Критической ступенью кардиогенеза является образование и экспансия клона вентрикулярных миоцитов, необходимых для нормальной сократительной функции сердца. Находка, что пролиферация FHF и SHF ранних вентрикулярных CMs из эмбрионов и соотв. ESC линий контролируется с помощью пути передачи сигналов β-catenin открывает механистический способ контроля кардиогенеза in vitro и in vivo до размера сердца взрослого. Мы показали, что в развивающемся миокарде β-catenin преимущественно активен в компактном миокарде и что активированный белок экспрессируется в большинстве пролиферирующихся кардиомиоцитов. Более того, потеря функции β-catenin в сердце ведет к устранению пролиферации миоцитов. Напротив, активация передачи сигналов β-catenin канонического Wnt управляет пролиферацией ранних вентрикулярных CMs. Работы ряда лаб. показали, что во время развития млекопитающих компактный миокард обладает достоверно более высокой скоростью пролиферации кардиомиоцитов. Наше исследование предоставило механистическое объяснение, как это достигается. В частности, мы показали, что различающаяся пролиферация в разных субкомпартментах сердца нуждается в дифференциальной активации передачи сигналов β-catenin. Специфичная для сердца избыточная экспрессия или делеция β-catenin, так, что она в одинаковой степени экспрессируется и в компактном и трабекулярном миокарде, устраняет обычно наблюдаемые отличия в скорости их пролиферации. Это открывает возможность, что индуктивные сигналы от эпикарда или репрессивные сигналы от эндокарда могут контролировать дифференциальную активацию β-catenin и тем самым управлять наблюдаемыми отличиями в скорости пролиферации в компактном и трабекулярном миокарде.

Организованная сборка различных типов клеток является фундаментальной для органогенеза и регенерации органов. Полная регенерация сложных органов, таких как взрослое сердце, по-видимому, сильно ограничена низшими позвоночных, такими как рыбки данио (Jopling et al., 2010; Kikuchi et al., 2010; Poss et al., 2002). У млекопитающих сердце новорожденных, как было установлено, регенерирует при повреждениях верхушки, но этот потенциал исчезает вскоре после рождения (Porrello et al., 2011), и ежегодный оборот кардиальных миоцитов снижается до менее чем 2-4% у взрослых (Bergmann et al., 2009; Porrello et al., 2011; Senyo et al., 2013). Наше недостаточное понимание молекулярных механизмов, управляющих экспансией кардиомиоцитов во время кардиогенеза ограничивает нашу способность развивать новые стратегии для регенеративной сердечно-сосудистой медицины. В этом отношении результаты, описанные здесь, предоставляют важный успех в определении путей, способствующих пролиферации в ранних, происходящих из FHF и SHF вентрикулярных CMs.

Ключевым соображением является то, что увеличенные в количестве CMs сохраняют свой потенциал далее дифференцироваться в функциональные CMs без существенного эпигенетического и фенотипического дрейфа (drift). Мы показали, что ранние FHF и SHF вентрикулярные CMs, происходящие из мышиных и человеческих источников ES и iPSC, обладают одинаковой чувствительностью к передаче сигналов Wnt/β-catenin. Количественный анализ генной экспрессии для широко распространенных кардиальных генов показал, что увеличенные в количестве ранние вентрикулярные CMs находятся в промежуточном состоянии дифференцировки между только что изолированными и их дифференцированным потомством. Устранение Gsk3 ингибирования позволяет увеличенным в числе CMs далее дифференцироваться в функциональные CMs. Активная принудительная стабилизация axinс помощью IWR ведет к дальнейшей усиленной дифференцировке увеличившихся CMs. Удивительно, увеличившиеся кардиомиоциты FHF и SHF располагаются в функциональной ткани миокарда со сходным потенциалом по отношению к их не увеличенным аналогам. Т.о., увеличившиеся в числе кардиальные миоциты сохраняют потенциальные свойства, паттерн экспрессии кардиальных генов, организацию белков и расположения клеток их не увеличенных нативных CMs. Это подчеркивает потенциал управляемой Gsk3 ингибированием экспансии ранних CMs давать большие количества функциональных кардиомиоцитов, как это необходимо для химического скрининга и будущих терапевтических стратегий.

