Механизмы

High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation David W. Staudt, Jiandong Liu, Kurt S. Thorn, Nico Stuurman, Michael Liebling and Didier Y. R. Stainier Development. 2014 Feb;141(3):585-93. doi: 10.1242/dev.098632. Epub 2014 Jan 8.
Over the course of development, the vertebrate heart undergoes a series of complex morphogenetic processes that transforms it from a simple myocardial epithelium to the complex 3D structure required for its function. One of these processes leads to the formation of trabeculae to optimize the internal structure of the ventricle for efficient conduction and contraction. Despite the important role of trabeculae in the development and physiology of the heart, little is known about their mechanism of formation. Using 3D time-lapse imaging of beating zebrafish hearts, we observed that the initiation of cardiac trabeculation can be divided into two processes. Before any myocardial cell bodies have entered the trabecular layer, cardiomyocytes extend protrusions that invade luminally along neighboring cell-cell junctions. These protrusions can interact within the trabecular layer to form new cell-cell contacts. Subsequently, cardiomyocytes constrict their abluminal surface, moving their cell bodies into the trabecular layer while elaborating more protrusions. We also examined the formation of these protrusions in trabeculation-deficient animals, including erbb2 mutants, tnnt2a morphants, which lack cardiac contractions and flow, and myh6 morphants, which lack atrial contraction and exhibit reduced flow. We found that, compared with cardiomyocytes in wild-type hearts, those in erbb2 mutants were less likely to form protrusions, those in tnnt2a morphants formed less stable protrusions, and those in myh6 morphants extended fewer protrusions per cell. Thus, through detailed 4D imaging of beating hearts, we have identified novel cellular behaviors underlying cardiac trabeculation Рисунки к статье	Взрослое сердце представлено рядом структур, оптимизированных для прокачивания крови. Чтобы создать столь эффективный насос сердце подвергается сложным морфогенетическим изменениям во время развития, нацеленные на непрерывные сердцебиения и на поддержание кровотока развивающихся животных. Одним из ранних морфогенетических процессов является развитие трабекул в желудочках. Трабекулы желудочков являются гребневидными миокардиальными структурами внутри стенок желудочков, которые образуют сложную сеть в раннем развитии (Sedmera et al., 2000; Stankunas et al., 2008; Liu et al., 2010; Peshkovsky et al., 2011; Staudt and Stainier, 2012). Трабекулы являются критическими для функции сердца, тогда как мутации, устраняющие образование трабекул являются эмбриональными леталями (Gassmann et al., 1995; Lee et al., 1995; Meyer and Birchmeier, 1995; Suri et al., 1996; Morris et al., 1999; Tidcombe et al., 2003; Liu et al., 2010), а у людей с избыточной трабекуляцией возникает сердечная недостаточность (Jenni et al., 1999). Трабекуляции служат для увеличения массы миокарда перед образованием коронарных сосудов и как таковые вносят вклад сократимость желудочков; они также необходимы для образования проводящей системы (Sedmera et al., 2003; Liu et al., 2010). Хотя исследования на мышах начались, чтобы выяснить генетические основы кардиальной трабекуляции, как кардиомиоциты формируют эти важные структуры, поскольку непрерывные сокращения остаются слабо изученными. Наиболее поразительным для этих исследований in vivo оказался тот факт, что сердце постоянно движется и поэтому для получения изображений с высоким разрешением потребовалась новая техника преобразования изображений. Рыбки данио оказались пригодными для получения долговременных изображений развивающегося сердца (Beis and Stainier, 2006), тем самым была найдена идеальная модельная система, позволяющая изучать трабекуляцию сердца на клеточном разрешении в реальном времени. Ряд факторов, как известно, играет роль в трабекуляции. Несколько сигнальных путей, включая пути Angiopoietin/Tie2 (Suri et al., 1996), Semaphorin/Plexin (Toyofuku et al., 2004a; Toyofuku et al., 2004b) и Neuregulin/ErbB2/ErbB4 (Gassmann et al., 1995;Lee et al., 1995; Morris et al., 1999; Tidcombe et al., 2003; Liu et al., 2010) , участвуют в этом процессе. Среди этих регуляторов трабекуляции путь ErbB2 является важным клеточно автономным путем в кардиомиоцитах (Morris et al., 1999; Tidcombe et al., 2003; Liu et al., 2010). Кроме того, механические факторы, такие как кровоток и/или сократимость вносят вклад в трабекуляцию. Личинки рыбок данио с тяжелыми дефектами в сократимости сердца из-за нарушений саркомеров, неспособны формировать трабекулы (Chi et al., 2008). Нарушение кровотока через желудочки из-за нарушений сократимости предсердий, приводят нарушениям трабекуляции (Peshkovsky et al., 2011). Сходным образом, нарушение кровотока в левом желудочке эмбрионального сердца кур после перевязки левого предсердия снижает объем трабекул левого желудочка (Sedmera et al., 1999). Пока неизвестно, как передача сигналов ErbB2 или механические силы регулируют трабекуляцию. Большая часть того, что известно о трабекуляции, получена в результате анализа мутантов, которые могут показать, развиваются или нет трабекулы у эмбрионов. Однако не было исследований того, как кардиомиоциты образуют трабекулы на клеточном уровне. Предыдущие исследования установили расположение кардиомиоцитов в трабекулярном слое спустя 55 ч после оплодотворения (hpf) у рыбок данио (Chi et al., 2008; Liu et al., 2010; Peshkovsky et al., 2011). Кроме