Большой массив различающихся типов клеток генерируется во время эмбрионального развития в ответ на относительно небольшое количество индуктивных сигналов. Объясняющий механизм описан C.H. Waddington в его книге "Организаторы и гены" [1]. В своей работе он предположил, что спецификация качественных особенностей клеток, возникающая в результате взаимодействия между "эвокаторами", внешними индуктивными сигналами, и специфическими внутренними реакциями ткани на индуктивный сигнал, который обозначен "компетентность". Согласно этому мнению индуктивные сигналы инициируют клеточную дифференцировку, но судьба индуцируется с помощью сигналов внутренне присущих отвечающим клеткам. Т.о., временной сдвиг в клеточной компетентности представляет собой способ увеличения разнообразия индуцируемых типов клеток, поскольку сохраняется контроль над паттерном, в котором они генерируются.

Одним из примеров этого является развитие нервной системы позвоночных. В спинном мозге используется хорошо упорядоченная генерация большого разнообразия молекулярно отличающихся типов клеток, включая нейроны, перерабатывающие сенсорную информацию, и контролирующие мышечные движения и миграцию клеток нервного гребня (NCCs), чтобы сформировать периферическую нервную систему [2]-[6]. Вентральная часть спинного мозга содержит двигательные нейроны (MNs) и промежуточные нейроны (V0-V3), а также морфологически отличающиеся не нейрональные клетки вентральной пластинки нервной трубки (FP) [6]. Эти типы клеток образуются из доменов предшественников, расположенных вдоль дорсо-вентральной оси, каждый из которых определяется экспрессией транскрипционных факторов, включая Olig2 (pMN), Nkx2.2 (p3) и Arx (FP) [7]-[10]. Напротив NCCs и промежуточные нейроны dI1-dI3 [3] продуцируются в дорсальной части нервной трубки. Как и в вентральной части нервной трубки, эти типы клеток могут быть отличены по их программам генной экспрессии - Snail2 и Sox10 в NCCs и Olig3 в dI1-3 предшественниках [11]-[13].

Стереотипическая организация типов клеток нервной трубки зависит от секретируемых факторов. Sonic Hedgehog (Shh), исходящие из FP и подлежащей хорды участвуют в формировании паттерна вентральной части нервной трубки [14]. Дорсальная часть нервной трубки формирует паттерн с помощью отличающегося набора сигналов, наиболее значимыми из них являются члены семейства TGFβ [15]. Некоторые исследования показали, что как дорсальные, так и вентральные сигналы функционируют как морфогены, чтобы регулировать дифференциальную экспрессию генов градированным способом [16]-[18]. Несмотря на это простой механизм морфогена, по-видимому, недостаточен для объяснения всего разнообразия клеток, продуцируемых с помощью этих факторов. Важно время, в течение которого клетки подвергаются действию Shh или BMP, это оказывает существенное влияние на генерацию типов клеток. Напр., индукция клеток FP, расположенных в наиболее вентральной части нервной трубки, нуждается в воздействии Shh во время раннего развития [10],[19]. Соответственно, предшественники, подвергнутые воздействию сходных количеств Shh, но в более позднее время развития дифференцируются в p3 предшественники V3 нейронов вместо клеток FP [10],[19]. Сходным образом, дифференцировка NCCs зависит от специфической по времени экспозиции дорсальных сигналов [20]. Нервные клетки, подвергнутые действию BMP4/7 в ранний временной отрезок дифференцируются в NCCs, тогда как нервные клетки, подвергнутые воздействию тех же самых сигналов в более поздние промежутки времени дифференцируются в дорсальные промежуточные нейроны [20].

Как нервные клетки меняют свою компетентность к индуктивным сигналам в зависимости от времени развития, неясно. Возможно, однако, что будучи первыми сгенерированными в задней части нервной пластинки, нейральные предшественники подвергаются воздействию передачи сигналов FGF, но по ходу развития осевая элонгация прерывает передачу сигналов FGF и предшественники подвергаются действию ретиноевой кислоты (RA), секретируемой соседними сомитами [21]. Переключение с FGF на передачу сигналов RA, как полагают, контролирует выбор времени дифференцировки нейронов в спинном мозге [22],[23]. Более того, репрессия с помощью передачи FGF сигналов Pax6, Irx3 и др. транскрипционных факторов, экспрессируемых в нейральных предшественниках, как полагают, вносит вклад в поддержание недифференцированного состояния [21]. Наделяет ли это состояние клеток компетентностью генерировать FP и NCC в ответ на соотв. индуктивные сигналы, неясно.

