Посещений: 
ФОРМИРОВАНИЕ РЕСНИЧЕК
Роль центриолярного сателлитного белка AZI1
|
|
The Centriolar Satellite Protein AZI1 Interacts with BBS4 and Regulates Ciliary Trafficking of the BBSome " Xitiz Chamling,
" Seongjin Seo,
" Charles C. Searby,
" GunHee Kim,
" Diane C. Slusarski,
" Val C. Sheffield
PLoS Genet 10(2): e1004083. doi:10.1371/journal.pgen.1004083 |
Bardet-Biedl syndrome (BBS) is a well-known ciliopathy with mutations reported in 18 different genes. Most of the protein products of the BBS genes localize at or near the primary cilium and the centrosome. Near the centrosome, BBS proteins interact with centriolar satellite proteins, and the BBSome (a complex of seven BBS proteins) is believed to play a role in transporting ciliary membrane proteins. However, the precise mechanism by which BBSome ciliary trafficking activity is regulated is not fully understood. Here, we show that a centriolar satellite protein, AZI1 (also known as CEP131), interacts with the BBSome and regulates BBSome ciliary trafficking activity. Furthermore, we show that AZI1 interacts with the BBSome through BBS4. AZI1 is not involved in BBSome assembly, but accumulation of the BBSome in cilia is enhanced upon AZI1 depletion. Under conditions in which the BBSome does not normally enter cilia, such as in BBS3 or BBS5 depleted cells, knock down of AZI1 with siRNA restores BBSome trafficking to cilia. Finally, we show that azi1 knockdown in zebrafish embryos results in typical BBS phenotypes including Kupffer's vesicle abnormalities and melanosome transport delay. These findings associate AZI1 with the BBS pathway. Our findings provide further insight into the regulation of BBSome ciliary trafficking and identify AZI1 as a novel BBS candidate gene.
Рисунки к статье
|
Первичные реснички образуются из центриолей, которые перемещаются на периферию клетки и формируют базальные тельца. Из центриолей, микротрубочки вытягиваются и выступают над клеточной поверхностью, чтобы образовать ресничку. Первичные реснички дают прибежище нескольким сигнальным путям рецепторов, таким как Hedgehog, Wnt и PDGFR, и они важны для тканевого гомеостаза, функции фоторецепторов и обоняния [1], [2], [3]. Нарушение образования ресничек приводит к ряду распространенных фенотипических отклонений, включая дегенерацию сетчатки, полидактилию, situs inversus, гидроцефалию и поликистозную болезнь почек, которые являются признаками нескольких плейотропных генетических нарушений, включая синдром Alstrоm syndrome (ALMS), Nephronophthisis (NPHP), Joubert Syndrome и Bardet-Biedl синдром (BBS) [4], [5], [6]. Многие белки ресничек образуют комплексы и функциональные сети. Напр., NPHP и MKS белки формируют модульный комплекс в переходной зоне, который функционирует как ворота реснички [7], [8], [9], [10], а белки внутрижгутивого транспорта (IFT) образуют комплексы, участвующие в доставке белков реснички [11]. Сходным образом, 7 BBS белков и BBIP10 образуют стабильный октамерный комплекс, BBSome [12], [13].
BBSome располагаются как в центриолярных сателлитах, так и в ресничках, а аберрантное расположение некоторых белков ресничек, включая MCHR1, SSTR3 и dopamine receptor 1, наблюдалось в нулевом Bbs2 и Bbs4 головном мозге [14], [15]. Кроме того, описано взаимодействие BBS4 с др. белками центриолярных сателлитов, такими как PCM1, и взаимодействие BBS9 с LZTFL1 [16], [17]. Однако, многие грузы BBSome и BBSome взаимодействующие белки в клетках и тканях млекопитающих ещё предстоит идентифицировать и определить точные механизмы, с помощью которых активность по доставке BBSome регулируется.
В данном исследовании мы использовали ранее описанную трансгенную Bbs4 мышиную модель [18], чтобы идентифицировать дополнительные взаимодействующие белки BBSome. Мы описали белок центриолярных сателлитов, AZI1, в качестве нового взаимодействующего белка BBSome, который физически соединяется с BBSome посредством BBS4. BBS4 является известной субъединицей BBSome, расположенной в центриолярных сателлитах, и являющейся финальной субъединицей, добавляемой к собранной BBSome [19]. Было предположено, что сателлитные белки, такие как PCM1 взаимодействуют с BBS4 перед их инкорпорацией в BBSome [20]. В соответствии с этой гипотезой, мы наблюдали отдельный для центриолярных сателлитов пул из BBS4, не говоря уже о BBSome комплексах в HEK293T клетках. Наши результаты показали, что AZI1 является частью PCM1-зависимого центриолярного комплекса, содержащего BBS4. Мы также показали, что истощение AZI1 не влияет на образование BBSome комплексов, но уменьшает образование ресничек и усиливает поставку BBSome в реснички. Наконец, используя рыбок данио в качестве модели, мы показали, что azi1 морфанты сходны с bbs морфантами, находка, которая связывает AZI1 с путем BBS и делает AZI1 геном кандидатом BBS.