того, исследования на мышах и курах показали, что трабекулярные кардиомиоциты клонально родственны кардиомиоцитам наружного, компактного слоя (Mikawa et al., 1992; Meilhac et al., 2003; Meilhac et al., 2004a; Meilhac et al., 2004b), наши данные по отслеживанию клеточных клонов (Liu et al., 2010), так же как и данные от Gupta и Poss (Gupta and Poss, 2012), показали, что трабекуляция осуществляется посредством процесса отслоения скорее, чем асимметричных делений клеток. Как кардиомиоциты отслаиваются от компактного слоя, остается неясным. Здесь, используя комбинацию клонального анализа и получения изображений живых клеток сокращающегося сердца, мы показали, что трабекулы формируются в результате двухступенчатого процесса отслоения. Кардиомиоциты сначала удлиняют выпячивания в просвет через своих соседей и затем постепенно сокращают свою не обращенную к просвету поверхность, чтобы переместить свое тело в трабекулярный слой. Далее мы установили, что мутации, нарушающие трабекуляцию, вызывают разные дефекты в формировании и поведении этих миокардиальных выпячиваний. В сердцах, которые не сокращаются, кардиомиоциты испускают коротко живущие выпячивания, тогда как в сердцах со сниженным кровотоком кардиомиоциты испускают меньше выпячиваний на клетку. Наконец, у erbb2 мутантов, меньше кардиомицитов, испускающих выпячивания. Т.о., мы идентифицировали дифференциально регулируемый клеточный процесс, который вносит вклад в первую ступень трабекуляции. DISCUSSION В данном исследовании мы комбинировали клональный анализ с мощной техникой получения изображений живых клеток, чтобы идентифицировать поведение миокардиальных клеток, ведущее к трабекуляции. Мы идентифицировали ранее неизвестную способность активно сокращающихся кардиомиоцитов выпускать длинные выпячивания в направлении просвета перед тем как транслоцироваться, чтобы сформировать трабекулы. Далее наши данные показали, что кардиомиоциты проникают в трабекулярный слой посредством сокращения стороны, не обращенной к просвету, вытягивая выпячивания к просвету, в который они входят. Поскольку кардиомиоциты сокращают свою abluminal поверхность и вступают в трабекулярный слой, то соседние кардиомиоциты перемещаются в покинутое пространство, чтобы поддержать сцепленный молекулярно компактный слой. Наконец, мы установили, что кардиомиоциты не сокращающихся сердец неспособны стабилизировать свои выпячивания, это, скорее всего, и вносит вклад в их неспособность формировать трабекулы и что кардиомиоциты мутантов erbb2 неспособны формировать трабекулы, несмотря на формирование стабильных, но в меньшем количестве выпячиваний. Предыдущие исследования на рыбках данио показали. что кардиомиоциты изменяют форму в зависимости от своего местоположения внутри сердца (Auman et al., 2007; Chi et al., 2010; Lin et al., 2012). Однако принимая во внимание необходимость поддержания целостности миокардиального эпителия, было предположено, что это очень стабильные и статичные структуры. Поэтому стала неожиданной находка, что кардиомиоциты обладают таким динамичным поведением. Комбинация получения изображений вживую, клонального анализа и преобразования изображений позволила нам впервые раскрыть этот процесс. Как специфицируются кардиомиоциты трабекулярного и компактного слоёв, остается неизвестным. Идентификация миокардиальных выпячиваний, которые проникают в просвет, прежде чем кардиомиоциты транслоцируются в трабекулярный слой ставит ряд предположений относительно их функции. Раннее вытягивание выпячиваний должно позволять кардиомиоцитам исследовать свое окружение в поиске ограниченного запаса предопределяющих судьбу морфогенов, например. Кроме того, эти выпячивания д. предоставлять кардиомиоцитам дополнительное пространство для перераспределения своего объёма, когда они сокращают свою поверхность, не обращенную к просвету. Мы отметили, что выпячивания кардиомиоцитов преимущественно распространяются поверх межклеточных соединений компактного слоя. Такое поведение должно предоставлять механизм для усиления слабых соединений или выравнивания цитоскелетов среди множественных кардиомиоцитов. Трабекулы желудочков формируют прирожденную взаимосвязанную сеть у рыбок данио (Sedmera et al., 2003; Chi et al., 2008; Peshkovsky et al., 2011), а также у кур, мышей и человека (Sedmera et al., 2000). Как кардиомиоциты взаимодействуют, чтобы сформировать такую сеть, плохо изучено. Теоретически, организация трабекулярной сети д. осуществляться двумя обширными способами. Трабекулярные гребни д. быть специфицированы в компактном слое и множественные соседние кардиомиоциты д. транслоцироваться в трабекулярный слой, чтобы формировать будущий гребень. Альтернативно, трабекулярные кардиомиоциты д. специфицироваться периодически по всему компактному слою и формировать новые соединения с др. трабекулярными кардиомиоцитами, чтобы создавать сеть трабекул. Наше получение изображений в живую идентифицировало примеры, в которых выпячивания от двух не соседних кардиомиоцитов приходили в соприкосновение, чтобы сформировать новый контакт между клетками. Хотя роль этих новых контактов ещё предстоит исследовать, это наблюдение предоставляет намек на то, что трабекулярная сеть может формироваться благодаря новым межклеточным соединениям внутри формирующегося трабекулярного слоя. Наша предыдущая работа подтвердила, что трабекуляция использует миграцию кардиомиоцитов скорее, чем ориентированные клеточные деления (Liu et al., 2010), хотя точный механизм миграции остается неизвестным. Наши изображения вживую отсоединения кардиомиоцитов показали, что кардиомиоциты