Посещений:
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЕ НАСЛЕДОВАНИЕ

Гистоновые метки через поколения

Epigenetic inheritance: histone bookmarks across generations
Eric I. Campos, James M. Stafford, Danny Reinberg
Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 11, November 2014, Pages 664–674

Multiple circuitries ensure that cells respond correctly to the environmental cues within defined cellular programs. There is increasing evidence suggesting that cellular memory for these adaptive processes can be passed on through cell divisions and generations. However, the mechanisms by which this epigenetic information is transferred remain elusive, largely because it requires that such memory survive through gross chromatin remodeling events during DNA replication, mitosis, meiosis, and developmental reprogramming. Elucidating the processes by which epigenetic information survives and is transmitted is a central challenge in biology. In this review, we consider recent advances in understanding mechanisms of epigenetic inheritance with a focus on histone segregation at the replication fork, and how an epigenetic memory may get passed through the paternal lineage.



Glossary for this article


  • Epigenetic inheritance the inheritance of a phenotype in a manner that is independent of the DNA sequence and that remains self-perpetuating in the absence of the initial stimulus that caused the phenotype in the parental cell or organism.
  • Histone variant core canonical and linker histones are encoded by a number of different histone genes, resulting in a number of non-synonymous substitutions and divergent domains. This variation adds complexity to the epigenetic landscape.
  • Histone chaperone proteins or protein complexes that specifically bind histones, thwarting non-specific interactions, and that promote their deposition or removal from DNA in an ATP-independent manner.
  • PcG polycomb Group Proteins. A group of proteins involved in the regulation and transcriptional silencing of key developmental genes, including the Homeotic (or Hox) gene loci. Human PcG proteins assemble into Polycomb Repressive Complexes (PRCs), of which PRC2 catalyzes the methylation of H3K27 and PRC1 guides the ubiquitin ligation of H2AK119.
  • Protamine low molecular weight proteins that tightly package DNA in late spermatids and mature sperm largely due to their arginine-rich DNA anchoring domains. Their precise function is unknown but might include protecting the paternal genome from DNA damage, facilitating formation of a small elongated sperm head for better motility and/or conveying epigenetic information.
  • Spermatogenesis the process of generating mature, haploid sperm (spermatozoa) from a diploid spermatogonium. This process initially requires mitosis to create spermatocytes, their subsequent meiotic divisions to create spermatids and finally maturation of spermatids to spermatozoa. During this chain of events, chromatin undergoes dynamic changes whereby canonical histones are largely replaced by protamines through a number of intermediate steps, including histone variant incorporation, nucleosomal destabilization, histone eviction and replacement with transition proteins prior to protamine deposition.


  • Beyond the Mendelian rules of inheritance


    Согласно классической генетике и приходу современному секвенированию, мы достигли углубленного понимания традиционных способов Менделевского наследования, пока эти успехи не могут полностью объяснить, как организмы передают по наследству огромное количество разных фенотипов через поколения независимо от альтераций в генных последовательностях, т.е. эпигенетически. Консервативное эпигенетическое наследование (see Glossary) требует, чтобы передаваемый фенотип был: (i) независим от изменений в последовательности ДНК; (ii) передавался в отсутствие инициальных стимулов, которые вызывали фенотип в родительской клетке или организме (F0); и (iii) предавался посредством bona fide механизма. Не смотря на огромную и всё увеличивающуюся литературу по эпигенетическому наследованию у многочисленных видов, раскрытие феномена, которое бы удовлетворяло всем этим критериям, затруднено, поскольку механизм сам по себе часто оказывается более противоречивым (Box 1 and 1 and 2). Мы обсудим возможные механизмы эпигенетического наследования с упором на недавнюю информацию, полученную на уровне хроматина. Во-первых, мы рассмотрим трансмиссию эпигенетической памяти путем исследования наиболее фундаментальных составляющих передачи информации в делящихся клетках, в нуклеосомах, с учетом репликационной вилки. Во-вторых, мы исследуем сложность наследования через поколения у многоклеточных организмов, подкрепляемое новыми открытиями, связанными с динамикой хроматина, которая может обеспечивать эпигенетическое наследование через отеческий клон.

