В данном исследовании мы охарактеризовали становление G1 checkpoint и связанную с ним репарацию DSB, а также биологические эффекты этих процессов в эмбриональной печени мышей на разных ст. развития. Это первое исследование с использованием ткани живой эмбриональной печени, исследующее ДНК повреждениями вызываемый checkpoint и репарацию во время эмбрионального развития.

ES клетки, лишенные повреждениями ДНК обусловленного G1 checkpoints в культуре [8-10] и использующие S и G2 арест клеточного цикла в качестве защитного механизма [9,10]. Если ES клетки дифференцированы и участвуют в развитии клона и органа, то арест в G2 клеточного цикла всё ещё остается самой ранней реакцией на повреждение ДНК (Figure 2A, B, C, E) [6] во время ранних стадий эмбрионального развития печеночных клеток (E11.5 - E15.5). Начиная со ст. E13.5/E15.5, эмбриональные печеночные клетки начинают формировать G1 checkpoint повреждений ДНК, при этом арест клеточного цикла на G1 замещается временным арестом G2 на длительный период времени после повреждения ДНК (Figure 2A, B, C, D, E) [6]. Неясно, почему G1 checkpoint устанавливается значительно позднее, чем G2 checkpoint. Потребность в быстрой пролиферации приводит к тому, что клетки находятся в большинстве своем в S и G2/M клеточного цикла, с короткой G1 фазой, на ранних ст. развития, это может также наделять клетки с S и G2/M фазой клеточно цикла механизмами checkpoint в ответ на повреждения ДНК. Во время дифференцировки ES клеток и развития эмбрионов, длина G1 клеточного цикла и G1 популяция увеличиваются [4-7,17-19], т.к. начинает действовать аппарат G1 checkpoint (Figures 1A, 2A, B, C, D) [6]. Более важно, что арест клеточного цикла предоставляет время для репарации повреждений ДНК. Арест в G2 д. предупреждать апоптоз, тогда как арест в G1 важен для предупреждения вступления поврежденной ДНК в S фазу. Т.о., с помощью сравнения между E11.5 и E15.5, наше исследование продемонстрировало, что становление G1 checkpoint играет критическую роль в в долговременной стабильности геном (Table 2) (Figure 5A, B), хотя аберрантные хромосомы всё ещё существуют в клетках взрослой печени, следовательно, защита неполная (Table 2).

Ясно, что инициация G1 checkpoint в клетках эмбриональной печени на ст. E13.5/E15.5 регулируется с помощью снижения активности комплекса Cdk2/cyclin E (Figure 3D, C, E). Подавление Cdk2, по-видимому, не регулируется с помощью p27, т.к. уровни экспрессии p27 были ассоциированы с увеличенной популяцией G1 во время эмбрионального развития печени, независимо от DDR (Figures 1D,3C). Однако, экспрессия p21 не связана с экспансией G1 популяции во время созревания эмбриональной печени (Figure 1D), а вместо этого индуцируется повреждениями ДНК (Figure 3C, F), а индуцированная экспрессия p21 наиболее мощная на ст. E13.5/E15.5 чем на более ранних стадиях (Figure 3F). Ассоциация между дифференцировкой и длиной фазы G1 всегда была крайне интересной. Недавно всестороннее исследование продемонстрировало, что в процессе дифференцировки ESC мышей, накопление p21 (под регуляцией mir-290 miRNA) приводит к инактивации Cdk2 и cyclin E, приводя к задержке перехода фаз G1-> S; эти результаты подтверждают взаимозависимость между длиной G1 и дифференцировкой [18,19]. Хотя не ограниченная ES клетками, длина G1 может непосредственно воздействовать на дифференцировку нейральных и гематопоэтических стволовых клеток во время развития и у взрослых [6,20], у которых подавление Cdk2/cyclin E, по-видимому, является одним из основных механических контролеров удлинения G1 [20]; ингибирование активности Cdk2/cyclin E [21] или истощение Cdk2/Cdk4 [22] приводят к повышению длины G1 и, следовательно, к нейрональной дифференцировке. В эмбриональной печени наше исследование расширило роль подавления Cdk2/cyclin E в вызванном повреждениями ДНК аресте клеточного цикла в G1 (Figures 2, 3 and 4). Т.о., предполагаемый регуляторный механизм экспансии G1 фазы в mESC или в дифференцировке нейрональных SC также приложим к инициации G1 checkpoint повреждений ДНК во время развития эмбриональных клеток печени. G1 checkpoint возникает только на ст. (E13.5/15.5), на которой IR индуцирует высокую экспрессию p21, это приводит к ингибированию комплекса Cdk2/cyclin E и блокированию перехода G1-to-S (Figures 2, 3 and 6). Т.о., p21-Cdk2/cyclin E-обеспечиваемая экспансия G1 [18,19,4], по-видимому, является общим регуляторным механизмом как длины G1 клеточной фазы, так и для повреждениями ДНК обусловленного ареста клеточного цикла в G1 (Figure 6).

Figure 6. A proposed model of G1 checkpoint establishment during embryonic liver development. In response to IR damage, G2 cell cycle checkpoint is present in ES cells [8-10] and in E11.5 to E17.5 embryonic liver cells. At E13.5/E15.5 stage, G1 cell cycle checkpoint is established under the regulation of p21-CDK/cyclin E pathway.

γ H2AX позитивные клетки в печени на ст. E11.5 сохраняются на высоком уровне в течение всего более продолжительного времени пребывания после IR (Figure 4C), относительно большая популяция на ст. E11.5 печеночных клеток в S фазе д. быть причиной; поскольку было показано, что фокусы DSB образуются в ходе ареста репликации, вызванного UV [23]. Однако небольшое количество индуцированных UV фокусов обнаруживает совместно присутствие DSB и γ H2AX c 53BP1, тогда как большинство pan-nuclear γ H2AX, пре-апоптический сигнал, обнаруживается в S фазе [24]. Согласно нашим экспериментальным данным: (a) IR не вызывает ареста репликации (Figure 2); (b) после короткого ареста G2, на ст. E11.5 печеночные клетки возвращаются к базовому уровню, но не к аресту фазы S (Figure 2); (c) фракция γ H2AX позитивных клеток не отличается достоверно в печеночных клетках между ст. E11.5 и E15.5 в условиях без IR (p =0.349) (Figure 4C), тогда как популяция клеток в S фазе в обоих случаях высокая (over 50%) (Figure 2A, C). Более того, быстрая репарация с помощью NHEJ не ограничивается специфической клеточной фазой, а проявляется в ходе всех клеточных фаз цикла [25]. Т.о., высокие уровни γH2AX фокусов на ст. E11.5 в клетках печени, скорее всего, обусловлены их способностью к репарации ДНК недостаточно компетентной, т.к. отсутствует контроль checkpoint G1 ареста (Figures 2 and 4). В соответствии с этим ранний апоптоз был достоверно выше в E11.5 по сравнению с E15.5 в печеночных клетках (p = 0.005) (Figure 4D, Table 1), это является клеточным следствием отсутствия G1 так и сохранения высокого уровня не репарированных повреждений ДНК на ст. E11.5.