Посещений: 
Развитие поверхностной эктодермы
Notch репрессирует экспрессию р63
|
|
Notch signaling represses p63 expression in the developing surface ectoderm Ana Mafalda Baptista Tadeu and
Valerie Horsley  Development v.140, 3777-3786, 2013 |
The development of the mature epidermis requires a coordinated sequence of signaling events and transcriptional changes to specify surface ectodermal progenitor cells to the keratinocyte lineage. The initial events that specify epidermal keratinocytes from ectodermal progenitor cells are not well understood. Here, we use both developing mouse embryos and human embryonic stem cells (hESCs) to explore the mechanisms that direct keratinocyte fate from ectodermal progenitor cells. We show that both hESCs and murine embryos express p63 before keratin 14. Furthermore, we find that Notch signaling is activated before p63 expression in ectodermal progenitor cells. Inhibition of Notch signaling pharmacologically or genetically reveals a negative regulatory role for Notch signaling in p63 expression during ectodermal specification in hESCs or mouse embryos, respectively. Taken together, these data reveal a role for Notch signaling in the molecular control of ectodermal progenitor cell specification to the epidermal keratinocyte lineage.
Рисунки к статье
|
Во время развития производных эпидермиса из первичной эктодермы одиночный слой эпителиальных клеток, который будет дифференцироваться в эпидермальные кератиноциты, стратифицируется и формирует зрелый эпителий кожи. У эмбрионов мышей, клетки первичной эктодермы экспрессируют keratin 8 (K8; Krt8 - Mouse Genome Informatics) и K18 и генерируют перидерму, наружный слой эпителиальных клеток, которые экспрессируют K6 и K17 (McGowan and Coulombe, 1998;Sanes et al., 1986). Начиная приблизительно со дня эмбриогенеза (E) 8.5, некоторые клетки поверхностной эктодермы активируют экспрессию K5 и K14, это указывает на предопределение судьбы эпидермальных кератиноцитов (Byrne et al., 1994; Fuchs, 2007; Koster and Roop, 2007;Nagarajan et al., 2008). После образования базального эпидермального слоя, асимметричные деления (Lechler and Fuchs, 2005) формируют супрабазальные слои, занимаемые окончательно дифференцированными эпидермальными клетками. Примерно на ст. E18.5 эпидермис достигает полного созревания, продуцируя непроницаемый барьер (Candi et al., 2005). Хотя некоторые исследования идентифицировали молекулярные механизмы, которые регулируют образование эпидермиса вследствие стратификации (Blanpain and Fuchs, 2006), однако, как контролируется инициальная детерминация поверхностной эктодермы в эпидермальный клон во время эмбриогенеза в основном неизвестно.
Белок p53 гомолог p63 является одним из самых ранних транскрипционных факторов, экспрессирующихся во время эпидермальной спецификации (Koster and Roop, 2007) , и он ассоциирует со спецификацией эктодермальных придатков, пролиферацией и развитием эктодермальных клеток (Koster, 2010; Laurikkala et al., 2006; Lechler and Fuchs, 2005; Mills et al., 1999; Truong and Khavari, 2007; Yang et al., 1999). Альтернативный спласинг гена p63 продуцирует транскрипты, кодирующие два класса изоформ белка p63, TAp63 and ΔNp63. ΔNp63 изоформы, лишенные домена TA (Crum and McKeon, 2010; King and Weinberg, 2007) экспрессируются на высоких уровнях на ранних стадиях эпидермального развития и поддерживаются внутри базального слоя кожи (Koster and Roop, 2004; Laurikkala et al., 2006; Romano et al., 2007; Romano et al., 2009). Полное устранение всх изоформ p63 во время развития мыши ведет к укорочению конечностей, черепно-лицевым уродствам и отсутствию целостного и функционального эпидермиса (Mills et al., 1999; Yang et al., 1999). Однако, контролирует ли p63 самообновление эпителиальных предшественников и/или детерминацию эпидермальной судьбы, остается спорным (Koster and Roop, 2004; Mills et al., 1999; Romano et al., 2012; Yang et al., 1999).