Мы исследовали сдвиг в генерации с FP на p3 и с NCCs на дорсальные промежуточные нейроны, чтобы идентифицировать механизмы, ответственные за изменение компетентности. Мы предоставили доказательства, что передача сигналов FGF, в ранних нейральных предшественниках, наделяет клетки компетентностью дифференцироваться в FP и NCCs в ответ на Shh и BMP, соотв. Более того, мы установили, что Nkx1.2, NK-1 транскрипционный фактор, регулируемый с помощью передачи сигналов FGF [24], обеспечивает эту компетентность и репрессирует экспрессию Pax6 и Irx3 [8],[21],[25]. В случае FP, совпадение Nkx1.2 с Shh-индуцированной экспрессией FoxA2 определяет домен, в котором будет дифференцироваться FP. Далее по мере удлинения оси и последующего снижения передачи сигналов FGF происходит подавление экспрессии Nkx1.2. Это затем позволяет клеткам генерировать предшественников вентральных и дорсальных промежуточных нейронов в ответ на передачу сигналов Shh и BMP. Следовательно, динамика клеточных движений управляет временными изменениями в передаче сигналов и генной экспрессии в нейральных предшественниках и это в свою очередь контролирует транскрипционную сеть, детерминирующую прирожденную компетентность клеток отвечать на морфогены, действующие вдоль ортогональных осей. Итак, эти данные выявили молекулярный механизм, с помощью которого взаимодействие между клеточной компетенцией и индуктивными сигналами увеличивает разнообразие типов клеток в нервной трубке и детерминирует их генерации.

Discussion

В данном исследовании мы описали молекулярный механизм, контролирующий пространственно-временную компетентность нейральных предшественников (Figure 7).

Figure 7. A model for the specification of FP and NCC. Cells in the posterior open neural plate area (pre-neural tube) (time T1) are exposed to FGF (drawn as a grey band). FGF and Nkx1.2 form a positive feedback loop and RAR/Irx3/Pax6 activity is low. Shh (red) and BMP (light blue) signal to progenitors at the poles of the forming neural plate. As a consequence of axis elongation, progenitors are displaced anteriorly into the neural tube, FGF signal decreases (time T2), and Nkx1.2 is down-regulated. Cells are no longer competent to induce FP or NCC. The combination of RAR/Irx3/Pax6 inhibits Nkx1.2 expression, either directly or indirectly (as indicated by the dashed line), and provides the competence for Shh and BMP signaling to induce the neuronal progenitors (time T3). doi:10.1371/journal.pbio.1001907.g007

Предыдущие исследования выявили, что спецификация NCC и FP зависит от онтогенетически более ранних индуктивных сигналов, чем спецификация предшественников подтипов нейронов [10],[20]. Наши данные предоставили доказательство, что такое предопределение времени обеспечивается с помощью передачи сигналов FGF. Исходящий из заднего полюса нервной трубки, FGF индуцирует экспрессию NK-1 гомеодоменового фактора Nkx1.2, чтобы предопределить регион компетентности FP и NCC. Определенный диапазон передачи сигналов FGF ограничивает этот регион компетентности каудальной частью пренейральной трубки [24],[35],[37]. Внутри этих клеток Shh, продуцируемый подлежащей мезодермой, инициирует индукцию FP путем активации FoxA2, передача сигналов BMP дорсально инициирует индукцию NCC. В этой позиции эмбриона степень передачи сигналов Shh и BMP ограничивает индукцию FP и NCC на проспективных вентральном и дорсальном полюсах нервной трубки, соотв. Т.к. по мере развития удлинение оси приводит к задней регрессии передачи сигналов FGF, ограничивая тем самым экспрессию Nkx1.2 и компетентность становиться FP/NCC каудальным регионом эмбриона. Более зрелые нейральные предшественники, которые покидают регион передачи сигналов FGF, лишены экспрессии Nkx1.2 и генерируют отличающиеся классы нейрональных предшественников в ответ на увеличение амплитуды передачи сигналов Shh и BMP. Итак, эти данные выявляют, как перемещения клеток, ответственные за элонгацию оси, эксплуатируются, чтобы изменить сигналы, воздействующие на предшественников и тем самым вызывать сдвиги в программах транскрипции клеток, которые меняют компетенцию проспективных нейральных клеток к индуктивным сигналам.

