Осуществление адаптивной реакции к изменениям сил нуждается как ощущающих силы, так и отвечающих на силы механизмах. Некоторые белки, рекрутируемы на актиновые структуры посредством своих LIM доменов зависимым от сил способом содержат также эффекторые домены, которые рекрутируют и регулируют передачу сигналов белков, регулирующих актин. Следовательно, LIM доменовые белки, по-видимому, приспособлены обеспечивать адаптивные ответы SF's на силовые воздействия.
LIM домены обладают двойными цинковые пальчики белок-белок или белок-ДНК связывающими интерфейсами [37]. LIM доменовые белки содержат множественные LIM домены, которые скоординировано взаимодействуют с широким набором связывающих партнеров. Хотя структурный стержень из цистениновых и гистидиновых аминокислот, которые координируют цинк, чрезвычайно консервативен, LIM домены содержат также участки с варьирующими последовательностями, которые участвуют в специфическом связывании с высоким сродством [37]. Хотя большинство LIM доменовых белков содержат др. функциональные домены, которые обеспечивают их участие в широком круге биологических процессов, эти функции преимущественно зависят от взаимодействий, обеспечиваемых LIM доменами [37].
Протеомные исследования показали, что LIM доменовые белки, такие как Hic-5, paxillin, CRP2 и zyxin чувствительны к механическим стрессам в актиновом цитоскелете 22 and 23. Кроме того, эти белки могут играть разные роли в регуляции динамики актинового цитоскелета. Среди этих белков, zyxin подвергся экстенсивному исследованию относительно его роли в осуществлении регуляции сил в актиновом цитоскелете, и он может служить образцом для понимания роли и др. LIM доменовых белков в регуляции динамики цитоскелета. В самом деле, ранние исследования zyxin установили, что это ассоциированный с цитоскелетом LIM доменовый белок [38], а дальнейшие работы детализировали его роль как регуляторного для актина белка [39], участвующего в подвижности клеток 40 and 41.
Zyxin обнаруживает динамическую реакцию на изменение сил и регулирует ремоделирование и репарацию SF путем рекрутирования многих актин регулирующих партнёров по связыванию. Динамика Zyxin в ответ на истончение актиновых SF видна на изображениях живых клеток, с флуоресцентно меченными белками (Figure 1B and Movie S1 in the supplementary material online) [20]. Недавно LIM доменовый адаптерный белок paxillin, как было установлено, является чувствительным к механическим воздействиям и подобно zyxin, участвует в репарации SF
25 and 26.
LIM proteins regulate SF assembly and remodeling
Вентральные SFs часто перекрывают длину вентральной поверхности клеток, помещенных на 2D субстраты, хотя длина и морфология могут очень сильно варьировать от типа клеток и субстратов. Вентральные SFs имеют FAs на обоих концах, это позволяет прикрепляться к субстрату, позволяя тем самым вентральным SFs непосредственно вытягиваться при растягивании субстрата (Figure 1A). Сборка вентральных SFs нуждается в участии некоторых дополнительных SFs, также, как и в различных LIM-ассоциированных белках. Три LIM доменовых белка, как было установлено, рекрутируются на SFs в ответ на растяжение: Hic-5 [24], CRP2 [24] и zyxin [21]. Хотя остается возможным, что Hic-5 и CRP2 регулируют механистически индуцированную сборку и ремоделирование SF, кстати, только для zyxin это было показано чётко [21].
Сборка вентральных SF инициируется посредством слияния поперечных арок и дорсальных фрагментов SF (Box 1) [17], а позднее формируются комплексы, высоко динамичные, сцепленные сети внутри клеток (Figure 1B and Movie S1 in the supplementary material online). Кроме того, вентральные SFs удлиняются благодаря зависимой от силовых воздействий de novo полимеризации актина, происходящей на FAs [17]. Подобно сборке FA, активация Rho GTPase индуцирует сборку SFs [50]. Rho активирует formin семейство из nucleators актина, чтобы стимулировать полимеризацию актина 18 and 51, при этом ГТФ-связанная Rho активирует Rho-associated protein kinase (ROCK), впоследствии запускающей контрактильность за счет фосфорилирования лёгкой цепи миозина [52]. Без определенного минимального уровня базирующейся на миозине контрактильности, SFs рассеиваются [52], подтверждая, что миозин необходим для агрегации актиновых филамент в SFs. В самом деле, в бесклеточных системах смесь актиновых филамент и myosin II достаточна, чтобы в ответ на активацию АТФ произошла самосборка сократительных пучков [53]. Активность миозина также важна для формирования и поддержания FAs и, следовательно, для поддержания стабильных соединений с субстратом [52]. Однако, потребность в активности миозина может не быть строго обусловлена натяжением, генерируемым контрактильностью миозина, поскольку роли зависимого от миозина ретроградного тока и образования пучков также предполагаются 54 and 55.
