Кости свода черепа развиваются в тесном контакте с эмбриональной кожей, чтобы заключить головной мозг. У эмбрионов мыши кость формирующие остеобласты и кожу формирующие фибробласты, происходят из краниального нервного гребня и параксиальной мезодермы [1]. На ст. E11.5, предшественники краниальных дермальных фибробластов подвергаются спецификации под поверхностью эктодермы, тогда как предшественники остеобластов специфицируются в глубоком слое краниальной мезенхимы выше глаз [2]-[4]. Впоследствии предшественники остеобластов пролиферируют и мигрируют апикально под дермальных предшественников [1], [4]. Оба типа клеток секретируют коллаген в качестве внеклеточного матрикса, но кости черепа предоставляют физическую защиту головного мозга, тогда как, лежащая поверх, дерма осуществляет целостность кожи и служит прибежищем эпидермальных придатков [5].

И паракринные и аутокринные межклеточные сигналы участвуют в развитии ранней кости и кожи. При формировании черепно-лицевых костей мезенхима предопределяет время оссификации [6], [7], тогда как поверхностная эктодерма функционирует пермиссивным (дозволяющим) способом [8]. Скорее всего, во время формирования кожи эктодермальные сигналы важны для формирования главного дермиса для образования волосяных фолликулов [9], [10], но краниальная дермальная мезенхима детерминирует качественные особенности эпидермальных придатков, таких как волосы или перья [11]. Дальнейшее выявление специфической передачи эктодермально-мезенхимных сигналов во время раннего развития костей и дермы нуждается в преодолении трудностей при осуществлении замещений соединительной ткани.

Трансдукция мезенхимных канонических сигналов Wnt/β-catenin важна для спецификации и морфогенеза как черепно-лицевой дермы, так и кости [2], [3], [12]-[15], а нарушение регуляции компонентов таких сигнальных путей ассоциирует с болезнями костей и кожи [1], [2],[16]-[18]. Wntless (Wls) функционирует специфически в переносе Wnt лигандов и необходим для эффективной секреции Wnt лигандов. [2]-[4], [19]-[28]. Генетическая делеция Wls у мышей, скорее всего, драматически редуцирует уровни активных Wnt лигандов и может воспроизвести фенотипические отклонения, получаемые при генетическом устранении Wnt лигандов у мышей [1], [4], [29]. Wnt лиганд соединяется с рецепторами мишенями на клеточной поверхности Fzd и LRP5/6, приводя к транслокации в ядро β-catenin, который соединяется с TCF/LEF транскрипционными факторами и активирует экспрессию нижестоящих мишеней. Определенные Wnt лиганды также активируют не-кононический путь Wnt/Planar Cell Polarity (PCP), который влияет на клеточные перемещения [5], [30], [31]. β-Catenin важен для дифференцировки остеобластов и ингибирования хондрогенеза [6], [7], [12]-[14]; однако делеция индивидуальных Wnt лигандов приводит только к умеренным эффектам на дифференцировку кости [8], [32], [33]. β-catenin также является центральным регулятором ранней спецификации дермы [3], [9], [10], [34], [35], и роли Wnt лигандов т.о. были непосредственно показаны позднее во время иницииации фолликулов [9], [11], [36]. В развитии кости и кожи снижение функций множественных Wnts может быть скомпенсировано делецией индивидуальных лигандов. Условные нокауты индивидуальных лигандов, удаляющие экспрессию Wnt из всех клеток эмбриона, и были использованы для идентификации тканевых источников Wnt лигандов в развитии кости и кожи. Т.о., относительные комбинации из разных источников Wnt лигандов для выбора судьбы краниальной мезенхимой остаются неизвестными.

Мы условно удаляли эффективную секрецию Wnt лигандов или из поверхностной эктодермы или краниальной мезенхимы перед выбором судьбы краниальной кости и кожных клонов. Наши находки предоставили ключевую информацию o том, как локальные онтогенетические сигналы используются во время морфогенеза, чтобы генерировать краниальную кость и дермальные клоны.