    Box 1. Transgenerational inheritance; considering caveats and alternative mechanisms Non-chromatin based mechanisms likely contribute to transgenerational inheritance. For example, some of these phenotypes might arise from cryptic genetic variation given that inbred strains, nearly identical clones or even neighboring cells in the same organism may possess marked genetic differences [108]. Such genetic variation could be passed on to offspring or arise de novo (e.g., transposable elements, mutations) and account for differences. Unfortunately, these alternatives are seldom examined in transgenerational studies. Furthermore, establishing transgenerational inheritance in its purest sense is often confounded by maternal care, social transmission, or other variables that may propagate a phenotype without requirement for epigenetic memory per se. Indeed recent studies suggest that maternal care may play a significant role even in the transmission of phenotypes originating from the father [109]. Even if a phenotype is transmitted in a transgenerational epigenetic fashion, chromatin events may not always be responsible for their propagation. Transcriptional loops are one example [110]. As in somatic tissue, noncoding RNAs such as siRNA, piRNAs as well as miRNA contribute to inheritance and might function independently of changes at the level of chromatin (recently reviewed by [63]). In fact, a recent study showed that miRNAs are important for transmitting the experience of trauma to progeny through the paternal lineage [65]. Studying the importance of these varied contributions to transgenerational inheritance is important in understanding whether they are truly epigenetic.