Хотя мы обнаружили увеличение пролиферации в вентрикулярном миокарде неонатальных мышей с избыточностью функции β-catenin, этот эффект был ограниченным. На ст. P30 мы более не обнаруживали каких-либо статистически достоверных отличий в скорости пролиферации миокарда. Кроме того, мы наблюдали увеличение размера желудочков у мышей с избыточной функцией по сравнению с контролем из того же помёта, при этом количество ядер на область оставалось одинаковым. Однако мы не исключаем более раннего прекращения клеточных циклов или повышенного апоптоза в сердцах животных с избыточной функцией по сравнению с контролем. Во время перехода от неонатального ко взрослому периоду происходит ряд клеточных изменений, которые позволяют неонатальным CMs созревать в свои взрослые копии. Итак, эти изменения ведут к тому, что кардиальные миоциты больше неспособны пролиферировать в ответ на активацию передачи сигналов β-catenin. По-существу, активация недавно открытого пути Hippo/Yap1/Tead, который контролирует размер сердца, должна подавлять постнатальные, обусловленные β-catenin, клеточные циклы CM (Heallen et al., 2011; von Gise et al., 2012). Более того, TGF-β/BMP регуляторные пути, как известно, влияющие на рост и дифференцировку, влияют на раннюю кардиальную спецификацию и дифференцировку (Klaus et al., 2012; Wang et al., 2010), и могут вносить вклад в молекулярные изменения, вызывающие созревание сердца и/или перекрываемость Wnt сигналов.

Мы исследовали роль пути Wnt/β-catenin в контроле экспансии и дифференцировки ранних CMs из разных источников посредством некоторых небольших молекулярных ингибиторов Gsk3. Нарушение обусловленной Gsk3 деградации β-catenin ведет к активации β-catenin и его транслокации в ядро, что впоследствии вызывает Lef1/Tcf-обусловленную активацию генов мишеней для Wnt (Jho et al., 2002; Lustig et al., 2002). Хотя Gsk3 описана как часть канонического Wnt каскада, она также образует краеугольный камень для молекулярного перекрестного общения. Сигнальные пути, контролируемые PI3K/Akt и Raf/Mek/Erk, косвенно ингибируют Gsk3 на цитоплазматическом уровне и тем самым могут действовать синергично с активрованной передачей сигналов Wnt (Shiojima and Walsh, 2006; Singh et al., 2012). Мы продемонстрировали, что передача сигналов Wnt может способствовать пролиферации ранних CM во время развития, но наши результаты не исключают возможности, что передача сигналов Akt также может сходиться с путем передачи сигналов β-catenin.

Прогрессирующая сердечная недостаточность является главной нерешенной клинической проблемой, которая возникает при потере жизнеспособных и/или полностью функциональных кардиальных мышечных клеток (Jessup and Brozena, 2003). Сегодня ряд клинических испытаний был разработан для усиления функции кардиальных мышц посредством трансплантаций костного мозга или мезенхимных стволовых клеток. Кстати, хотя и были обнадеживающие ранние указания на небольшие терапевтические эффекты, не получено доказательств действительной регенерации мышечной ткани сердца (Bolli et al., 2011; Menasch?, 2008;Pouly et al., 2008), это подчеркивает на необходимость новых подходов. Центральной проблемой для клеточной терапии является выделение и увеличение достаточных количеств кардиальных миоцитов, необходимых для тканевой регенерации. Кроме того, критическим является то, чтобы увеличившиеся в числе клетки сохраняли сой потенциал дифференцировки, а также свою способность к самоорганизации в функциональную миокардиальную ткань. Здесь мы продемонстрировали, что ранние кардиальные миоциты из возобновляемого клеточного источника могут мощно увеличиваться, сохраняя свою способность дифференцироваться в функциональную миокардиальную ткань.