Здесь мы предоставили первые доказательства in vivo у позвоночных, что два близко родственных энзима биосинтетического пути HS, 3-OST-5 и 3-OST-6, выполняют самостоятельные клеточные и онтогенетические функции в одной и той же клетке. Важно, что, по крайней мере, два др. члена, 3-OST-3Z и 3-OST-7, экспрессируются в этих же клетках, но неспособны компенсировать их функции, а нокдаун этих двух 3-OSTs не вызывает дефектов формирования LR паттерна. Поразительно, что нокдаун двух членов семейства 3-OST ведет к одинаковому онтогенетическому конечному фенотипу, изменению LR асимметрии органов, благодаря клеточно автономным функциям в клетках с ресничками из KV. Однако, нокдаун каждого из этих двух 3-OSTs приводит к этому конвергентному LR фенотипу посредством, по-видимому, дискретных клеточных и молекулярных механизмов (Fig. 6): 3-OST-5 регулирует длину ресничек посредством экспрессии FGF-зависимого дающего реснички транскрипционного фактора, а 3-OST-6 регулирует подвижность ресничек посредством экспрессии kinesin и морфологии плеч dynein ресничек.

Fig. 6. Glycocode model: 3-OST-5 and 3-OST-6 regulate distinct cell signaling pathways for ciliogenesis and cilia motility.Schematic of glycocode regulation of cilia length and cilia motility. 3-OST-5 and FGF pathway perturbations have the same downstream molecular and short cilia phenotypes, and display dose-dependent genetic interactions. Therefore, we propose that 3-OST-5 generates a glycocode (blue) on HS chains on proteoglycans (indicated by HSPGs) that modulates interactions of FGF ligands (for example, Fgf8 and Fgf24) and Fgfr1 at the cell surface. It is important to note that the modifications can be on the same HSPG core protein (as shown HSPG for simplicity) or multiple different HSPGs in the same cell. This interaction activates downstream ciliogenic transcription factors includingfoxj1a and rfx2 for normal length KV cilia. By contrast, 3-OST-6 generates a different glycocode (green) that modulates a distinct pathway regulating kif3bexpression, dynein arms and cilia motility.

3-OST-5 контролирует длину ресничек посредством пути, который контролирует экспрессию двух продуцирующих реснички транскрипционных факторов в KV, foxj1a и rfx2, и чувствительного к FGF гена sef. Fgfr1 и 3-OST-5 имеют сходные функции: они регулируют DFC/KV экспрессию foxj1a и rfx2, длину ресничек и асимметричный ток жидкости в KV, и необходимы клеточно автономно в клетках KV для формирования LR (Neugebauer et al., 2009). Кроме того, они имеют сходные фенотипы, такие как искривление оси тела, которое одинаково у морфантов или мутантов по ciliogenic генам, таким как polaris (ift88) и foxj1a (Bisgrove et al., 2005; Yu et al., 2008;Tian et al., 2009; Hellman et al., 2010). Т.о., вполне возможно, что передача сигналов 3-OST-5 и Fgfr1 действуют на одном и том же ciliogenic пути, регулируя возникновение LR асимметрии; это в дальнейшем подтверждено экспериментами с дозой 3-OST-5 и Fgf8 лиганда (Fig. 3). Мы полагаем, что 3-OST-5 в клетках DFC/KV генерирует гликокод, необходимый для передачи сигналов FGF на клеточную поверхностью, который затем поддерживает нижестоящий ciliogenic путь контроля длины ресничек (Fig. 6). Интересно, что вовлечение 3-OST-5 в путь передачи сигналов FGF, по-видимому, тканеспецифичен. Напр., 3-OST-5 обнаруживает дефекты в отолитах, но не дает дефектов пронефрических протоков, наблюдаемых у fgfr1 морфантов (Neugebauer et al., 2009) (data not shown). Подавление мишеней FGF пути у 3-OST-5 морфантов уникально для DFCs во время раннего эмбрионального развития (Fig. 3G,H), это указывает на то, что др. комбинации гликокода участвуют в передаче сигналов FGF в др. тканях. Предварительная проверка предполагаемых мутантов 3-OST-5 не выявила эмбриональных фенотипических отклонений (data not shown). Принимая во внимание вносимую матерями историю из нескольких членов семейства в эмбрион (Cadwallader and Yost, 2006a), необходим дальнейший анализ материнских-зиготических мутантов по этому и др. членам семейства, вообще-то на разных генетических фонах линий для полного понимания функциональных взаимоотношений в семействе 3-OST и необходим анализ последних фенотипов, которые находятся вне пределов достижений технологии morpholino.