Передача сигналов Notch вовлечена в контроль эпителиального развития в ряде тканей (Blanpain et al., 2006; Bouras et al., 2008). Активация передачи сигналов Notch происходит при соприкосновении Notch рецепторов и лигандов на соседних клетках, а активация протеолитического отщепления внутриклеточного домена Notch рецептора (NICD) с помощью ADAM и γ-secretase комплекса. NICD транслоцируется в ядро, где он взаимодействует с ДНК-связывающим белком CSL/RBP-Jk и коактиватором Mastermind, чтобы обеспечить транскрипцию генов мишеней для Notch (Kopan and Ilagan, 2009). В коже каноническая передача сигналов Notch необходима для предопределения базальных кератиноцитов в окончательно дифференцированные во время развития (Blanpain et al., 2006; Moriyama et al., 2008; Nguyen et al., 2006; Pan et al., 2004).
В данной работе использовали эмбриональную кожу мышей и эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) , чтобы протестировать механизмы, регулирующие переход от эктодермальной к судьбе кератиноцитов. Мы идентифицировали ранее недооцененную ступень спецификации кератиноцитов с участием экспрессии p63 в клетках эктодермальных предшественниках. Было установлено, что передача сигналов Notch временно активируется перед экспрессией p63 или K14. С помощью фармакологического ингибирования передачи сигналов Notch в hESCs или генетически у эмбрионов мышей, мы установили, что репрессия передачи сигналов Notch способствует экспрессии p63 в эктодермальных клетках.
DISCUSSION
Базируясь на времени экспрессии p63 в развивающейся эктодерме, мы предположили, что p63 экспрессируется в пре-эпидермальных кератиноцитах, которые д. генерировать настоящие K14+ эпидермальные кератиноциты в развивающейся поверхностной эктодерме (Fig. 7). Наша модель согласуется с существующей способностью p63 непосредственно регулировать экспрессию K14 (Romano et al., 2009), с отсутствием экспрессии K14 у мышей и в hESCs, лишенных изоформ p63 (Mills et al., 1999; Romano et al., 2012; Shalom-Feuerstein et al., 2011; Yang et al., 1999), и с экспрессией p63, начиная со ст. E9.5 у эмбрионов мышей (Koster and Roop, 2004). Принимая во внимание преобладание экспрессии ΔNp63 в физиологически нормальной эпидермальной ткани и потребность в ΔNp63 для развития эпидермиса (Romano et al., 2009), изоформа ΔNp63, скорее всего, экспрессируется в поверхностной эктодерме.
Передача сигналов Notch, как было установлено, важна для предопределения базальных кератиноцитов в окончательно дифференцированные во время развития (Blanpain et al., 2006; Moriyama et al., 2008;Nguyen et al., 2006; Pan et al., 2004). Хотя некоторые группы получили делеции компонентов передачи сигналов Notch и проанализировали дефекты кератиноцитов, не были отмечены альтерации эпидермальной спецификации. Поскольку 4 Notch рецептора и лиганда перекрываются (Kitamoto et al., 2005; Krebs et al., 2000; Pan et al., 2004), несколько рецепторов и лигандов необходимо устранить одновременно, чтобы получить фенотипические отклонения во многих системах. Кроме того кондиционная делеция компонентов Notch в коже была осуществлена с использованием промоторов keratin, который действует после инициациии экспрессии p63 (Blanpain et al., 2006;Demehri and Kopan, 2009). Интересно, что гены Presenilin были кондиционно устранены мозаичным способом в поверхностной эктодерме, используя мышей, экспрессирующих Cre управляемый промотор Msx2, который активен, начиная со ст. E9.5, но экспрессия p63 не была исследована у таких мышей (Pan et al., 2004).