    Dismantling and restoring chromatin throughout DNA replication


    Восстановление метилирования ДНК после репликации на вновь синтезированной ДНК посредством поддержания DNA methyltransferase, DNMT1, является вообще-то наиболее изученным примером эпигенетического наследования (см. обзор [3]). Напротив, др. эпигенетические факторы, как полагают, сегрегируют на реплицируемую ДНК, чтобы дать две фенотипически идентичные дочерние клетки в конце митоза. Это в частности верно для гистонов - интегральных компонентов хроматина.
    Пионерские исследования установили, что предсуществующие родительские нуклеосомы вносят вклад приблизительно в половину гистонов на рождающуюся ДНК, подтверждая, что родительские гистоны, скорее всего, вносят вклад в оформление эпигенома дочерних клеток [4]. Распределение гистонов является кооперативным и рассеивающим, приводящим в результате к равному и случайному распределению гистонов, в виде кластеров, на обеих дочерних нитях ДНК (rev. Annunziato [4]). Отложение тесно связано с аппаратом репликации, поскольку нуклеосомы появляются повторно спустя ~ 200-300 оснований после репликационной вилки на ведущей и ведомой нити 5 and 6. Это взаимосвязь с аппаратом репликации в дальнейшем очевидна с фрагментами Okazaki у дрожжей, которые почти размером в нуклеосому, при этом соединения формируют кластеры поверх нуклеосомных пар [7]. Точный молекулярный механизм, с помощью которого нуклеосомные гистоны и ассоциированные с ними пост-трансляционные модификации (PTMs) перераспределяются позади репликационной вилки, как полагают, связан с эпигенетическими процессами. Ряд гистоновых шаперонов, как полагают, вносит вклад в сегрегацию гистонов, всё же их соотв. modus operandi совершенно особенный.
    Нуклеосомные гистоны преимущественно отделяются в виде двух H2A-H2B гистоновых димеров и центрального (H3-H4)2 тетрамера in vitro и in vivo на репликационной вилке 8-10. В то время как H2A-H2B димеры чувствительны к межнуклеосомным обменам в ходе интерфазы, тетрамерный (H3-H4)2 стержень нуклеосомы на репликационной вилке, скорее всего, является кандидатом на роль передачи эпигенетической информации. Доказательства подтверждают, что родительская (H3-H4)2 нуклеосомная основа немедленно образует повторно ансамбли позади репликационной вилки, что сопровождается откладыванием H2A-H2B димеров и линкерного гистона H1 [4]. Пульс-чейз анализ меченных изотопами гистонов недавно подтвердил давно установленные биохимические данные, что масса H3-H4 переносится на реплицирующуюся ДНК как интактные (H3-H4)2 тетрамерные единицы 9 and 10. Это находится в резком контрасте с вновь синтезированными гистонами, которые наносятся на реплицирующуюся ДНК как H3-H4 димеры. Anti-Silencing Factor 1 (ASF1) гистоновый шаперон экстенсивно соединяется с гистоновыми димерами, препятствуя образованию H3-H3' контактов, наблюдаемых внутри (H3-H4)2 тетрамеров [11]. ASF1 ассоциирует с новыми цитоплазматическими гистонами, которые транслоцируются в ядро в качестве груза на importin-4 karyopherin 12 and 13. В ядре, ASF1 прокладывает каналы для сцепленных с репликацией H3.1/H3.2 и независимых от репликации H3.3 вариантов за счет разных путей отложения [14] (отложение различных гистоновых вариантов рассмотрены в обзоре [15]). Димеры, состоящие из вновь синтезированных сцепленных с репликацией гистонов H3.1 передаются с ASF1 на Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1) шаперон 14 and 16, чтобы противодействовать разбавлению сегрегирующих родительских гистонов. CAF-1 ассоциирует с PCNA каркасным кольцом и отвечает за сборку de novo (H3-H4)2 тетрасомных промежуточных образований (нуклеосом, лишенных гистонов H2A-H2B) на реплицирующуюся ДНК (Figure 1) [17]. Недавний термодинамический анализ установил увеличение связывающего сродства в отношении гистонов у ASF1, CAF-1, и ДНК, это прекрасно иллюстрируется цепью последовательных эстафетных передач 18 and 19. То же самое исследование далее указало, что, скорее всего, образование тетрамеров на CAF-1 происходит непосредственно перед отложением. CAF-1 управляется с вновь синтезированными молекулами гистонов, которые в основном сохраняются не модифицированными для ацетилирования H4 [20], но остаются сомнения, как же CAF-1 откладывает родительские нуклеосомные гистоны в нормальных условиях. Следовательно, будучи однажды сформированными тетрамерные стержни, они, скорее всего, остаются такими в ходе последующих раундов репликации и не могут больше направляться каналами (channeled) с помощью CAF-1.

    Figure 1. Histone dynamics and inheritance of epigenetic information at the replication fork, as exemplified by the methylation of histone H3 on lysine 27. De novo nucleosome assembly proceeds through the nuclear import of histone H3-H4 dimers via the ASF1 histone chaperone. Differential thermodynamic affinities towards histones facilitate the transfer of these predominantly unmodified histones to the PCNA-bound chromatin assembly factor-1 (CAF-1). The latter facilitates the formation and deposition of stable (H3.1-H4)2 tetramers to be completed by the addition of two juxtaposed H2A-H2B dimers. Nucleosomes encountering the replication fork are transiently bound by the MCM2 subunit of the CDC45, MCM2-7, GINS (CMG) replicative helicase as well as by the histone chaperone FACT. The exact mechanism by which these multi-post-translational modification (PTM) decorated histones segregate onto nascent DNA strands remains to be fully elucidated. Polycomb repressive complexes (PRC1) persist at the replication fork through internucleosomal contacts. Only histone H3 N terminal tails marked on lysine 27 are shown for simplicity. Histones H3, H4, and H2A-H2B are shown in blue, yellow, and grey, respectively. Methyl marks are shown in red. Adapted from [2].



