В развитии сердца участвуют диффундирующие факторы, такие как Wnts, activin/nodal, BMPs и Noggin, которые влияют на становление градиентов клеточных судеб у развивающихся эмбрионов. Сердце, кровь и сосудистая сеть скоординировано специфицируются из общего источника: латеральной пластинки мезодермы (Kattman et al., 2006). Многочисленные доказательства подтверждают, что сохранение передачи сигналов Wnt/β-catenin вместе с др. факторами, такими как vascular endothelial growth factor (VEGF), последовательно направляют мезодерму к выбору судьбы гемангиобластов, которые дают ростки крови и эндотелий задней латеральной пластинки (Wang et al., 2007). Напротив, подавление передачи сигналов Wnt/β-catenin необходимо, чтобы направлять мезодерму к выбору сердечно-сосудистых клонов, которые формируют билатеральные поля сердца в вентро-латеральной мезодерме (Ueno et al., 2007; Paige et al., 2010).
После гаструляции прекардиальная мезодерма дает зачаток сердца в доменах, происходящих билатерально водль передней вентральной латеральной части мезодермы. Эти популяции могут давать все три клона сердца, включая кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и гладкомышечные клетки. Молекулы, такие как Nkx2.5, Mef2c, и GATA факторы сходятся, чтобы специфицировать развитие сердца, тогда как ограниченные клонами транскрипционные факторы, такие как Tbx5 (первое поле сердца) и Isl1 (второе поле сердца) обеспечивают более поздние стадии спецификации кардиальных подтипов (Yutzey and Benson, 2003; Brown et al., 2004; Qyang et al., 2007).
Несколько генов было идентифицировано в качестве ключевых медиаторов детерминации клонов гемато-эндотелиальных в противовес кардиальным, включая ETS семейство транскрипционных факторов (напр. ER71; также известный как ETV2) (Liu et al., 2012),и хорошо известный главный транскрипционный фактор для развития крови и эндотелия SCL (TAL1) (Gering et al., 1998). Недавняя работа Van Handel et al., напр., показала, что отсутствие SCL приводит к развитию эктопического сердца, обеспечиваемому, по крайней мере, частично увеличением экспрессии канонических ингибиторов Wnt/β-catenin (Van Handel et al., 2012). Их данные показали, что экспрессия SCL не только закладывает гемогенный и эндотелиальный клоны, но и также одновременно необходимы, чтoбы супрессировать кардиогенный потенциал этих клеток.
Хотя вполне возможно, что пространственный паттерн прекардиогенных клеток может быть специфицирован по большей части с помощью перекрывающихся паттернов растворимых градиентов из агонистов или антагонистов, мы удивились бы, если клеточно-автономные регуляторы пути Wnt/β-catenin могут осуществлять тонкий контроль над пространственным доменом кардиогенных клеток. Эта идея имела прецедент, т.к. другими было показано, что временные, пространственные или зависимые от типа клеток регуляторы Wnt/β-catenin активны в эмбриональном развитии (Martin and Kimelman, 2012). Поэтому мы искали клеточно-автономные регуляторы этого пути, надеясь идентифицировать новые контекст-зависимые регуляторы передачи сигналов Wnt/β-catenin, которые бы участвовали в кардиогенезе.
Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека, как было установлено, воспроизводит
in vivo развитие сердца (Murry and Keller, 2008), а недавняя работа нашей группы выявила эпигенетические сигнатуры для новых регуляторов этого процесса (Paige et al., 2012). Параллельная работа также предоставила геномный транскрипционный и эпигенетический анализ эмбриональных стволовых клеток мышей (ESC) в кардиальной дифференцировке (Wamstad et al., 2012). Исследования генетических и эпигенетических изменений при развитии сердца в нашей лаб. выявили новый негативный регулятор передачи сигналов Wnt/β-catenin, обозначенный как transmembrane protein 88 (TMEM88), который сильно экспрессируется во время спецификации клеток сердечно-сосудистых предшественников. Помимо известной его роли как негативного регулятора передачи сигналов Wnt (Lee et al., 2010), сегодня мало известно о биологической функции TMEM88 в развитии или физиологии у взрослых. Путем исследования hESCs
in vitro d δ и в развитии рабок данио
in vivo, мы показали, что TMEM88 необходим для спецификации кардиомиоцитов во время ранних стадий развития сердца.