Discussion

Мы получили данные, подтверждающие, что функции Wnts в эктодерме и мезенхиме отличаются в ранних дермальных и остеобластных предшественниках по их спецификации и дифференцировке. Wnt лиганды, экспрессируемые в краниальной поверхностной эктодерме и мезенхиме, и эктодермальные Wnts необходимы, чтобы генерировать индуктивные сигналы для спецификации множественных клонов в краниальной мезенхиме. Дермальные предшественники и предшественники остеобластов, ближайшие к эктодерме, испытывают наивысшие концентрации ядерного β-catenin, в ответ на Wnt лиганды от лежащей поверх эктодермы. Последующая дифференцировка остеобластов и предшественников дермальных фибробластов нуждается в Wls из мезенхимы. Т.о., наше исследование демонстрирует, что два разных источника сигналов Wnt координируются, чтoбы сформировать два отдельных клона для костей и дермы.

Мы предоставили доказательства, демонстрирующие, что Wnts в эктодерме генерируют индуктивные сигналы передачи сигналов Wnt в мезенхиме, чтобы специфицировать краниальные кости и дермальные клоны. Механизм пока не установлен; однако, имеются, по крайней мере, три возможные модели. Первая, пространственная сегрегация транскрипционных ко-факторов пути Wnt, таких как транскрипционные ко-факторы Lef1 и TCF4, частично за счет клонов, предоставляет механизм генерации различных клональных программ. Вторая, зависимая от порога модель также может генерировать множественные клоны от действия одного и того же сигнала. На ст. E11.5-12.5, дермальные предшественники, ближайшие к эктодермальному источнику Wnt, обнаруживают наивысшую репортерную активность передачи сигналов Wnt и маркеров, индуцированных с помощью постоянной активации β-catenin в мезенхиме (Figure 1) [3], [9], [46]. Высокие уровни активности пути Wnt предотвращают экспрессию маркеров остеобластов в мезенхиме [12]. Соотв. предшественники остеобластов оказываются наиболее удаленными от эктодермы, в перекрывающемся домене, по крайней мере, в отношении одного ингибитора Wnt, Dkk2[47] (Figure 6E). Наконец, остеобласты, реагирующие на эктодермальные Wnts могут быть косвенными; предшественники остеобластов могут нуждаться в отдельном сигнале, исходящим от дермальных предшественников. Будущие генетические эксперименты с новыми реагентами необходимы для выбора между этими моделями и тестирования прямых и косвенных потребностей в источниках Wnt при образовании остеобластов и дермы.

Во время выбора судьбы краниальных дермальных и остеобластных предшественников, вышестоящие эктодермальные Wnt лиганды инициируют экспрессию субнабора мезенхимных Wnt лигандов посредством β-catenin. Эктодермальные Wnts также действуют выше мезенхимных Wnts в развитии конечностей мышей [48]. Здесь, эктодермальные Wnts действуют по времени раньше, чем мезенхимные Wnts, а др. исследования подтвердили прямые взаимоотношения. По крайней мере, в одном примере, мезенхимные Wnt лиганды оказывались непосредственными мишенями канонической передачи сигналов Wnt [49]. Альтернативно, эктодермальные и мезенхимные Wnts могут передавать сигналы параллельными путями в мезенхиму. Сигнал, действующий выше, инициирующий экспрессию Wnt лиганда в краниальной эктодерме, остается неизвестным.

Здесь мы установили, что дифференцировка остеобластов нуждается в разных Wnt сигналах от поверхностной эктодермы и мезенхимы. Делеция β-catenin в эктодерме не ингибирует минерализацию костей черепа [39], так что аутокринные эффекты делеции Wls на эктодерму вряд ли вносят вклад в фенотип черепа. Однако, удаление из поверхностной эктодермы Wls приводит к эктопическому хондрогенезу (Figure 3), этот эффект фенокопирует делецию мезенхимного β-catenin [12]. Напротив, делеция мезенхимного Wls не приводит к эктопическому образованию хряща, подтверждая репрессию хондрогенеза в краниальной мезенхиме, нуждающегося в раннем эктодермальном Wnt сигнале. Наши результаты т.о., подразумевают участие β-catenin здесь как фактора пути Wnt, действующего в ядре, чтобы репрессировать хондрогенез и функции нижестоящих эктодермальных лигандов. Эктодермальные Wnt лиганды, т.о., предоставляют индуктивные сигналы, действующие на предшественников остеобластов, также как на клетки , ближайшие к эктодерме. В самом деле, поздняя делеция Wls из эктодермы с использованием линии K14Cre, не дает фенотипа оссификации костей черепа (Figure S2). Во время дифференцировки предшественников остеобластов делеция Wls с помощью Dermo1Cre приводит к сходному, но более тяжелому аресту дифференцировки, чем более ограниченный En1Cre. Соответственно, используя разные мутантные аллели Wls, делеция мезенхимных Wnts приводит к отсутствию проявлений дифференцировки остеобластов и к снижению клеточной пролиферации [50]. Мы показали, что мезенхимные Wnts поддерживают процесс дифференцировки, но нуждаются в индуктивном эктодермальном Wnt сигнале.