    Histone chaperones and the replicative helicase


    Помимо взаимодействия с CAF-1, ASF1 также совместно очищается с др. компонентами аппарата репликации, такими как replicative clamp loader RFC [21] и субъединицы MCM из репликативной helicase [22]. Последнее приводит к привлекательному предположению, что ASF1 демонтируется и расщепляет нуклеосомные (H3-H4)2 тетрамеры, чтобы переносить эпигенетическую трансформацию в форме двух эквивалентных H3-H4 димеров на обе возникающие нити ДНК. Эта полуконсервативная модель сегодня, однако оспаривается в пользу консервативной сегрегации гистонов, поскольку (H3-H4)2 тетрамеры (особенно H3.1-содержащие нуклеосомы) в основном остаются интактными в ходе клеточного деления 9 and 10. Более того, непонятно, ассоциирует ли ASF1 в основном с неактивными субъединицами MCM или актуальна процессивная геликаза (see below). Дальнейшие масс-спектрометрические исследования выявили, что нуклеосомы не обязательно обладают симметричной эпигенетической информацией на своих двух сестринских H3-H4 димерах [23]. Поскольку центральный (H3-H4)2 тетрамер вряд ли более тяжелый (severed) по сравнению с основой массой реплицирующегося хроматина (читателю предлагается посмотреть модели сегрегации H3-H4 2, 9 and 24), то полу-консервативная, базирующаяся на расщеплении модель может всё ещё оперировать для специфического субнабора нуклеосом, принимая во внимание, что пятый пост-репликативный пул H3.3 нуклеосом содержит смесь родительских и вновь синтезированных видов после двух раундов репликации [10]. Этот кластер нуклеосом на активных, ткане-специфических энхансерах [25], подразумевает уникальный и ограниченный маршрут расщепления этих важных регуляторных сайтов.
    Если ASF1 не диссоциирует от массы нуклеосомных гистонов, и CAF-1 управляет вновь синтезированными гистонами, то как затем родительские нуклеосомы разделяются на репликационной вилке? Важное открытие на дрожжах показало, что гистоновые шапероны ассоциируют с нуклеосомальными гистонами, когда сталкиваются с активной репликативной геликазой [26], минимум состоящей из CDC45, MCM2-7 и GINS (CMG) субкомплексов 27 and 28. Довольно хорошо законсервированные кислые участки N терминальном конце MCM2 взаимодействуют с гистоном H3 26 and 29 и кооперируют с FACT гистоновым шапероном, чтобы соединиться со стержневыми нуклеосомными гистонами на активной CMG геликазе [26]. Хотя преобладает мнение, что H2A-H2B гистоновый шаперон, FACT способен соединяться с 4 каноническими гистонами, а также со стержневыми нуклеосомными частицами 30 and 31. Важно, что материал, диссоциируемый с помощью взаимодействия FACT-CMG состоит из родительских гистонов, которые высвобождаются из хроматина скорее, чем являются вновь синтезируемыми аналогами [26]. В подтверждении роли в передаче эпигенетической информации, клетки, экспрессирующие мутантный MCM2, дефицитный по связыванию гистонов, обнаруживают потерю субтеломерного гетерохроматина [26]. Является ли взаимодействие между FACT и CMG достаточным, чтобы растворить нуклеосомы на активной геликазе, предстоит ещё проверить in vitro. Во время транскрипции, FACT действует, диссоциируя H2A-H2B димер, чтобы дестабилизировать стержневые нуклеосомные частицы [30], механизм, который действует во время репликации ДНК также. ДНК геликазы способны вызывать серьезные разрушения и вполне возможно, что piconewton силы, генерируемые вследствие смещения (displacement) нити далее вносят вклад в транслокацию нуклеосомных гистонов [32].