DISCUSSION
Используя функциональные подходы in vitro и in vivo, данное исследование показало, что TMEM88 необходим для развития кардиомиоцитов из мультиклональных клеток сердечно-сосудистых предшественников. Предыдущее исследование Lee et al. показало, что TMEM88 является негативным регулятором передачи сигналов Wnt/β-catenin (Lee et al., 2010), и мы установили повышенную активность β-catenin после нокдауна TMEM88 KD нашей системе дифференцировки hESC. Анализ массивов и эпигенетический анализ TMEM88 показал, что этот ген индуцируется на высоком уровне (~ в 7500 раз) во время перехода от мезодермы к CVP и обладает хроматиновой характеристикой генов, участвующих в выборе клеточных судеб. Во время развития сердца у рыбок данио tmem88a маркирует билатеральные поля сердца в вентро-латеральной мезодерме. Нокдаун TMEM88 блокирует развитие CVP in vitro, по крайней мере, частично из-за усиления передачи сигналов Wnt/β-catenin. Более того, в отсутствие TMEM88, многие клетки приобретают функциональный эндотелиальный фенотип in vitro. В целом эти данные подтверждают, что TMEM88 обеспечивает выбор клеточных судеб в прекардиальной мезодерме, это предопределяет начало спецификации кардиомиоцитов посредством ингибирования передачи сигналов Wnt.
В параллельном исследовании с использованием генетического скрининга для идентификации генов, подавляемых после истощения Gata5 и Gata6 у рыбок данио, Novikov and Evans (Novikov and Evans, 2013) также идентифицировали Tmem88 в качестве ключевого регулятора в развитии сердца. Используя трансгенный репортер у рыб на стадии 51 hpf, они показали, что общее количество атриальных и вентрикулярных кардиомиоцитов существенно снижено у Tmem88 morpholino-обработанных рыбок данио по сравнению с контролем. Неспособность генерировать достаточные количества кардиомиоцитов в конечном итоге приводила к морфологическим изменениям, таким как дефекты петлеобразования in vivo.
В современных исследованиях, TMEM88 идентифицируется как белок, необходимый для развития клеток сердечно-сосудистых предшественников и согласуется с моделью окружающих белков, которые обеспечивают спецификацию клеточных судеб. Ранее мы идентифицировали (Paige et al., 2012) сигнатуру хроматина и генной экспрессии, которые идентифицируют гены, участвующие в выборе клеточных судеб, которая особенно подходит для тех генов, которые не подходят под парадигму транскрипционных факторов, обеспечивающих ключевые переходы клеточных судеб. TMEM88, трансмембранный белок, обладает такой сигнатурой, поскольку локус обнаруживает репрессивный хроматин (H3K27me3) во время стадий, на которых экспрессия гена д. быть вредоносной утвердить или выбрать клеточную судьбу, напр., путем блокирования образования мезодермы. Во время спецификации CVP, репрессивный хроматин уменьшается, а эухроматиновая H3K4me3 метка увеличивается, вызывая строгую активацию гена в точности в период, когда его функция обеспечивает ограничение сердечно-сосудистым клоном.
Lee et al. показали, что C-терминальный PDZ связывающий мотив в TMEM88 связывает Disheveled (Dvl) (Lee et al., 2010). В отсутствие TMEM88, связывание Wnt лигандов с рецепторами семейства Frizzled приводит к рекрутированию axin с помощью Dvl на мембрану. Это приводит к диссоциации деструктивного комплекса и позволяет β-catenin транслоцироваться в ядро и активировать гены мишени для Wnt. Если Dvl конкурентно рекрутируется с помощью TMEM88, то axin не транслоцируется на мембрану и каноническая передача сигналов Wnt блокируется. В согласии с этой гипотезой, наш функциональный подход показал, что нокдаун TMEM88 повышает активность Wnt пути, и кроме того экзогенный Wnt ингибитор XAV-939 частично восстанавливает кардиальную дифференцировку. Novikov and Evans (Novikov and Evans, 2013) акже установили, что повышенная активация Wnt усиливает дефекты кардиального развития у TMEM88 morpholino-обработанных рыбок данио, а ингибирование передачи сигналов Wnt с помощью хитшока индуцируемого Dkk1 устраняет фенотип нокдауна.