Мы продемонстрировали, что дермальные предшественники нуждаются в эктодермальном Wls для спецификации и в мезенхимном Wls для нормальной дифференцировки (Figs. 4-5). Краниальные дермальные предшественники, расположенные под эктодермой нуждаются в β-catenin для спецификации [3], но тканевой вклад источников Wnt остается по-прежнему неопределен. Здесь мезенхимный источник Wls является обязательным в дермальном клоне для нормальной дифференцировки, толщины и формирования паттерна волосковых фолликулов. Предыдущие сообщения о развитии кожи туловища мыши подтвердили, что эктодермальные Wnts сами по себе важны для индукции фолликулов волос [9], [10]. Могут существовать дифференциальные потребности для дермальных предшественников туловища, происходящих из мезодермы, и дермальных предшественников, происходящих из нервного гребня. Необходимы дальнейшие исследования для выявления потребностей в мезенхимном Wnt сигнале для дифференцировки дермальных фибробластов в разных частях эмбрионов.

Условная делеция Wls приводит к неспособности краниальных дермальных и остеобластных предшественников подвергаться базально-апикальному вытягиванию (Figure 3), процессу, который происходит независимо от β-catenin [12]. Поскольку делеция Wls блокирует секрецию канонических и не-канонических Wnt лигандов, дефекты вытягивания в мезенхиме согласуются с известными ролями не-канонических Wnt лигандов в ориентации клеточных перемещений [51]. Гомозиготные нулевые мутанты основных компонентов planar cell polarity (PCP) приводят к недостатку собственно развития тканей черепа и закрытия нервной трубки [52]. Однако, мутанты по индивидуальным не-каноническим Wnt лигандам лишены краниальных фенотипических отклонений. В краниальной мезенхиме не-канонические Wnt5a или Wnt11 лиганды экспрессируются в перекрывающихся доменах, указывая, что лиганды действуют, перекрываясь обильно [53] (Figure 7). Следовательно, роль передачи сигналов PCP по-прежнему нуждается в строгой проверку у условных мутантных мышей. Не-канонические и канонические пути передачи сигналов Wnt взаимодействуют широко. В нашем исследовании каноническая β-catenin трансдукция в ответ на эктодермальные Wnts, инициирует экспрессию не-канонических Wnt лигандов (Figure 7), это согласуется с сообщениями по др. системам [30], [49], [51]. Наши результаты подтвердили роль не-канонических Wnt лигандов в патогенезе черепно-лицевых аномалий [54], [55]. Способность экзогенных не-канонических Wnts компенсировать эффект делеции Wls в базо-апикальном вытягивании дермальных и остеобластных предшественников, ещё предстоит проверить.

Наши результаты по ткане-специфичной делеции Wls имеют значение для болезней с нарушениями регуляции дермальных фибробластов или остеобластов и для понимания патогенеза черепно-лицевых врожденных дефектов. Удаление Wls из эктодермы на ст. E12.5 развития мыши выявляет состояние по умолчанию (default) для формирования хряща в краниальном скелете и дерме, если вся секреция Wnt отсутствует в эктодерме. Это обраует важное базовое состояние, которое может быть использовано для интерпретации менее тяжелых генетических состояний, возникающих в результате потери или мутации индивидуальных Wnt лигандов. В этом отношении, мы предполагаем, что мутации в Wnt секреторном пути могут лежать в основе болезней остеобластов и дермальных фибробластов, требуя продолжения исследований роли продукции Wnt в формировании кости и кожи и в гомеостазе [15], [17], [18], [45],[56]-[58]. Понимание сигналов, окружающих остеобласты и дермальные фибробласты является критическим, чтобы удовлетворить требованиям инжениринга соотв. соединительной ткани.