проникают в трабекулярный слой благодаря сокращению их поверхности, не обращенной к просвету, чтобы перераспределить свой клеточный объем в выпячивания в направлении просвета. Важно, что клеточные деления никогда не наблюдались как сопровождение такой миграции, подтверждает, что отслоение не зависит от пролиферации кардиомиоцитов. Сокращение стороны кардиомиоцитов, не обращенной к просвету, напоминает процесс апикального сокращения, которое участвует в ряде важных морфогенетических событий (Sawyer et al., 2010). В самом деле, если апикальный домен кардиомиоцитов остается неизменным со стадии 20 сомитов, когда они обращены лицом прочь от эндокарда (Trinh and Stainier, 2004; Trinh et al., 2005), то этот процесс может быть представлен апикальным сокращением. Отделение вследствие апикального сокращения наблюдалось в ряде различных систем. В общем, имеются два не исключающих др. др. механизма, которые могут управлять клеточным сокращением и отсоединением. В первом, отделение клеток может быть связано с сокращением их собственной апикальной поверхности благодаря перестройкам актина и обеспечиваемого миозином сокращения, как это наблюдается при гаструляции C. elegans (Lee et al., 2006). При втором их соседи д. скоординированно формировать актиновое кольцо, чтобы выдавить отделяющийся кардиомиоцит из щитка (notum) мух (Marinari et al., 2012). Комбинация этих двух механизмов также наблюдалась при вытеснении апоптических клеток из эпителиальных слоёв (Rosenblatt et al., 2001; Slattum et al., 2009; Gu et al., 2011). Наше исследование не может различить между этими тремя возможностями. Наше предыдущее исследование показало, что трабекуляция может быть ингибирована клеточно автономно (Liu et al., 2010), хотя эта находка не может исключить механизм, при котором отделяющийся кардиомиоцит сигнализирует своим соседям о необходимости сформировать контрактильное кольцо. Кроме того, пока неясно, перестаиваются ли кардиомиоциты из компактного слоя, чтобы занять пространство, покинутое их отсоединившимися соседями путем изменения своей морфологии, миграции, перестройки своих клеточных функций или за счет какого-то др. механизма. Необходимы дальнейшие исследования для прояснения точных ролей будущих трабекулярных кардиомиоцитов и их соседей во время процесса выхода из компактного слоя. В подтверждение предыдущих исследований мы наблюдали, что кардиомиоциты erbb2 мутантов или у tnnt2a или myh6 морфантов, неспособны выделяться в трабекулярный слой, по крайней мере, во время исследованных стадий. Однако, мы пожелали определить, отличаются ли механизмы, приводящие к неспособности образовывать трабекулы, между этим дефицитными состояниями. Используя комбинацию клонального анализа и получение изображений вживую, мы оказались способны расширить наш анализ в отношении того, воздействуют ли эти дефициты по-разному на образование миокардиальных выпячиваний. Интересно, что каждая из этих трех манипуляций затрагивала образование выпячиваний по-разному. Мутация в erbb2 приводила к тому, что почти половина кардиомиоцитов давала выпячивания, к тому же выпячивания были менее стабильными. Это указывает на то, что erbb2 вносит вклад в формирование выпячиваний и обеспечение их стабильности. В сочетании с нашей предыдущей находкой, что erbb2 необходим для пролиферации кардиомиоцитов во время развития рыбок данио (Liu et al., 2010), эти данные подтверждают, что erbb2 мутанты вызывают дефицит в инициации трабекуляции, также как и последующего роста этих структур. Инъекции морфолино, которые изменяют механическое окружение сердца, дают заметно отличающиеся эффекты на миокардиальные выпячивания. Сравнение морфантов tnnt2a и myh6 позволяет отличать эффекты кровотока от эффектов контрактильности на развитие трабекул. Заметная нестабильность выпячиваний у морфантов tnnt2a по сравнению с относительно незатронутой стабильностью у морфантов myh6 подтверждает, что контрактильность и/или контрактильные структуры сами по себе вносят вклад в стабильность выпячиваний. Парадоксально, понижение кровотока через желудочки у морфантов myh6 действительно снижает количество выпячиваний, которые выпускают кардиомиоциты, тогда как не отмечается отличий от дикого типа в этом отношении у морфантов tnnt2a. Хотя имеется множество возможных объяснений для этих конфликтных наблюдений, мы сегодня склоняемся в пользу модели, в которой саркомеры стабилизируют выпячивания до их настоящей длины, предупреждая их коллапс или дальнейшее вытягивание. Динамические перестройки в структуре саркомер могут т.о., модулировать удлинение или коллапс выпячиваний. У мутантов erbb2 в кардиомиоцитах актин, по-видимому, секвестрируется внутри или около саркомерных пулов по сравнению с диким типом (S. Reischauer and D.Y.R.S., unpublished observations). Такое секвестрирование может понижать частоту миокардиальных выпячиваний. Предыдущая работа показала, что мутантные myh6 кардиомиоциты обнаруживают измененное распределение саркомеров (Lin et al., 2012). Этот измененный паттерн саркомеров может негативно воздействовать на удлинение миокардиальных выпячиваний. У tnnt2a морфантов, кардиомиоциты не могут продуцировать саркомеры и поэтому их выпячивания удлиняются без 'торможения', а также не могут быть стабилизированы. Итак, наше исследование показало силу комбинированного клонального анализа и изображений вживую для изучения кардиального развития у рыбок данио. Улучшение этого подхода предоставит уникальный инструмент для дальнейшего исследования in vivo биологических вопросов во время развития сердца и др. быстро движущихся тканей.