Используя преимущества спецификации hESCs в эктодермальные клоны и полное устранение передачи сигналов Notch у эмбрионов, мы оказались способны идентифицировать роль передачи сигналов Notch в регуляции экспрессии p63 во время спецификации эктодермы. Наши данные согласуются со способностью активированного Notch1 репрессировать экспрессию p63 в полностью детерминированных кератиноцитах (Nguyen et al., 2006). Ингибирование экспрессии p63 в эктодермальных предшественниках подтверждает, что как и при выборе судьбы мышц, нейронов, гепатоцитов, передача сигналов Notch репрессирует выбор судьбы кератиноцитов во время развития (Han et al., 2011; Lai, 2004). Эта идея согласуется с предыдущим исследованием у эмбрионов Xenopus, демонстрируя, что активация экспрессии Notch может ингибировать экспрессию генов эпидермальных кератинов (Coffman et al., 1993). Поскольку предыдущее исследование экспрессировало активированный Notch в 2- 8-клеточных эмбрионах, то прямая роль передачи сигналов Notch в поверхностной эктодерме не возможно было определить. Наши данные расширяют эту находку, вовлекая передачу сигналов Notch в спецификацию кератиноцитов у высших позвоночных и демонстрируя, что передача сигналов Notch действует в клетках поверхностной эктодермы, репрессируя экспрессию p63.
Передача сигналов Notch может активировать экспрессию p63 посредством нескольких механизмов. Активация NICD д. активировать RBP-Jk, чтобы непосредственно активировать промотор p63, который содержит предполагаемый сайт связывания RBP-Jk (data not shown). Напротив, неканоническая передача сигналов Notch может быть использована путём взаимодействия с альтернативными сигнальными путями, такими как передача сигналов FGF, Shh и Wnt (Sanalkumar et al., 2010). Неканоническая передача сигналов Notch происходит в коже, принимая во внимание отличающиеся фенотипы кондиционных генетических мышиных моделей, лишенных функционального γ-secretase комплекса (presenelin 1/2; PS1/PS2), Notch рецепторов (Notch1/2; N1/N2) или RBP-Jk транскрипционного репрессора (Demehri and Kopan, 2009). Сходным образом p63 может негативно регулировать путь передачи сигналов Notch. Фактически, эмбрионы мышей, лишенные ΔNp63? обнаруживают дефекты передачи сигналов Notch, а ΔNp63 прямо соединяется в промоторами Notch1 (Nguyen et al., 2006) и Notch3 (Romano et al., 2012). Идентификация типов клеток, котрорые экспрессируют Notch лиганды, а также нижестоящих мишеней для передачи сигналов Notch, таких как Rbp-Jk или Hes5, прямо контролирующих экспрессию p63 предоставит путь для будущих исследований.
Влияние передачи сигналов Notch на время спецификации поверхностной эктодермы может осуществляться в координации с передачей сигналов BMP и Wnt. Наши данные подтверждают, что спецификация эпидермальных кератиноцитов нуждается в активной передаче сигналов BMP4 и ингибировании передачи сигналов Notch. Это наблюдение согласуется с предыдущим исследованием, показавшим, что p63 индукция судьбы эпидермальных кератиноцитов в ESCs мышей требует передачи сигналов BMP4 (Medawar et al., 2008). Кроме того, передача сигналов BMP может индуцировать эпидермальную судьбу в hESCs (Aberdam et al., 2008;Harvey et al., 2010) и в предшественниках поверхностной эктодермы у эмбрионов Xenopus (Wilson and Hemmati-Brivanlou, 1995). Передача сигналов Wnt может также способствовать выбору судьбы поверхностной эктодермы и репрессировать судьбу нейроэктодермы (Wilson et al., 2001). Т.о., передача сигналов Wnt может быть скоординирована с передачей сигналов BMP гда как передача сигналов Notch может латерально ингибировать выбор судьбы кератиноцитов, подобно последовательности событий, которые контролируют развитие периферической нервной системы у Drosophila (Hayward et al., 2008). Дальнейшие исследования времени и взаимодействий между этими сигнальными путями могут выявить новые аспекты последовательности развития кератиноцитов.
In conclusion, our data highlight the utility of using hESCs as a model for ectoderm development. Our works supports the parallels between hESCs and ectoderm specification in murine embryos. Our concurrent analysis of developing murine embryos and ectoderm specification in hESCs allowed us to identify a novel role for Notch signaling in ectoderm specification and to further define the sequence of events that occur during keratinocyte development. Future work will show whether manipulation of Notch signaling can enhance keratinocyte formation in hESCs for therapeutic use in skin diseases and disorders.
|