Подавление передачи сигналов Wnt давно известно является критическим для сердечно-сосудистого развития (Ueno et al., 2007), и включение ингибиторов (таких как XAV-939, IWP или KY02111) на пост-гаструляционной фазе протокола для кардиальной дифференцировки ESC стало обычным делом (Willems et al., 2011; Lian et al., 2012; Minami et al., 2012). Несмотря на это специфические механизмы, обеспечивающие эндогенное ингибирование передачи сигналов Wnt полностью не установлены. Мы полагаем, что TMEM88, известный негативный регулятор передачи сигналов Wnt (Lee et al., 2010), является существенным в этом процессе.
Относительно функции, неспособность экспрессировать TMEM88 в прекардиальной мезодерме сдвигает судьбы клеток в направлении развития эндотелия. In vitro данные, представленные здесь, в целом показывают, что нокдаун TMEM88 не оказывает эффект ан экспрессию GATA4 или NKX2.5. Это подтверждает, что TMEM88 функционирует ниже факторов GATA при разделении клонов пре-кардиальной мезодермы, чтобы специфицировать развитие кардиомиоцитов. недавнее исследование показало потребность в Nkx2.5 в эндотелиальном клоне путем картирования судеб (Ma et al., 2008) и функционально для гемогенной способности прекардиальной мезодермы (Ferdous et al., 2009) и для эндокардиальных-эндотелиальных производных (Nakano et al., 2013). Более того, исследования показали, что устойчивая передача сигналов Wnt/β-catenin обеспечивает развитие первичного эритроидного клона (Cheng et al., 2008), который по преимуществу мы наблюдали в нокаутных по TMEM88 клетках при совместной культуре с клетками OP9. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выявить гемогенный потенциал, наблюдаемый при нокдауне TMEM88 возникающий в эндокардиальных-эндотелиальных производных или отражающий роль TMEM88 в модуляции передачи сигналов Wnt/β-catenin во время ранних стадий гемато-эндотелиального развития.
Интересно, что результаты, полученные Gomez et al. (Gomez et al., 2012) , показали, что Tmem88 экспрессируется в задней части мезодермы в развивающейся сосудистой сети у рыбок данио. In situ гибридизация показала, что Tmem88 экспрессируется в развивающейся сосудистой сети. Экспрессия Tmem88 от переднего к заднему полюсу латеральной пластинки мезодермы показывает, что Tmem88 может использоваться на ранних стадиях гемогенного и эндтотелиального развития и потенциально др. мезодермальными производными. Экспрессия Tmem88 чётко увеличивается в развивающейся сосудистой сети на стадиях развития, когда его участие заметно снижается в развитии сердца. Это может указывать на то, что эндотелий в нашей системе hESC отличен от такового у рыбок данио, напр., напоминает эндокардиальный эндотелий больше, чем эндотелий периферических сосудов (Nakano et al., 2013).
так, мы предложили модель TMEM88 в развитии сердца (Fig. 7). Представленные данные указывают на то, что TMEM88 экспрессируется в прекардиальной мезодерме после GATA факторов в NKX2.5 производных, чтобы специфицировать развитие кадиомиоцитов посредством подавления канонической передачи сигналов Wnt/β-catenin. Эндотелиальное развитие происходит в клетках, истощенных по TMEM88, в которых наблюдается устойчивая активность пути Wnt, необходимая для активации программ эндотелиальных генов. Итак, предоставлены доказательства, что TMEM88 обязателен для развития кардиомиоцитов, путем модуляции передачи сигналов Wnt в прекардиальной мезодерме.