Как у fgfr1 MO- , так и 3-OST-5 MO-обработанных эмбрионов, стало до некоторой степени неожиданным, что экспрессия foxj1a уменьшается, но экспрессия, dnah9 относительно нормальная (Neugebauer et al., 2009), в противоположность др. сообщениям о связи экспрессии dnah9 с foxj1a (Yu et al., 2008; Hellman et al., 2010; Caron et al., 2012). Экспрессия foxj1a пробуждается рано, во время 30% эпиболии (Aamar and Dawid, 2008), и инициируется с помощью Wnt/β-catenin пути (Caron et al., 2012). Мы полагаем, что передача сигналов FGF, а теперь и 3-OST-5, необходимы для поддержания экспрессии foxj1a. Потеря этого пути приводит к редукции экспрессии мРНК foxj1a, но вообще-то достаточное количество раннего белка Foxj1a доступно, чтобы инициировать экспрессию dnah9. Важно отметить, что при нокдауне 3-OST-5 и Fgfr1 реснички подвижны, несмотря на пониженную экспрессию foxj1a.

В противоположность 3-OST-5, 3-OST-6 контролирует подвижность ресничек, не влияя на их длину, по-видимому, посредством иного пути, который необходим для нормальной экспрессии kif3b и нормального образования LR оси (Fig. 6). Т.о., 3-OST-6 является новым и специфическим регулятором подвижности ресничек, который контролирует организацию или поддержание плеч dynein в ресничках путем генерации определенного гликокода, отличающегося от такового, генерируемого с помощью 3-OST-5. 3-OST-6 морфанты имеют неподвижные, но нормальной длины реснички, что согласуется в относительно нормальной экспрессией у них генов foxj1a и rfx2 ciliogenic транскрипционных факторов. Др. неподвижные мутантные реснички имеют сходный фенотип с таковым морфантов 3-OST-6, такие как LR дефекты, обнаруживаемые у мутантов морских коньков (seahorse) (Serluca et al., 2009), и дефекты аксонемных плеч dynein, обнаруживаемые у мутантов ktu (Omran et al., 2008; Mitchison et al., 2012). Наблюдение, что нокдаун 3-OST-6 у эмбрионов в целом и нокдаун в DFC/KV приводят к разным spaw паттернам экспрессии, следовательно, помимо его клеточно-автономной роли в DFC/KV, 3-OST-6 может также выполнять роль в формировании LR паттерна в других клеточных клонах. Было бы интересно оценить возможность, что 3-OST-6 модулирует отличающийся сигнальный путь, чтобы контролировать транскрипцию kif3b и/или сборку плеч dynein в ресничках путем сортировки грузов. Кроме того, хотя 3-OST6 морфанты имеют очень отличающийся фенотип от того, что при модуляциях Fgf8/Fgf24/Fgfr1 пути, мы не исключаем возможности, что 3-OST-6 модулирует др. компоненты передачи сигналов FGF в DFC/KV или др. тканях.

Мы продемонстрировали, что отличающиеся пути передачи сигналов, регулируются с помощью 3-OST функций в клетках с ресничками. Эти находки подтверждают, что каждый член семейства 3-OST генерирует отличающийся компонент HSPG гликокода на клеточной поверхности клеток с ресничками, вообще-то размещая сульфатирование в специфическом контексте из др. региональных модификаций на HS цепочке (Cadwallader and Yost, 2013). Предыдущие сообщения продемонстрировали, что разные члены семейства 3-OST могут генерировать одни и те же сульфатированные дисахариды in vitro (Shworak et al., 1999; Xia et al., 2002; Xu et al., 2005). К сожалению, современная технология секвенирования HS ограничена приблизительно 6-14 дисахаридами из гомогенного источника in vitro (Stringer et al., 2003; Zaia and Costello, 2003; Thanawiroon et al., 2004; Saad and Leary, 2005; Volpi and Linhardt, 2010). In vivo, HS цепочки колеблются в размерах от 40 до 160 дисахаридов с гетерогенным составом (Esko and Selleck, 2002). Технические успехи в структурном анализе HS необходимы для определения экспериментально последовательностей разных гликокодов и в конечном итоге для определения механизмов, с помощью которых разные члены семейства 3-OST дают функционально отличающиеся гликододы HS. Мы полагаем, что каждый тип клеток использует отличающиеся комбинации членов семейства OST, чтобы создавать разные комбинации гликокодов на клеточной поверхности, чтобы позволить различать мириады межклеточных сигнальных путей, доступных во время развития позвоночных.