    Acquiring and restoring epigenetic information through parental histone clusters


    Упомянутые выше данные говорят за сохранение хроматиновых доменов скорее, чем за точное отложение гистонов, т.к. управление эпигенетической информацией на репликационной вилке таково, что определенные композиции из PTMs помогают предписывать созревание хроматина в ходе последовательных стадий клеточного цикла. Вероятно, что предполагаемые эпигенетические гистоны PTMs могут минимально передаваться в цис-положении между соседними нуклеосомами, так что отложение родительских кластеров нуклеосом на обеих синтезируемых нитях ДНК может быть достаточным, чтобы обеспечить ('seed') воспроизводство эпигенетических гистоновых PTMs. Имеется возражение, по крайней мере, в случае быстро делящихся эмбрионов Drosophila (see below) [33]. Однако родительские гистоны, содержащие ключевые PTMs, недавно были изолированы и диагностированы с активных репликационных вилок в культивируемых клетках человека, это подтвердило их эпигенетическую природу на соматических моделях млекопитающих [34]. В самом деле, доказательства подтвердили, что гистоновые посттрансляционные модификации - особенно те, что участвуют в молчании генов и компакции хроматина - персистируют в течение многих раундов клеточных делений в отсутствии вызвавших их сигналов (Box 2). Хотя эти кластеры родительских гистонов могут помочь в закладке (bookmark) эпигенетических сигналов восстановление оригинального состояния хроматина происходит посредством последующего созревания хроматина.



    Box 2. Perseverance of histone PTMs Epigenetic forces regulating chromatin have long been documented. Phenotypic variegation is a classical example, as gene activity decreases when placed in proximity to heterochromatin (an effect known as position effect variegation - or PEV) 111 and 112. In examining histones per se, truncations over the N terminal tails of histone H4 abolishes silencing over the yeast silent mating cassettes [113]. The disruption of the Silent Information Regulator deacetylase machinery, however, creates mitotically-stable states where a majority of cells lose silencing over the same genetic loci, but a minority persist in a silent state [114]. This observed bistability argues towards histones and their posttranslational modifications having a direct epigenetic role. An elegant in vivo system was recently developed in the laboratory of Gerald Crabtree that uncouples the initial signaling event leading to changes in chromatin and the inheritance of the ensuing chromatin state through subsequent cell divisions [115]. In this system, repressive HP1? or activating VP16 proteins was transiently recruited to a reporter gene. Their recruitment was dependent on and tightly controlled by the presence of small molecule ligands. Transient recruitment of HP1? led to the recruitment of endogenous HP1, the formation of large H3K9me3 domains that spread in cis, chromatin compaction, and silencing of the reporter gene. Importantly, the H3K9me3 domains persisted upon a number of cell divisions and in a clonal manner following abrogation of the initial stimulus. These proof of principle experiments highlight another key observation: parallel epigenetic pathways reinforce one another to reduce bistability through interlinked feedback mechanisms. Whereas short-lived HP1? tethering induced H3K9me3, a prolonged recruitment further instituted local DNA methylation, which in turn led to fewer stochastic epigenetic interconversions in dividing cells.
    Первый пример того, как кластеры родительских нуклеосом могут запустить воспроизводство (seed propagation) эпигенетических гистоновых PTMs, связан с Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), комплексом гистоновых метилтрансфераз, катализирующих H3K27me3 и участвующих в репрессии генов 35-37. PRC2 разносит H3K27me3 по хроматину за счёт одновременного связывания и катализа метки [38]. PRC2 субъединица EED связывает нуклеосомы, обладающие H3K27me3, чтобы стимулировать дальнейшее триметилирование H3K27 в соседних гистонах посредством PRC2 каталитической субъединицы EZH2 [38], механизм распространения, напоминающий ранее описанное распространение триметилирования H3K9 [39] и деацетилирование гистонов, обусловленное sirtuin у дрожжей [40]. H3K9me3, это др. метка, коррелирующая с молчанием генов, связывается с помощью Heterochromatin Binding Protein 1 (HP1), это в свою очередь далее рекрутирует H3K9 метилтрансферазу SUV39H1/2 [39].
    PTMs наследуют родительские (H3-H4)2 тетрамеры, следовательно, можно ожидать, что они регулируют образование гистоновых меток на созревающем хроматине. Как упоминалось, два H3-H4 димера, представляющие стержень нуклеосомы (H3-H4)2 могут обладать как симметричными, так и асимметричными PTMs. В самом деле, удивительная пропорция таких тетрамеров может не только обнаруживать асимметрию между двумя скрепленными H3-H4 димерами, но и может также обладать бивалентными H3K4me3 и H3K27me3 метками внутри одиночной нуклеосомы [23]. PRC2 может распространять H3K27me3, но только на нуклеосомы, содержащие асимметричные в противовес симметричным H3K4me3 [23]. Следовательно, конфигурация гистоновых PTMs наследуемых (H3-H4)2 тетрамеров обнаруживает последствия инкорпорации последующих гистоновых модификаций. Поскольку гистоновые PTMs являются предметом стохастических флюктуаций, то доза наследуемых родительских гистоновых меток, скорее всего, влияет на последующее состояние хроматина.