Transient FGF Signaling Provides FP and NCC Competence

Классические эмбриологические трансплантации предоставили первые доказательства, что сигнал, позднее идентифицированный как Shh, продуцируемый хордой, ответственен за индукцию FP [57]-[60]. Эти исследования также установили, что способность к индукции FP ослабляется, когда нейральные клетки созревают. Эта потеря компетентности ограничивает спецификацию FP вентральной срединной линией нервной трубки путем ограничения гомеогенетической индукции FP [57]. Наше исследование выявило молекулярный механизм, объясняющий эти наблюдения. Пересечение передачи сигналов FGF и Shh ограничивается регионами нервной пластинки, непосредственно кпереди от регрессирующего узелка (Figure 5W,X). Эта функция передачи сигналов FGF дополняет её ранее идентифицированную роль как ингибитора нейрональной дифференцировки в этом регионе эмбриона [21],[48]. В этих регионах низкие уровни Shh, испускаемого клетками осевой мезодермы, подразумевают, что только клетки, экспрессирующие Nkx1.2, и получающие достаточно Shh, чтобы индуцировать FoxA2 являются теми самыми клетками вентральной срединой линии [10],[61].

Функция передачи сигналов FGF и Shh в индукции FP также подтверждается данными по направленной дифференцировке ES клеток в допаминергические нейроны [62],[63]. Этот тип клеток генерируется с помощью FoxA2-экспрессирующих предшественников на вентральной срединной линии среднего мозга , а их in vitro дифференцировка нуждается во временной передаче сигналов FGF во время периода, когда ES клетки приобретают нейральную судьбу [63],[64].

Совпадение передачи сигналов FGF и BMP необходимо для спецификации NCC. Это согласуется с исследованиями, касающимся передачи сигналов FGF в спецификации NCC (экспрессия Pax7, Zic1 и Msx1) на ст. гаструлы [65],[66] и в последующей детерминации судьбы нервного гребня с помощью BMP и др. сигналов (напр., Wnt, Notch) [67]. Функциональное отличие между FGF, Wnt и Notch в спецификации NCC остается неясным. Несмотря на это наши данные указывают на участие регуляторных сетей, по крайней мере, между FGF и Wnt, поскольку FGF индуцирует экспрессию Nkx1.2, которая в свою очередь индуцирует экспрессию гена Wnt (Figure S4K). Следовательно, в дорсальной и вентральной части нервной трубки пересечение передне-задней передачи сигналов FGF с дорсо-вентральной передачей сигналов морфогена создает пространственный и онтогенетический временной промежуток, детерминирующий индукцию типов клеток, характеризующих полюса нервной трубки.

Напротив, изучение эмбрионов кур подтвердило, что эктопическая экспрессия FGF ингибирует спецификацию и эмиграцию NCC [56]. Отсутствие индукции NCC в этих экспериментах может быть обусловлено продолжительной активацией передачи сигналов FGF, поскольку наше исследование показало, что длительное воздействие FGF ингибирует продукцию NCC (Figure S8N-P?). , следовательно, передача сигналов FGF временно необходима для становления компетентности NCC, но её длительная активность блокирует выработку качественных особенностей NCC [56]. Индукция FP также обнаруживает сходную потребность во временной передаче сигналов FGF (Figures 1K-N? and S2J,K). In vivo быстротечность передачи сигналов FGF детерминируется с помощью задней регрессии источника FGF, управляемой элонгацией оси [68]. Последовательное подавление передачи сигналов FGF в нервной ткани по мере того, как она инкорпорируется в нервную трубку, позволяет поэтому приобретение качественных особенностей FP и NCC, которые специфицируются раньше. Этот механизм использует тканевой морфогенез, чтобы координировать прогрессию приобретения качественных особенностей с общей динамикой развития эмбриона.

Потеря передачи сигналов FGF также способствует подавлению экспрессии Nkx1.2 и изменению компетентности предшественников, не не приобретших качественные особенности FP или NCC. Эти клетки теперь отвечают на дорсальные и вентральные морфогены, приобретая характеристики нейрональных предшественников. В вентральной части нервной трубки повышение уровней продукции Shh индуцирует качественные характеристики p3 в клетках дорсальнее предшественников FP и MN на большем расстоянии [17]. Дорсальные предшественники dI1-3 нейронов индуцируются с помощью передачи сигналов BMP [20]. Итак, эти данные выявляют, как клеточные перемещения, которые управляют элонгацией оси, предоставляют временной механизм для изменения компетентности путем контроля комбинации сигналов, воздействующих на клетку. Это увеличивает разнообразие типов клеток, генерируемых в нервной трубке и гарантирует их правильную временную и пространственную генерацию.

