пути, происходит ли взаимодействие между hippo, jumonji-cyclin D1, TOR и др. путями и как эти пути регулируются для создания соотв. размера сердца.

Cardiomyocytes proliferation and cardiac regeneration

Кардиомиоциты s существенны для функционирования сердца. Если большинство CMs теряется, и эта потеря не восстанавливается, то возникает сердечная недостаточность и гибель. Новорожденные мыши и взрослые рыбки данио способны восстанавливать потерю CMs после повреждения за счет пролиферации CM и тем самым регенерировать свои сердца (Jopling et al. 2010; Kikuchi et al. 2010; Porrello et al. 2011b). Напротив, взрослые млекопитающих неспособны к существенной регенерации сердца, поскольку большинство CMs неспособно повторно вступать в клеточный цикл. Эти факты показывают, что механизмы выхода из клеточного цикла (см. "How do CM maintain their cell cycle exit?") строго поддерживаются даже после повреждения.

Кардиомиоциты могут пролиферировать у наворожённых мышей и взрослых рыбок данио. Кроме того, CMs взрослых тритонов также могут пролиферировать и сердце может регенерировать (Oberpriller & Oberpriller 1971, 1974), хотя регенерируют ли тритоны свои сердца посредством пролиферации CM неизвестно. Зато CM взрослых млекопитающих не могут пролиферировать снова. Что определяет эти различия между видами? Ответ может быть получен путем оценки различий в механизмах поддержания выхода из клеточного цикла у этих видов. Напр., что определяет различия ы цитокинезе? Эти исследования важны для прояснения механизмов не только регенерации сердца у новорожденных мышей, взрослых рыбок данио и тритонов, но и также строго поддержания выхода из клеточного цикла CMs взрослых млекопитающих.

Cardiomyocytes proliferation and differentiation

В целом клеточная пролиферация и дифференцировка обнаруживают обратные взаимоотношения и регулируются скоординированным способом во время развития. Эмбриональные CMs д. поддерживать эмбриональную жизнь с помощью функциональной дифференцировки, такой как сердцебиения и активно пролиферируют, чтобы увеличить размер сердца. Следовательно, и пролиферация и функциональная дифференцировка прогрессируют одновременно и необходимы для эмбрионального развития. Ситуация отличная от многих др. типов клеток, таких как клетки скелетных мышц или клетки нейронов, которые, как известно, дифференцируются функционально после ареста клеточного цикла. Связаны ли пролиферация и дифференцировка др. с др.? Ингибируют ли они один др. в эмбриональных CMs, как отличаются пролиферация и дифференцировка?

Пролиферативная активность ингибирует дифференцировку в эмбриональных CMs (Nakajima et al. 2011). Усиленная экспрессия cyclin D1 в CMs jumonji мутантных мышей или трансгенных мышей с пониженной экспрессией белка GATA4 ингибировала дифференцировку CMs. CDK4, которая активируется с помощью cyclin D1, фосфорилирует непосредственно GATA4, и деградация GATA4 усиливается. GATA4 одним из критических транскрипционных факторов для дифференцировки CM (Harvey 1999; Olson 2006). Эти результаты подтверждают, что CDK4, активируемая с помощью cyclin D1, ингибирует дифференцировку CMs путем деградации GATA4, и что инициация экспрессии jumonji дает волю ингибированию посредством репрессии экспрессии D1 и делает возможной прогрессию дифференцировки, а также репрессию пролиферации. Т.о., путь jumonji-cyclin D1 координированно регулирует пролиферацию и дифференцировку CMs (Nakajima et al. 2011) (Fig. 3).

Figure 3. Coordinated regulation of differentiation and proliferation of embryonic cardiomyocytes (CMs) by a jumonji-cyclin D1 pathway.

Интересно, но неизвестно, ингибирует ли пролиферация CM дифференцировку с помощью др. механизмов и ингибирует ли дифференцировка CM пролиферацию.

Regulation of cardiomyocyte proliferation during development and regeneration Takashi Takeuchi Development, Growth & Differentiation Volume 56, Issue 5 June 2014 Pages 402-409 Review Article

Regulation of cardiomyocyte proliferation during development and regeneration
Takashi Takeuchi
Development, Growth & Differentiation Volume 56, Issue 5 June 2014 Pages 402-409 Review Article