    Histone marks: beyond S-phase


    Достаточно интересно, что восстановление родительских гистоновых PTMs не ограничено S-фазой (Figure 2). Это доказывается как H3K27me2/3, так и H3K9me2/3, двумя наиболее широко изученными гистоновыми метками, вызывающими транскрипционное молчание. Обе PTMs легко обнаруживаются на зарождающемся хроматине, даже после ингибирования синтеза белка de novo, подчеркивая важность вклада родительских гистонов в сохранение этих меток [34]. Проточная цитометрия и масс спектроскопия иллюстрируют легкое разведение H3K9me2/3 при репликации ДНК, сопровождаемое активным ди- и три-метилированием с помощью SUV39H1/2 после завершения S-фазы 41-43. В самом деле, ограниченный пул H3K9me2/3 восстанавливается из моно- и ди-метилированных предшественников в ходе S-фазы. Это соответствует постулированию, что монометилирование H3K9 во вновь синтезированном гистоне H3 с помощью PRDM3, PRDM16 и SETDB1 служит субстратом для ди- и три-метилирования в гетерохроматине 44-47. Однако, уровни устойчивого состояния H3K9me2/3 полностью восстанавливаются только в последующей G1 фазе за счет метилирования de novo не модифицированных остатков [42]. Следовательно, предсуществующие родительские гистоны, скорее всего, передают H3K9me2/3 в созревающие вновь синтезируемые аналоги пост-репликативным способом. Эти исследования определили сходную кинетику клеточного цикла для метилирования H3K27 42 and 43. Необходимо отметить, что недавние сообщения оказались неспособны установить метилирование гистона H3 позади репликационной вилки у гаструлирующих эмбрионов Drosophila [33]. Остаются вопросы, почему гистоновые метки не определяются или могут даже активно стираться в этой системе. Независимо от причины, или того насколько универсален или уникален этот феномен между видами, исследования подчеркивают важность наследования связывающих и модифицирующих гистоны polycomb белков.

    Figure 2. Restoration of repressive H3K9 and H3K27 methylation marks throughout the cell cycle. Replicated nascent DNA strands receive an equal influx of newly synthesized and parental histones effectively diluting pre-existing posttranslational modifications. H3K9me1 increases in S-phase through the deposition of PRDM3/16 and SETDB1-modified histones. A subset of the monomethylated histones are perhaps converted into higher methylation states; however, steady states are achieved through the propagation of the marks onto unmodified histones from the end of replication until the subsequent G1 phase. Although H3K27me mirrors these cell cycle coupled kinetics, the enzyme responsible for H3K27 monomethylation has yet to be unequivocally identified. Red, green, and yellow dots represent parental methyl marks, and subsequent methylation events on modified and unmodified substrates, respectively.