Взрослое сердце представлено рядом структур, оптимизированных для прокачивания крови. Чтобы создать столь эффективный насос сердце подвергается сложным морфогенетическим изменениям во время развития, нацеленные на непрерывные сердцебиения и на поддержание кровотока развивающихся животных. Одним из ранних морфогенетических процессов является развитие трабекул в желудочках. Трабекулы желудочков являются гребневидными миокардиальными структурами внутри стенок желудочков, которые образуют сложную сеть в раннем развитии (Sedmera et al., 2000; Stankunas et al., 2008; Liu et al., 2010; Peshkovsky et al., 2011; Staudt and Stainier, 2012). Трабекулы являются критическими для функции сердца, тогда как мутации, устраняющие образование трабекул являются эмбриональными леталями (Gassmann et al., 1995; Lee et al., 1995; Meyer and Birchmeier, 1995; Suri et al., 1996; Morris et al., 1999; Tidcombe et al., 2003; Liu et al., 2010), а у людей с избыточной трабекуляцией возникает сердечная недостаточность (Jenni et al., 1999). Трабекуляции служат для увеличения массы миокарда перед образованием коронарных сосудов и как таковые вносят вклад сократимость желудочков; они также необходимы для образования проводящей системы (Sedmera et al., 2003; Liu et al., 2010). Хотя исследования на мышах начались, чтобы выяснить генетические основы кардиальной трабекуляции, как кардиомиоциты формируют эти важные структуры, поскольку непрерывные сокращения остаются слабо изученными. Наиболее поразительным для этих исследований in vivo оказался тот факт, что сердце постоянно движется и поэтому для получения изображений с высоким разрешением потребовалась новая техника преобразования изображений. Рыбки данио оказались пригодными для получения долговременных изображений развивающегося сердца (Beis and Stainier, 2006), тем самым была найдена идеальная модельная система, позволяющая изучать трабекуляцию сердца на клеточном разрешении в реальном времени.