Во время сборки SF zyxin оттекает прочь от FAs синхронно со сборкой новых пучков актина, тогда как FA белки vinculin и paxillin остаются на FAs [56]. Этот ретроградный отток zyxin, который зависит от сил и нуждается как в активности Rho киназы, так и в контрактильности миозина [56], указывает на роль zyxin в de novo генерации SF. Разные данные подтверждают эту гипотезу. Микроскопия флуоресцентно меченного актина в клетках, сделавшихся проницаемыми после воздействия детергента, показали, что инкорпорация актина высокая в zyxin-богатые FAs, и инкорпорация актина снижается, когда локализация zyxin смещается за счет избыточной экспрессии zyxin LIM домена [57]. Более того, лёгкий сдирающий стресс в клетках, сходный с интерстициальным током жидкости, индуцирует структуру околоядерной актиновой шапочки, которая не способна формироваться в отсутствие zyxin [58]. Наконец, atomic force микроскопия, которая используется для измерения силы клеточной адгезии [59], показала снижение тянущих усилий в местах контактов клетки с фибронектиновым кусочком, когда экспрессия zyxin подвергнута нокауту с помощью RNAi [60].
Роль zyxin в зависимой от силовых воздействий регуляции актина на SFs не ограничивается интерфейсом FA/SF. Клетки фибробластов отвечают на не осевые циклические растяжения в ходе ремоделирования клеток, которое включает усиление актиновых SF и перпендикулярную смену ориентации SF по отношению к оси растяжения [21]. Вместе с утолщением актиновых SF, циклические растяжения стимулируют мобилизацию zyxin из FAs на SFs [21], подтверждая, что локализация zyxin важна для процесса ремоделирования актина. Как происходит подобная релокализация? В предварительных экспериментах, где zyxin, нагруженный способным к фотоактивации GFP был фотоактивирован в одиночных FAs, Zyxin-GFP распространялся без предпочтений на SFs, прикреплённые к фотоактиврованным FA, и на SFs и FAs, не присоединённые к фотоактивированным FA (unpublished); однако, дальнейшие эксперименты необходимы, чтобы оценить эту находку. Тем не менее имеются результаты, подтверждающие, что предпочтительным способом перераспределения является тот за счет быстрого обмена и диффузии в цитоплазме. В отсутствие zyxin, усиление SF в ответ на не осевые натяжения устраняются, но смена ориентации сохраняется [21]. С помощью разных экспериментальных подходов наблюдалась зависимая от натяжения динамика zyxin на SFs, где zyxin диссоциировал от SFs при этом ослаблялось натяжение посредством лазерного разрезания и обратно рекрутировался на SFs в ответ на AFM stylus-управляемую индукцию натяжения [61].
Локализация zyxin на FAs также зависит от силовых воздействий. Восстановление флюоресценции после photobleaching было использовано для отслеживания изменений в диссоциации zyxin после устранения тракционных сил. Силы были уменьшены путем воздействия, Rho-ассоциированного киназного ингибитора, Y27632, femtosecond pulsed laser устранения проксимально прикрепленного SF, или помещения жидкого субстрата и была продемонстрирована повышенная скорость диссоциации для zyxin, когда натяжение было устранено [62].
Целенаправленное воздействие многих актин регулирующих белков на специфическое положение на цитоскелете в соотв. время является критическим для SF реакции и функции. Белки Ena/VASP являются регуляторами актина, которые соединяются с колючими концами актина и способствуют удлинению филамент [63]. Zyxin необходим для рекрутирования Ena/VASP на FAs, и чтобы механически стимулировать SFs 21 and 41, поскольку разрушение взаимодействия zyxin-VASP вызывает неправильное расположение VASP и нарушает ремоделирование актина [64]. Эта находка указывает на то, что zyxin действует как цитоскелетных адаптерный белок, поставляющий VASP в места ремоделирования актина.