    Acquiring cellular memory through histone-binding proteins


    Многие белки, ассоциированные с хроматином, модулируют транскрипционный результат генов путем конвергенции их на гистоны. Polycomb-group (PcG) и trithorax (Trx) белки являются ключевыми эпигенетическими регуляторами транскрипции для большого числа онтогенетических генов. Линейный режим функции был первоначально предположен для двух стержневых PcG белковых комплексов, Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) и PRC2: PRC1 распознает и связывается с H3K27me3, это катализируется с помощью PRC2, приводя в конечном счете к молчанию генов посредством PRC1-обусловленной компакции хроматина. Поскольку модель может действовать при определенных условиях, то недавние сообщения выявили, что это далеко от универсальности 49-54 и пост-репликативное рекрутирование обоих репрессивных комплексов очень важно. Важность PcG белков в репликации у эмбрионов Drosophila далее было подкреплено их ролью в передаче эпигенетической информации [33].
    исследования с использованием SV40-управляемой репликации PcG-связанных хроматиновых матриц in vitro выявили, что Drosophila PRC1 остается ассоциированным с вновь реплицированными дочерними нитями посредством Posterior Sex Combs (Psc) субъединицы [55]. Эта же самая субъединица обеспечивает компакцию хроматина с помощью PRC1 in vitro [56]. Во-первых, эта находка относительно PRC1 напоминает таковую, связанную с аппаратом репликации SV40, который может пересекать (traverse) поперечно связанные гистоновые октамеры без вытеснения гистонов, оставляя нуклеосомы интактными [57]; однако, механизм, с помощью которого PRC1 остается ассоциированным с реплицируемой ДНК, совершенно иной. Само-ассоциация Psc и обеспечивает способность к образованию мостиков нуклеосомных матриц [58]. Это привело к предположению механизма эпигенетического наследования с помощью PRC1 комплексов, временно ассоциированных со многими контактами до и позади вилки репликации (Figure 1). Это д. позволять PRC1 оставаться ассоциированными с реплицирующийся ДНК посредством события образования петли, подтверждая элегантный механизм эпигенетического наследования.
    Белки PcG и Trx легко обнаруживаются позади вилки на меченой реплицирующейся ДНК у Drosophila 33 and 55. В клетках человека инкорпорация тимидиновых аналогов подтвердила присутствие PRC1 и PRC2 белковых комплексов на реплицирующейся ДНК. Однако дальнейший SILAC анализ по сравниванию biotin-dUTP меченных фрагментов хроматина после 15-мин или 2-ч chase показал обогащение компонентами обоих комплексов polycomb зрелых (2 ч) по сравнению с зарождающимся (15 min) хроматином [34]. Рекрутирование этих белковых комплексов на созревающий хроматин в клетках человека, следовательно, или отражает важное расхождение между культивируемыми клетками человека и гаструлирующими эмбрионами Drosophila или следует вторая волна рекрутирования после инициальной сегрегации компонентов PcG на вилку. Др. словами, могут иметь место два отдельных события: сначала белковые комплексы PcG млекопитающих отделяются от вилки, как предполагает модель Drosophila, тем самым метятся геномные мишени для транскрипционного молчания. Этот процесс является жизненно важным, поскольку PRC2, опосредуя H3K27me3, может рекрутировать PRC1, а активность H2AK119 ubiquitin лигазы в PRC1 может в свою очередь стимулировать рекрутирование PRC2 50-52. Кроме того, PcG комплексы могут далее рекрутироваться пост-репликативным способом на свои геномные мишени по мере созревания хроматина, посредством само-ассоциации или соединения с концевыми метками. Эти данные указывают на существование нового эпигенетического слоя, обеспечивающего клеточные характеристики, который нуждается в дальнейшем исследовании. Могут ли человеческие комплексы PRC1 и PRC2 само-ассоциироваться, чтобы увековечивать самих себя посредством множественных нуклеосомных контактов на репликационной вилке, как в случае с Drosophila PRC1, ещё предстоит определить. Это важно, поскольку в отличие от Drosophila, модели на млекопитающих не обладают PRE и TRE (polycomb и trithorax responsive element) регуляторными ДНК элементами, чтобы обеспечивать их связывание на хроматине.
    Сходным образом, HP1 обнаруживается непосредственно на реплицирующейся ДНК у млекопитающих и мух 34 and 48. Предложена модель трансмиссии HP1 посредством ассоциации с CAF-1; однако, взаимодействие обнаруживается на медлительных молекулах PCNA и неотделима от отложения гистона 59 and 60. Всё же поскольку HP1 димеризуется и способен образовывать мостики с нуклеосомами 61 and 62, то можно предположить, что пул HP1 белков может оставаться ассоциированным с реплицирующимся конституитивным гетерохроматином посредством механизма образования петли, подобным тому, что предположен для Psc. Ряд из предложенного может быть действенным для этих белков, т.к. образование петель и мостиков между родительскими и дочерними нуклеосомными матрицами д. регулироваться в пространстве и во времени на относительно коротких расстояниях от репликативной геликазы.
    Существует безусловно несколько путей, чтобы воспроизводить и поддерживать эпигенетическую информацию в соматических тканях. Недавние публикации подтверждают, что некоторая часть этой памяти может даже сохраняться, проходя через зародышевую линию, чтобы влиять на последующие поколения. Хотя всё ещё много неясного, молекулярная информация об этой форме Ламаркизма начинает появляться.