Ряд факторов, как известно, играет роль в трабекуляции. Несколько сигнальных путей, включая пути Angiopoietin/Tie2 (Suri et al., 1996), Semaphorin/Plexin (Toyofuku et al., 2004a; Toyofuku et al., 2004b) и Neuregulin/ErbB2/ErbB4 (Gassmann et al., 1995;Lee et al., 1995; Morris et al., 1999; Tidcombe et al., 2003; Liu et al., 2010) , участвуют в этом процессе. Среди этих регуляторов трабекуляции путь ErbB2 является важным клеточно автономным путем в кардиомиоцитах (Morris et al., 1999; Tidcombe et al., 2003; Liu et al., 2010). Кроме того, механические факторы, такие как кровоток и/или сократимость вносят вклад в трабекуляцию. Личинки рыбок данио с тяжелыми дефектами в сократимости сердца из-за нарушений саркомеров, неспособны формировать трабекулы (Chi et al., 2008). Нарушение кровотока через желудочки из-за нарушений сократимости предсердий, приводят нарушениям трабекуляции (Peshkovsky et al., 2011). Сходным образом, нарушение кровотока в левом желудочке эмбрионального сердца кур после перевязки левого предсердия снижает объем трабекул левого желудочка (Sedmera et al., 1999). Пока неизвестно, как передача сигналов ErbB2 или механические силы регулируют трабекуляцию.