Подобно zyxin, LIM доменовые белки Hic-5 и CRP2 поставляются на SFs в ответ на циклические натяжения и негативно влияют на клеточную контрактильность [24]. Однако в отличие от zyxin, каркасные белки, чья роль в регуляции цитоскелета, по-видимому, ограничена поставками актиновых регуляторов, Hic-5 и CRP2 могут регулировать контрактильность посредством передачи сигналов G-белка, хотя это предположение остается не проверенным. Потеря функции Hic-5 у
Hic-5 нокаутных модельных мышей приводит к усилению апоптоза как в случае повреждений бедренной артерии, так и в случае растяжения, культивируемых сосудистых гладкомышечных клеток [65]. Более того, культивируемые Hic-5-нулевые клетки обнаруживают снижение актиновых SFs после растяжения по сравнению с клетками дикого типа. Уменьшение SFs в
Hic-5 -нулевых клетках сопровождается дисперсией FA белка vinculin, подтверждая, что стабилизация vinculin в FAs с помощью Hic-5 обеспечивает резистентность к апоптозу, вызываемому растяжением [65]. CRP2 взаимодействует c LIM доменовым Hic-5[24], но неизвестно, отвечает ли это взаимодействие за зависимое от растяжения рекрутирование на SF любого из белков. Хотя и Hic-5, и CRP2 концентрируются на SFs в ответ на растяжение и регулируют функцию цитоскелета, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить их роль в ремоделировании и сборке SF.
LIM proteins mediate SF repair
Актиновые SFs подвергаются стохастическим циклам истончения и репарации (удлинение за счет растяжения, сопровождаемое восстановлением актина и механической стабилизацией) [20] (Figure 3A). Traction-force микроскопия для измерения деформации субстрата под FAs, показала, что прикрепленные SFs, которые лежат в основе локальных событий растяжения находятся под повышенным натяжением (tension) перед инициацией события растяжения. Как только начинается событие растяжения, то напряжение спадает, вследствие постепенного возврата к натяжению базового уровня, что сопровождается восстановлением структуры актина. В этом случае механическая реакция, по-видимому, запускается за счёт разрушения актиновых пучков [20]. В самом деле, если место растяжения неспособно к репарации, то сегменты SF втягиваются в прикрепленные FAs.
Figure 3.
Development of a stress fiber strain site. (A) Stress fibers have a periodic, muscle sarcomere-like structure with non-muscle myosin interleaved between α-actinin and zyxin-rich densities. Increasing tension on the stress fiber, possibly because of myosin contractility, induces spontaneous ruptures, resulting in rapid elongation of the site and thinning of the actin structure. This generates actin free barbed ends and triggers recruitment of a zyxin-dependent repair system comprising ?-actinin and vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP). Resolution of the strain site is characterized by a reinforced actin bundle and insertion of new sarcomeric units. (B) Hypothetical model of zyxin mechanoresponse.
Места растяжения SF рекрутируют, по крайней мере, 4 разных белка, обнаруживаемых в FAs: zyxin, paxillin, α-actinin и VASP 20, 25 and 26. Однако, места растяжения SF не содержат vinculin, характерный для FA белок, который связывает интегрины с актиновым цитоскелетом [20], и они не обнаруживают обнаружимые уровни FA киназы или усиление активации фосфотирозина [25]. Кроме того, места растяжения SF не созревают в FAs и не обнаруживают каких-либо доказательств прикрепления к субстрату. Вместо этого они восстанавливаются в зрелые, покрытые полосками SFs, часто с дополнительными новыми саркомерными единицами 20 and 66. Следовательно, места растяжения SF не являются, по-видимому, FAs. Эти данные подтверждают, что субнабор актин-регуляторных компонентов в FAs может устранять (resolve) места растяжения SF в отсутствие обеспечиваемой интегринами трансмембранной адгезии. Принимая во внимание параллелизм между FAs и этим 'focal repair complex', др. LIM белки могут целенаправленно направляться в эти места, где они смогут осуществлять функции, сходные с таковыми, что осуществляются в FAs.
LIM белки участвуют в обеспечении этой репарации SF. Напр., LIM белки zyxin и paxillin быстро поставляются в места растяжений SF; однако, зависит ли это от рекрутирования др. белков, об этом ниже [25], и в отличие от zyxin, paxillin не рекрутируется на SFs в клетках, подвергающихся циклическим растяжениям [24]. В клетках, лишенных или zyxin, или paxillin, места растяжений SF неспособны к репарации, что приводит к достоверному увеличению частоты катастрофических разрывов SF [20]. Клетки, лишенные zyxin, неспособны генерировать нормальные уровни растягивающий усилий, подтверждая, что неспособность стабилизировать разрывы в SF снижает допустимую нагрузку SFs [20].