Nkx1.2 Establishes the Competence for the FP and NCC Differentiation

Компетентность сформировать предшественники FP и p3, по-видимому, взаимно исключающая, также как и образование NCC и дорсальных промежуточных нейронов. FGF, как было установлено, блокирует индукцию Shh-зависимых подтипов нейронов в вентральной части нервной трубки и экспрессию транскрипционных факторов, определяющих предшественников этих нейронов [21],[25]. Это, по-видимому, не является следствием существенных изменений в трансдукции сигнала Shh (Figure S2I). Скорее всего, передача сигналов BMP в нейральные предшественники, по-видимому, не затрагивается передачей сигналов FGF (Figure S8K). Более того, индукция качественных особенностей FP и NCC в клетках, воспринимающих передачу сигналов FGF подтверждает, что не существует полной блокады спецификации новых клеточных характеристик. Вместо этого передача сигналов FGF, по-видимому, действует путем регуляции экспрессии ряда транскрипционных факторов в нейральных предшественниках, чтобы трансформировать транскрипционную программу, индуцированную с помощью Shh или BMP.

Наше внимание было сфокусировано на Nkx1.2, т.к., по-видимому, он обеспечивает FGF-зависимую компетентность к дифференцировке FP и NCC. В подтверждение этого ген Nkx1.2 (Nbx) у Xenopus [69] экспрессируется в области презумптивного нервного гребня и важен для дифференцировки нервного гребня. Тем не менее мутации Nkx1.2 у эмбрионов мыши, по-видимому, не затрагивают генерацию FP или NCC [70]. Перекрываемость паралогов Nkx1.1 и Nkx1.2 может объяснить это кажущееся расхождение. И Nkx1.1 и Nkx1.2 экспрессируются в сходных регионах каудальной части, а индукция экспрессии Nkx1.1 оказывает сходные эффекты на Nkx1.2 (Figure 5U and unpublished data). Создание компаундных мутантных мышей, лишенных обоих генов позволит проверить это предположение. Альтернативно функциональное перекрывание может существовать среди широкого круга транскрипционных факторов в каудальной части нервной трубки и важно понять их функцию и транскрипционную сеть, которая их соединяет.

Недавнее исследование идентифицировало изменения в структуре хроматина высокого порядка специфических генов, когда клетки переходят от пренейральной к нейральной трубке [71]. Как эти изменения обеспечиваются ещё предстоит определить. Возможно, что Nkx1.2 регулирует модификаторы хроматина или факторы, управляющие модификаторами хроматина, в соотв. регионах генома. Альтернативно др. мишени для передачи сигналов FGF, независимые от Nkx1.2, могут быть ответственны. Независимо от механизма необратимые изменения в структуре хроматина могут объяснить, почему клетки, которые потеряли свою компетентность дифференцироваться в FP не восстанавливают её даже после воздействия FGF. В этом контексте очевидно, что в развитии поджелудочной железы репрессия экспрессии Arx контролируется с помощью метилирования CpG островков внутри гена Arx [72]. Такой механизм возможно прямо не приложим к нервной трубке, поскольку нейральные экспланты, обработанные 5-aza-dC, агентом, деметилирующим ДНК, не изменяют экспрессии ключевых паттерн-формирующих генов. Идентификация и детальный анализ регуляторных регионов и эпигенетических меток необходим для выяснения соотв. механизма в будущем.

A Gene Regulatory Network for FP and NCC Competence

Экспрессия Nkx1.2, репрессирует активность транскрипционных факторов нейральных предшественников, включая Pax6 и Irx3 (Figure S4E-K). Напротив, наши эксперименты и ранее опубликованные работы показывают, что Pax6, Irx3 и передача сигналов RA ингибируют дифференцировку FP и/или NCC [19],[21],[73], поскольку способствуют приобретению характеристик нейральных предшественников. Хотя неавтономные эффекты Nkx1.2 могут вносить вклад в клеточно автономную взаимную перекрестную репрессию между альтернативными состояниями транскрипции, возобновление темы онтогенетических решений, по-видимому, наиболее вероятное объяснение пространственного и временного перехода между разными состояниями компетентности. В самом деле перекрестно репрессивные взаимодействия очевидны между транскрипционными факторами, которые детерминируют отличающиеся домены предшественников вдоль дорсо-вентральной оси нервной трубки [74]. Т.о., по-видимому, существует общая логика, лежащая в основе механизмов транскрипции как вдоль дорсо-вентральной, так и ростро-каудальной оси нервной трубки.