Большая часть того, что известно о трабекуляции, получена в результате анализа мутантов, которые могут показать, развиваются или нет трабекулы у эмбрионов. Однако не было исследований того, как кардиомиоциты образуют трабекулы на клеточном уровне. Предыдущие исследования установили расположение кардиомиоцитов в трабекулярном слое спустя 55 ч после оплодотворения (hpf) у рыбок данио (Chi et al., 2008; Liu et al., 2010; Peshkovsky et al., 2011). Кроме того, исследования на мышах и курах показали, что трабекулярные кардиомиоциты клонально родственны кардиомиоцитам наружного, компактного слоя (Mikawa et al., 1992; Meilhac et al., 2003; Meilhac et al., 2004a; Meilhac et al., 2004b), наши данные по отслеживанию клеточных клонов (Liu et al., 2010), так же как и данные от Gupta и Poss (Gupta and Poss, 2012), показали, что трабекуляция осуществляется посредством процесса отслоения скорее, чем асимметричных делений клеток. Как кардиомиоциты отслаиваются от компактного слоя, остается неясным. Здесь, используя комбинацию клонального анализа и получения изображений живых клеток сокращающегося сердца, мы показали, что трабекулы формируются в результате двухступенчатого процесса отслоения. Кардиомиоциты сначала удлиняют выпячивания в просвет через своих соседей и затем постепенно сокращают свою не обращенную к просвету поверхность, чтобы переместить свое тело в трабекулярный слой. Далее мы установили, что мутации, нарушающие трабекуляцию, вызывают разные дефекты в формировании и поведении этих миокардиальных выпячиваний. В сердцах, которые не сокращаются, кардиомиоциты испускают коротко живущие выпячивания, тогда как в сердцах со сниженным кровотоком кардиомиоциты испускают меньше выпячиваний на клетку. Наконец, у erbb2 мутантов, меньше кардиомицитов, испускающих выпячивания. Т.о., мы идентифицировали дифференциально регулируемый клеточный процесс, который вносит вклад в первую ступень трабекуляции.

DISCUSSION

В данном исследовании мы комбинировали клональный анализ с мощной техникой получения изображений живых клеток, чтобы идентифицировать поведение миокардиальных клеток, ведущее к трабекуляции. Мы идентифицировали ранее неизвестную способность активно сокращающихся кардиомиоцитов выпускать длинные выпячивания в направлении просвета перед тем как транслоцироваться, чтобы сформировать трабекулы. Далее наши данные показали, что кардиомиоциты проникают в трабекулярный слой посредством сокращения стороны, не обращенной к просвету, вытягивая выпячивания к просвету, в который они входят. Поскольку кардиомиоциты сокращают свою abluminal поверхность и вступают в трабекулярный слой, то соседние кардиомиоциты перемещаются в покинутое пространство, чтобы поддержать сцепленный молекулярно компактный слой. Наконец, мы установили, что кардиомиоциты не сокращающихся сердец неспособны стабилизировать свои выпячивания, это, скорее всего, и вносит вклад в их неспособность формировать трабекулы и что кардиомиоциты мутантов erbb2 неспособны формировать трабекулы, несмотря на формирование стабильных, но в меньшем количестве выпячиваний.

Предыдущие исследования на рыбках данио показали. что кардиомиоциты изменяют форму в зависимости от своего местоположения внутри сердца (Auman et al., 2007; Chi et al., 2010; Lin et al., 2012). Однако принимая во внимание необходимость поддержания целостности миокардиального эпителия, было предположено, что это очень стабильные и статичные структуры. Поэтому стала неожиданной находка, что кардиомиоциты обладают таким динамичным поведением. Комбинация получения изображений вживую, клонального анализа и преобразования изображений позволила нам впервые раскрыть этот процесс. Как специфицируются кардиомиоциты трабекулярного и компактного слоёв, остается неизвестным. Идентификация миокардиальных выпячиваний, которые проникают в просвет, прежде чем кардиомиоциты транслоцируются в трабекулярный слой ставит ряд предположений относительно их функции. Раннее вытягивание выпячиваний должно позволять кардиомиоцитам исследовать свое окружение в поиске ограниченного запаса предопределяющих судьбу морфогенов, например. Кроме того, эти выпячивания д. предоставлять кардиомиоцитам дополнительное пространство для перераспределения своего объёма, когда они сокращают свою поверхность, не обращенную к просвету. Мы отметили, что выпячивания кардиомиоцитов преимущественно распространяются поверх межклеточных соединений компактного слоя. Такое поведение должно предоставлять механизм для усиления слабых соединений или выравнивания цитоскелетов среди множественных кардиомиоцитов.