Репаративные функции zyxin осуществляются с помощью связывающего поперечно актин α -actinin и регулятора актина VASP, которые рекрутируются в места растяжений SF зависимым от zyxin способом [20]. α-Actinin связывает N-регион в zyxin. Укорочение на 42 N-терминальные аминокислоты zyxin разрушает связывание α -actinin c zyxin, это существенно снижает накопление α -actinin в местах растяжения SF, приводя к почти полной потере репарации актина [20]. Эта мутация в zyxin не нарушает поставку zyxin в места растяжения SF, указывая, что хотя α -actinin соединяется с actin и zyxin, α -actinin, по-видимому, не играет роли в рекрутировании zyxin. В клетках с нормальным zyxin, рекрутирование α -actinin в места растяжений слегка запаздывает по сравнению с zyxin, подтверждая, что zyxin поставляется первым, а затем zyxin рекрутирует α-actinin [20]. Связывание zyxin с VASP необходимо для поставки VASP на или циклически растягиваемые SFs [21] или в места растяжений SF [20]. Мутации в богатых пролином ActA повторах в N-терминальном регионе zyxin устраняет связывание VASP с zyxin, предупреждая тем самым рекрутирование VASP в места растяжений SF и приводя к неспособности стабилизировать элонгацию [20]. Неспособность стабилизировать элонгацию, в данном случае, может возникать в следствие более медленного накопления, наблюдаемого у этих мутантов zyxin или в следствие потери роли VASP облегчать элонгацию актиновых полимеров [46]. В клетках с не мутантным zyxin, VASP поставляется синхронно с zyxin [20]. В соответствии с его ролью адапторного белка, эти данные подтверждают, что главной функцией zyxin в репарации мест растяжения SF является рекрутирование регуляторов актина α -actinin и VASP [20] (Figure 3B).
LIM domain proteins: recruitment to SFs
Как LIM белки поставляются зависимым от силовых воздействий способом на актиновый цитоскелет? Было установлено, что укороченная форма zyxin экспрессируется только в LIM доменах, расположенных обычно в SFs и FAs и, подобно дикому типу, рекрутируется строго на SFs с растяжениями [64] и в места растяжений SF [25]. Мутант zyxin, лишенный своего C-концевого LIM домена, сохраняет слабую способность локализоваться на FAs, но не обнаруживает рекрутирования на SF в ответ на растяжения [64] или места растяжений (strain) [25]. Поскольку многие из партнеров по связыванию zyxin's по N-концу, включая α -actinin и VASP, также непосредственно соединяются с actin, а zyxin никогда не обнаруживает связывания с актином непосредственно, то партнеры по связыванию с zyxin's N-концом могут рекрутировать zyxin на SFs. Однако исходя из доказательства, что LIM домены необходимы и достаточны для рекрутирования, то эта гипотеза не подтверждается.
Подобно zyxin, LIM домены в paxillin необходимы и достаточны для рекрутирования в места растяжений SF [25] на FAs [67], и LIM домены Hic-5 необходимы для поставки в растянутые SFs [24]. Для всех изученных пока в деталях LIM доменовых белков, рекрутирование на SFs зависит от LIM доменов. Однако механизм управляемого силовыми воздействиями рекрутирования LIM домена на структуры цитоскелета остается открытым и активно исследуется. Ключ к разгадке этого вопроса может зависеть от локализации zyxin и paxillin в местах растяжений SF, как было описано выше. Эти события, по-видимому, являются неполными разрывами актиновых пучков в ответ на повышение натяжения [20]. Рекрутирование zyxin, по-видимому, происходит непосредственно из мощного цитоплазматического пула (Figure 3A). Рекрутирование zyxin специфически ограничено регионом разрывов, указывая, что сигнал для рекрутирования находится внутри этого региона, а не возникает в результате более дистальной системы передачи сигналов, таких как прикрепленные FA или локальные стресс-воспринимающие мембранные каналы. Более того, места растяжений (разрывов) SF богаты свободными колючими концами актина [20] и являются местами быстрой полимеризации актина, которая необходима для обеспечения репарации. Как было отмечено ранее, zyxin также обогащен в FAs и ретроградных токах [56] (Box 2), которые направлены к обоим сайтам полимеризации актина. Хотя это формально не наблюдалось, но zyxin может непосредственно соединяться с растянутым актином или соединяться благодаря его ассоциации с не идентифицированным линкерным белком, служащим в качестве 'first responder', перекидывая мостики через разрывы между стрессовым цитоскелетом и zyxin LIM доменами. Молекулярная метка актиновых SF, которая активирует накопление zyxin в ответ на растяжение, может быть ассоциирована с аппаратом полимеризации актина. Рекрутирование zyxin's на цитоскелетные структуры в присутствии натяжения может управляться с помощью вновь возникших колючих концов актина, конформационных изменений или пост-трансляционных модификаций в актине или в партнерах по связыванию zyxin (Figure 3B). Определение, какой из механизмов регулирует механочувствительность zyxin предоставят будущие исследования.
|
|
Box 2.
