Плюрипотентные стволовые клетки (PSCs) млекопитающих, включая эмбриональные стволовые клетки (ESCs) (Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) (Takahashi et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006) могут дифференцироваться в три зародышевых слоя. Ряд исследований продемонстрировал дифференцировку в специфические клоны клеток из PSCs с помощью цитокинов и химических соединений и предоставил важную информацию о молекулярных механизмах развития млекопитающих in vitro и для будущей регенеративной медицины. Т.к. почечные клоны в нескольких независимых исследованиях продемонстрировали дифференцировку в эти клоны из мышиных ESCs (mESCs) (Bruce et al., 2007; Vigneau et al., 2007), методы направленной дифференцировки в почечные клоны никогда ранее не описывались (Nishinakamura, 2008). Почечные клоны происходят из промежуточной мезодермы, которая дифференцируется из части каудальной примитивной мезодермы (Dressler, 2009; Reidy and Rosenblum, 2009).

Чтобы достичь направленной дифференцировки в почечные клоны, необходима система ступенчатой дифференцировки через промежуточную мезодерму. Ранее мы сообщали, что воздействие Activin A и ретиноевой кислоты (RA) вызывает образование почечных клонов из недифференцированных PSCs амфибий (Moriya et al., 1993; Osafune et al., 2002; Uochi and Asashima, 1996). Относительно роли Activin A, индуцирует многие производные мезэнтодермы из недифференцированных PSCs амфибий in vitro (Asashima et al., 1990; Asashima et al., 1991; Kaneko et al., 2008; Okabayashi and Asashima, 2003). Относительно роли RA, она не обнаруживает какую-либо индуктивной активности в дифференцировке у амфибий, но она может модифицировать действие Activin A на формирование паттерна мезодермы зависимым от концентрации и времени способом (Ariizumi and Asashima, 2001; Fukui and Asashima, 1994). В развитии млекопитающих ряд исследований продемонстрировал, что связанные с Activin гены, выполняют важные функции в формировании и дифференцировке мезодермы, используя мышей, дефицитных по этим генам (Goumans and Mummery, 2000; Schier and Shen, 2000). Мыши, дефицитные по генам, связанным с RA, обнаруживают нарушения развития разных тканей, включая почечные клоны (Duester, 2008). Исходя из этих находок, мы предположили, что последовательное добавление Activin A и RA д. индуцировать почечные клоны из PSCs млекопитающих.

В данной работе мы намеревались дифференцировать mESCs в почечные клоны, используя определенные культуральные условия и понять индуктивные сигнальные пути дифференцировки промежуточной мезодермы на базе специальной системы культивирования для mESCs (Furue et al., 2005). Эта культуральная система позволяет анализировать непосредственные эффекты различных цитокинов, включая белки внеклеточного матрикса (ECM) (Hayashi et al., 2007), Wnt белки (Nakanishi et al., 2009), bone morphogenetic proteins (BMP) (Hayashi et al., 2010b) и fibroblast growth factor (FGF) (Aihara et al., 2010). В этой культуральное системе мы использовали Activin A и RA в качестве кандидатов индукторов, чтобы дифференцировать mESCs в почечный клон и проверить уровни экспрессии генов маркеров промежуточной мезодермы в этих клетках. Мы усыновили, что эти дифференцированные клетки могут интегрироваться в экспланты развивающихся почек в культуре. Более того, мы использовали агонисты и антагонисты RAR, чтобы проверить участие передачи сигналов RAR в дифференцировке промежуточной мезодермы из mESCs.