Трабекулы желудочков формируют прирожденную взаимосвязанную сеть у рыбок данио (Sedmera et al., 2003; Chi et al., 2008; Peshkovsky et al., 2011), а также у кур, мышей и человека (Sedmera et al., 2000). Как кардиомиоциты взаимодействуют, чтобы сформировать такую сеть, плохо изучено. Теоретически, организация трабекулярной сети д. осуществляться двумя обширными способами. Трабекулярные гребни д. быть специфицированы в компактном слое и множественные соседние кардиомиоциты д. транслоцироваться в трабекулярный слой, чтобы формировать будущий гребень. Альтернативно, трабекулярные кардиомиоциты д. специфицироваться периодически по всему компактному слою и формировать новые соединения с др. трабекулярными кардиомиоцитами, чтобы создавать сеть трабекул. Наше получение изображений в живую идентифицировало примеры, в которых выпячивания от двух не соседних кардиомиоцитов приходили в соприкосновение, чтобы сформировать новый контакт между клетками. Хотя роль этих новых контактов ещё предстоит исследовать, это наблюдение предоставляет намек на то, что трабекулярная сеть может формироваться благодаря новым межклеточным соединениям внутри формирующегося трабекулярного слоя.

Наша предыдущая работа подтвердила, что трабекуляция использует миграцию кардиомиоцитов скорее, чем ориентированные клеточные деления (Liu et al., 2010), хотя точный механизм миграции остается неизвестным. Наши изображения вживую отсоединения кардиомиоцитов показали, что кардиомиоциты проникают в трабекулярный слой благодаря сокращению их поверхности, не обращенной к просвету, чтобы перераспределить свой клеточный объем в выпячивания в направлении просвета. Важно, что клеточные деления никогда не наблюдались как сопровождение такой миграции, подтверждает, что отслоение не зависит от пролиферации кардиомиоцитов. Сокращение стороны кардиомиоцитов, не обращенной к просвету, напоминает процесс апикального сокращения, которое участвует в ряде важных морфогенетических событий (Sawyer et al., 2010). В самом деле, если апикальный домен кардиомиоцитов остается неизменным со стадии 20 сомитов, когда они обращены лицом прочь от эндокарда (Trinh and Stainier, 2004; Trinh et al., 2005), то этот процесс может быть представлен апикальным сокращением.

Отделение вследствие апикального сокращения наблюдалось в ряде различных систем. В общем, имеются два не исключающих др. др. механизма, которые могут управлять клеточным сокращением и отсоединением. В первом, отделение клеток может быть связано с сокращением их собственной апикальной поверхности благодаря перестройкам актина и обеспечиваемого миозином сокращения, как это наблюдается при гаструляции C. elegans (Lee et al., 2006). При втором их соседи д. скоординированно формировать актиновое кольцо, чтобы выдавить отделяющийся кардиомиоцит из щитка (notum) мух (Marinari et al., 2012). Комбинация этих двух механизмов также наблюдалась при вытеснении апоптических клеток из эпителиальных слоёв (Rosenblatt et al., 2001; Slattum et al., 2009; Gu et al., 2011). Наше исследование не может различить между этими тремя возможностями. Наше предыдущее исследование показало, что трабекуляция может быть ингибирована клеточно автономно (Liu et al., 2010), хотя эта находка не может исключить механизм, при котором отделяющийся кардиомиоцит сигнализирует своим соседям о необходимости сформировать контрактильное кольцо. Кроме того, пока неясно, перестаиваются ли кардиомиоциты из компактного слоя, чтобы занять пространство, покинутое их отсоединившимися соседями путем изменения своей морфологии, миграции, перестройки своих клеточных функций или за счет какого-то др. механизма. Необходимы дальнейшие исследования для прояснения точных ролей будущих трабекулярных кардиомиоцитов и их соседей во время процесса выхода из компактного слоя.