Очевидно, что будучи индуцированным с помощью передачи сигналов FGF, Nkx1.2 также способствует экспрессии FGF (Figure 3I). Это образует петлю обратной позитивной связи, поддерживающей состояние компетентности FP/NCC. Это напоминает позитивную петлю обратной связи между экспрессией FoxA2 и Shh, которая характерна для собственно FP. В обоих случаях петли обратной связи функционируют, чтобы репрессировать Pax6/Irx3 клеточно-автономным способом (Figure S4L-O?) и должны быть прерваны, чтобы ограничить гомеогенетическую индукцию клеток FP [57],[58]. В случае петли FoxA2-Shh изменения в компетентности предшественников, обусловленные подавлением передачи сигналов FGF, ответственны за прекращение работы петли обратной связи. В случае петли FGF-Nkx1.2, скорее всего, что передача сигналов RA будет прекращать позитивную обратную связь. RA, исходящая из сомитов, соседних с созревающей нервной трубкой образует рострально-каудальный градиент как в нервной ткани, так и в параксиальной мезодерме, который противодействует продуцируемому сзади FGF [21]. В соотв. с этим доминантно-негативный RAR эффектор достаточен, чтобы индуцировать экспрессию Nkx1.2 в клетках, которые д. иным способом подавлять его экспрессию [Figure 4J(v)]. Т.о., удлинение оси не только приводит к задней регрессии источника FGF, но и также подвергает клетки воздействию передачи сигналов RA [21]. Как только RA начинает продуцироваться в сомитах, индуктивный эффект на Pax6/Irx3 за счет RA преодолевает репрессивный эффект Nkx1.2 на их экспрессию и клетки меняют компетентность в ответ на Shh или BMP, и это способствует переходу компетентности, усложняя пространственный и временной контроль над переходом (Figure 7).

Детали транскрипционной сети, контролируемой Nkx1.2, действующей, чтобы индуцировать судьбу FP или NCC в ответ на передачу сигналов Shh или BMP, остаются плохо изученными. Ряд транскрипционных факторов, ответственных за предопределение качественных характеристик премиграторных NCC, известен в деталях и было бы интересно проверить, как Nkx1.2 влияет на эту сеть [75]. Для дифференцировки FP ситуация неясна. Наши данные подтверждают, что FP специфицируется в течение 12 ч после инициации передачи сигналов FGF и Shh. Тем не менее требуется более 30 ч до начала экспрессии генов созревания FP, таких как Arx, Nato3 и HES1 (Figure 1J and unpublished data). Мы ожидали, что транскрипционные механизмы должны сменять непосредственные мишени для передачи сигналов FGF (Nkx1.2) и передачи сигналов Shh (FoxA2), чтобы регулировать гены созревания FP.

Итак, данное исследование предоставило новую информацию о том, как происходит взаимодействие между клеточной компетентностью и индуктивными сигналами, контролирующее формирование паттерна и увеличение разнообразия типов клеток в нервной трубке. Поразительным свойством этого механизма является то, что он комбинирует морфогенетические перемещения развивающегося эмбриона с сигналами, действующими вдоль ортогональных осей, чтобы определить место и время изменения компетентности. Динамика этих взаимодействий предлагает способ связанных изменений в индивидуальных клетках в ответ на общее развитие эмбриона.

Integration of Signals along Orthogonal Axes of the Vertebrate Neural Tube Controls Progenitor Competence and Increases Cell Diversity Noriaki Sasai,Eva Kutejova,James Briscoe PLoS Biol 12(7): e1001907. DOI: 10.1371/journal.pbio.100190

Integration of Signals along Orthogonal Axes of the Vertebrate Neural Tube Controls Progenitor Competence and Increases Cell Diversity
Noriaki Sasai,Eva Kutejova,James Briscoe
PLoS Biol 12(7): e1001907. DOI: 10.1371/journal.pbio.100190