Discussion

В данном исследовании мы продемонстрировали, что обработка недифференцированных mESCs RA после Activin A индуцирует промежуточную мезодерму. Используя эти определенные культуральные условия, определяли экспрессию мРНК и белков Osr1 и Wt1, индуцируемых с помощью добавления RA. Мы также показали, что дифференцированные клетки, трансплантированные в развивающиеся почки ex vivo интегрировались в структуры канальцев, меченных с помощью Laminin, и в почечный эпителий, меченный Pax2. Эти результат подтвердили, что дифференцированные mESCs, индуцированные с помощью RA и Activin A, могут дифференцироваться в почечные клоны. Предыдущие исследования, с использованием эмбриоидных тел, образуемых из агрегатов mESC, показали, что mESCs д. дифференцироваться в почечные клоны (Bruce et al., 2007; Vigneau et al., 2007); однако прямая дифференцировка в почечные клоны была трудно достижимой этими методами. Хотя эмбриоидные тела пригодны и удобны для дифференцировки во многие типы клеток (Desbaillets et al., 2000; Keller, 1995), этот метод позволяет ESCs дифференцироваться случайным образом, зависящим от межклеточных контактов и клеточно автономных секретируемых сигналов в эмбриоидных телах. Более того, эти методы культивирования обычно используют сыворотку или её заместители, включающие неизвестные цитокины, влияющие на дифференцировку. Эти влияния минимизируются в нашем методе культивирования, использующего бессывороточные и без питающего слоя монослойную культуры, благодаря чему известные химические соединения и цитокины были использованы, чтобы более точно контролировать выбор клетками судеб

Мы идентифицировали, что RA является критической для индукции промежуточной мезодермы, используя модели дифференцировки mESCs. В целом RA оказывает плейотропные эффекты на дифференцировку mESC и развитие млекопитающих (Clagett-Dame and DeLuca, 2002; Mark et al., 2006). В недифференцированных mESCs, RA ингибирует их самообновление и способствует нейрогенезу (Glaser and Brustle, 2005; Rohwedel et al., 1999). С др. стороны, при наших условиях культивирования Activin A был использован для индукции мезэнтодермы из mESCs перед воздействием RA (Johansson and Wiles, 1995; Kubo et al., 2004), что подтверждено активированием раннего мезодермального маркера, Brachyury. Более того, воздействие Activin A перед RA оказалось необходимо для активации экспрессии Osr1 и Wt1. Т.о., наши результаты подтвердили, что RAR управляет образованием промежуточной мезодермы из примитивной мезодермы.

Мы также установили, что путь передачи сигналов RAR участвует в дифференцировке в промежуточную мезодерму. Агонист RAR специфически усиливает активность экспрессии маркеров промежуточной мезодермы. Напротив, антагонисты ингибируют экспрессию RA-индуцированных маркерных генов. Эти находки согласуются с паттерном экспрессии RAR и фенотипом RAR-дефицитных мышей. RAR γ начинает экспрессироваться в заднем регионе эмбриона на ст. E8.0 (Ruberte et al., 1990). Мыши, дефицитные по RARα и RARβ2 генам или RARγ обнаруживали нарушения развития почек (Lohnes et al., 1993; Mendelsohn et al., 1999). Т.о. наши находки установили модель in vitro, чтобы продемонстрировать роль пути передачи сигналов RAR в индукции промежуточной мезодермы, используя систему дифференцировки mESC. Наше предыдущее исследование показало, что RXR в развитии сердца, используя систему дифференцировки mESC (Honda et al., 2005), подтверждая, что нижестоящие сигнальные пути RA могут отличаться при образовании мезодермальной ткани.

Итак, мы продемонстрировали, что последовательное добавление Activin A и RA индуцирует промежуточную мезодерму из mESCs. Вместе с нашим предыдущим исследованием с использованием плюрипотентных (из анимальной шапочки) клеток амфибий (Moriya et al., 1993; Osafune et al., 2002; Uochi and Asashima, 1996), наши находки подтверждают, что индукция почечных клонов с помощью Activin A и RA законсервирована среди позвоночных. Поэтому мы также ожидаем, что эти находки будут приложимы к плюрипотентным стволовым клеткам человека (Takahashi et al., 2007; Thomson et al., 1998; Yu et al., 2007). Т.к. стволовые клетки у взрослого человека и во взрослых почках остаются неуловимы (Yokoo et al., 2008), дифференцировка в почечные клоны из PSCs человека может быть использована для реализации в регенеративной медицине почек и для разработки лекарств .