В подтверждение предыдущих исследований мы наблюдали, что кардиомиоциты erbb2 мутантов или у tnnt2a или myh6 морфантов, неспособны выделяться в трабекулярный слой, по крайней мере, во время исследованных стадий. Однако, мы пожелали определить, отличаются ли механизмы, приводящие к неспособности образовывать трабекулы, между этим дефицитными состояниями. Используя комбинацию клонального анализа и получение изображений вживую, мы оказались способны расширить наш анализ в отношении того, воздействуют ли эти дефициты по-разному на образование миокардиальных выпячиваний. Интересно, что каждая из этих трех манипуляций затрагивала образование выпячиваний по-разному. Мутация в erbb2 приводила к тому, что почти половина кардиомиоцитов давала выпячивания, к тому же выпячивания были менее стабильными. Это указывает на то, что erbb2 вносит вклад в формирование выпячиваний и обеспечение их стабильности. В сочетании с нашей предыдущей находкой, что erbb2 необходим для пролиферации кардиомиоцитов во время развития рыбок данио (Liu et al., 2010), эти данные подтверждают, что erbb2 мутанты вызывают дефицит в инициации трабекуляции, также как и последующего роста этих структур.

Инъекции морфолино, которые изменяют механическое окружение сердца, дают заметно отличающиеся эффекты на миокардиальные выпячивания. Сравнение морфантов tnnt2a и myh6 позволяет отличать эффекты кровотока от эффектов контрактильности на развитие трабекул. Заметная нестабильность выпячиваний у морфантов tnnt2a по сравнению с относительно незатронутой стабильностью у морфантов myh6 подтверждает, что контрактильность и/или контрактильные структуры сами по себе вносят вклад в стабильность выпячиваний. Парадоксально, понижение кровотока через желудочки у морфантов myh6 действительно снижает количество выпячиваний, которые выпускают кардиомиоциты, тогда как не отмечается отличий от дикого типа в этом отношении у морфантов tnnt2a. Хотя имеется множество возможных объяснений для этих конфликтных наблюдений, мы сегодня склоняемся в пользу модели, в которой саркомеры стабилизируют выпячивания до их настоящей длины, предупреждая их коллапс или дальнейшее вытягивание. Динамические перестройки в структуре саркомер могут т.о., модулировать удлинение или коллапс выпячиваний. У мутантов erbb2 в кардиомиоцитах актин, по-видимому, секвестрируется внутри или около саркомерных пулов по сравнению с диким типом (S. Reischauer and D.Y.R.S., unpublished observations). Такое секвестрирование может понижать частоту миокардиальных выпячиваний. Предыдущая работа показала, что мутантные myh6 кардиомиоциты обнаруживают измененное распределение саркомеров (Lin et al., 2012). Этот измененный паттерн саркомеров может негативно воздействовать на удлинение миокардиальных выпячиваний. У tnnt2a морфантов, кардиомиоциты не могут продуцировать саркомеры и поэтому их выпячивания удлиняются без 'торможения', а также не могут быть стабилизированы.

Итак, наше исследование показало силу комбинированного клонального анализа и изображений вживую для изучения кардиального развития у рыбок данио. Улучшение этого подхода предоставит уникальный инструмент для дальнейшего исследования in vivo биологических вопросов во время развития сердца и др. быстро движущихся тканей.

High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation David W. Staudt, Jiandong Liu, Kurt S. Thorn, Nico Stuurman, Michael Liebling and Didier Y. R. Stainier Development. 2014 Feb;141(3):585-93. doi: 10.1242/dev.098632. Epub 2014 Jan 8.

High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation
David W. Staudt, Jiandong Liu, Kurt S. Thorn, Nico Stuurman, Michael Liebling and Didier Y. R. Stainier
Development. 2014 Feb;141(3):585-93. doi: 10.1242/dev.098632. Epub 2014 Jan 8.