Discussion
Недавние работы с AZI1 (CEP131) выявили его роль в образовании ресничек, стабильности генома и формированию опухолей [21], [32], [36], [37]. Описано взаимодействие AZI1 с белками центриолярных сателлитов PCM1 и CEP290, а также моторным белком микротрубочек p150 [21]. В центросоме PCM1 и CEP290 взаимодействуют др. с др., а также с BBS4, который, как известно, взаимодействует также с p150 [16]. В данном исследовании мы установили и описали AZI1 как белок, взаимодействующий с BBS4, благодаря чему он взаимодействует с BBSome. Мы описали, что AZI1 взаимодействует с PCM1 и BBS4, и негативно регулирует доставку BBSome в реснички. После истощения PCM1 теряется расположение AZI1 в центриолярных сателлитах, но его локализация в центриоли поддерживается с помощью pericentrin и CEP290 [21]. Расположение BBS4 в центриолярных сателлитах зависит также от PCM1 (Fig. 3); следовательно, PCM1 действует в качестве каркаса, на котором эти сателлитные белки взаимодействуют. Взаимодействия, обнаруживаемые между AZI1, BBS4, PCM1 и CEP290 подтверждают, что они являются частью одного и того же комплекса.
Взаимодействие BBS4 с сателлитными белками и прирожденная сателлитная локализация BBS4 не зависят от др. белков BBSome [19], указывая на возможность содержания в центриолярном сателлитном комплексе BBS4, помимо комплекса BBSome. Мы описали такой PCM1-зависимый сателлитный комплекс, состоящий из BBS4 в 293T и GFP-BBS4 клетках. Отсутствие такого отличающегося комплекса в нормальных снабженных ресничками RPE клеток указывает, что определенный центриолярный пул BBS4 более доказателен, когда имеется избыток BBS4 или отсутствуют первичные реснички. Вероятно, что BBS4 обладает более высоким сродством к BBSome комплексу, чем к сателлитному комплексу. В клетках, избыточно экспрессирующих BBS4, избыток BBS4 не может быть включен в BBSome комплекс и в клетках, не содержащих ресничек, (таких как пролиферирующие 293T клетки) формирование BBSome комплекса может быть не столь мощным, как в клетках с ресничками. Как результат многие BBS4 остаются как часть центриолярного сателлитного комплексa в этих клетках.
Белки центриолярного сателлита, по-видимому, выполняют двойную роль: рекрутирование белков, участвующих в сборке ресничек в месте, вблизи основания реснички, и контролирующих вступление накопленных белков в ресничку. PCM1 действует в качестве каркасного белка, чтобы рекрутрировать белки центриолярных сателлитов, и он важен для образования центриолярного сателлита и сборки реснички. Отсутствие PCM1 приводит к полной дисперсии сателлита и BBS белков [21], [25], [26], [27], и как следствие этого неспособность образования реснички или потеря реснички. AZI1, который также располагается в центриолярных сателлитах, по-видимому, ограничивает рекрутирование в реснички BBSome. Конечно, AZI1 не нужен для поддержания целостности центриолярного комплекса и центриолярный пул BBS4 остается интактным даже в отсутствие AZI1. Наши результаты показывают, что AZI1 не участвует в формировании BBSome, но негативно сказ0ывается на рекрутировании в реснички BBSome.
Подобно PCM1, AZI1 соединяется с BBS4 и может играть роль в секвестрации BBS4 и ограничении его доступности к инкорпорации в BBSome [20]. Следовательно, он один из скорость ограничивающих факторов, связанных со вступлением BBSome в реснички, он ограничивает доступность holo-BBSome, которые могут проникать в реснички. Очевидно, что PCM1, с его связующей ролью в сателлите, удерживает и секвестрирует BBS4 в сателлитном комплексе при содействии AZI1. Ранее мы показали, что частичный BBSome комплекс (без BBS4) достигает центросомы, чтобы инкорпорировать BBS4 в качестве своей последней субъединицы [19] (Fig. 7). После добавления BBS4 к BBSome, holo-BBSome могут проникать в ресничку, тогда как остальные сателлитные белки остаются в основании реснички [17] (Fig. 7A). Если AZI1 истощен, то больше BBS4 может ассоциировать с BBSome и больше holo-BBSome оказываются готовы к вступлению в ресничку (Fig. 7B).
Figure 7. A model showing centrosomal complex of BBS4, BBSome complex formation, and its ciliary localization.
A) 1. Partial BBSome complex (without BBS4) arrives near the centrosome, where BBS4 is part of a satellite complex. At the centrosome BBS4 is incorporated into the BBSome and a stable holo-BBSome complex is formed, which is trafficked to cilia while the rest of the satellite complex remain at the centrosome. A potential rate-limiting factor of BBSome entry into cilia is availability of the BBSome complex that can enter cilia. B) Loss of AZI1 weakens the interaction of BBS4 with the satellite complex, and more BBSome complex is available for entry into cilia.
Необходимо отметить, что AZI1 взаимодействует с BBS4 в сателлитном комплексе, а также с BBS4, когда он является частью завершенных BBSome (Fig. S2A). Единственная возможность заключается в том, что AZI1 временно ассоциирует с BBSome во время переноса BBS4 в BBSome, чтобы завершить комплекс. Однако мы не можем исключить возможность, что AZI1 может прямо регулировать доставку BBSome в реснички посредством фосфорилирования или сходных пост-трансляционных модификационных событий. Определение сигналов, которые регулируют связывание BBSome с AZI1 и его высвобождение для рекрутирования в реснички является важной областью будущих исследований. Кроме того, будущие исследования важны для понимания точного механизма, с помощью которого ZI1 регулирует вступление BBSome в ресничку.
Негативная регуляция доставки BBSome в ресничку также характерна для LZTFL1, недавно идентифицированного белка, который взаимодействует с BBSome [17]. Недавнее открытие мутации LZTFL1 у пациентов с BBS [38] подтверждает, что идентификация новых взаимодействующих белков способствует открытию новых болезнь вызывающих генов. Наши данные по рыбкам данио показали, что morpholino нокдаун azi1, подобно нокдауну гена bbs, вызывает BBS-подобные фенотипы у рыбок данио и подтверждает ассоциацию AZI1 с путем BBS у модельных животных.
|