Local response to global stress
Zyxin responds rapidly to various signals through highly localized accumulation on cytoskeletal structures. These signals include internally driven contractility modulation and externally derived forces. The zyxin response varies according to the signal.
FA maturation. This requires either myosin II contractility or application of external force [71]. As adhesions mature, they become larger and accumulate higher levels of zyxin. These mature adhesions exhibit lower levels of traction-force transfer to the substrate [72], suggesting more of an anchoring than a mobilizing function. Several studies in which attached SFs were either severed or tugged on showed that zyxin-binding kinetics decreased with a drop in tension [62] or increased with higher tension [61].
Retrograde fluxes. These are displacements of actin and FA proteins along FA-proximal SFs. As such, they have the appearance of comet tails. Proteins identified in fluxes include zyxin and VASP, as well as FAK. Zyxin movement in fluxes tracks with the flow of actin [56]. Fluxes can be enhanced through immobilization on micropatterned islands, applied stretching forces, or plating on stiff substrates. Relief of SF contractility through blebbistatin treatment eliminates fluxes. Also of note, fluxes are dependent on tyrosine phosphorylation at FAs [56].
SF strain sites. These are localized regions of SFs that undergo rapid extension accompanied by thinning and subsequent recovery of actin ( Figure 1B). These sites are initiated by increasing tension in the SF that the strain event relieves. Zyxin recruits ?-actinin and VASP to the strain site, where they aid repair. Failure to repair strain sites by the zyxin-dependent repair mechanism results in catastrophic rupture and retraction of the SF [20]. Recent work has shown that paxillin has a role in strain site repair independent of zyxin 25 and 26.
Global SF thickening. Global SF thickening in response to cyclic stretch also occurs through a zyxin-dependent mechanism. Uniaxial cyclic stretch results in thickened SFs aligned perpendicular to the axis of stretch, suggesting an orientation that attempts to minimize mechanical stress to the SF. Thickening is accompanied by extensive localization of zyxin on the SF [21]. Global thickening and zyxin recruitment are also induced by jasplakinolide-induced actin stabilization [21]. |
Concluding remarks
Although this review focuses on the role of LIM proteins in the assembly and regulation of ventral SF response to force, similar mechanisms may also exist for other types of SF. Recent discoveries detailing zyxin's tension-sensitive response and roles in the regulation of actin dynamics have opened new ways of thinking about mechanoresponse and mechanotransduction. First, current data indicate that the mechanically induced accumulation of zyxin on the cytoskeleton is dependent on SF-resident features. Although molecular details remain elusive, the signal that recruits zyxin from the cytoplasm appears to be the strained actin structure (Figure 1B). Thus, the zyxin-mediated repair system resembles DNA break repair wherein a lesion is identified and the stabilization and repair system accumulates at the site of the break. Characterizing how the stress signal is communicated to the repair system will be helpful in understanding how zyxin and the many other mechanoresponsive LIM domain proteins function. Second, the characterization of the bipartite structure and function of zyxin, with a LIM region dedicated to targeting and a separate region dedicated to actin regulation, may be relevant for understanding how other LIM proteins function (Figure 2). Third, it is clear that the cytoarchitecture is highly dynamic and thus requires active management to maintain its structural and organizational functions. Although this involves cell-wide stress responses such as upregulation or downregulation of cytoskeleton components, targeted repair of strain sites [20] and addition of new sarcomeres in the middle of SFs [66] indicate that there is a tightly targeted response to spatially restricted sites of strain (Figure 3). Investigating how these mechanically stressed sites are sensed and repaired will provide further insights into how cell structure is fine-tuned to maintain homeostasis. Finally, as noted previously, the LIM domains of both zyxin and paxillin are recruited independently to SF strain sites 25 and 26. However, unlike zyxin and Hic-5, paxillin is not recruited to cyclically stretched SFs [24]. Thus, although LIM proteins as a group appear to share the capacity to accumulate on actin structures in response to increased contractility or mechanical stress, they do so with a degree of specificity that suggests the involvement of additional regulatory controls that enhance or limit the participation of specific proteins to specific physiological circumstances. Understanding the regulation of mechanoresponse specificity provides a compelling challenge for future research.