    Against all odds: the possibility and impossibility of transgenerational epigenetic inheritance


    Центральной проблемой эпигенетического наследования является то, что в зародышевой линии происходят множественные события, во время гаметогенеза и в развивающемся эмбрионе, все они, по-видимому, имеют целью стереть эпигенетическую память об их родителях и происхождении, чтобы создать тотипотентную tabula rasa , с которой и генерируется сложный многоклеточный организм. Не смотря на это, растет количество сообщений, подтверждающих роль эпигенетических механизмов в наследовании связанных со стрессами, метаболическими, онкогенетическими и даже сложными поведенческими фенотипами, такими как обучение, память, депрессия и реакция на лекарства в последующих поколениях, F2 и F3 63-66. Однако даже наиболее контролируемые исследования, использующие комбинацию перекрестного воспитания (cross-fostering) и in vitro оплодотворение, всё ещё оставляют нерешенные вопросы, могут ли действовать др. способы наследования (напр., скрытые генетические вариации), также, как и механизм, с помощью которого эпигенетическая информация сохраняется в ходе развития и в поколениях. Здесь мы рассмотрели каждую ступень, необходимую для эпигенетической памяти, со специальным упором на механизмы, которые могли бы позволить её наследование. В свете недавних, более общих обзоров 1, 63, 64 and 67, внимание было обращено на самую последнюю информацию о динамике гистонов в спермиях и на доказательства наследования эпигенетической информации по отцовской линии (Figure 3).

    Figure 3. Survival of a paternal epigenetic memory across generations. Propagation of an epigenetic memory across generations in mammals requires its passage from the original epigenetic signaling event to the germline, into the embryo and through development. Potential routes of transmission are shown with the locus of epigenetic inheritance itself depicted by a green box and the forward facing nucleosome. (A) How the epigenetic stimulus itself arrives in the developing sperm is unclear. While little is known about how the epigenetic memory remains intact through the large-scale nucleosomal restructuring that occurs during the spermatogonia to sperm transition [e.g., testis-specific histone incorporation, transition proteins (Trp) and replacement with protamines (PRM1/2)], there are a number of possibilities. With their ability to mark loci through mitosis, it is possible that bromodomain proteins may mark certain loci through this transition. Perhaps the strongest evidence is for H3K27me3 either alone or together with H3K4me3 that are retained in the mature sperm and may be propagated post-fertilization. The mechanisms involved are largely speculative, but likely involve PRC2 bridging these transitions either alone or in concert with histone chaperones such as HIRA during the dynamic nucleosome turnover throughout spermatogenesis. (B) Faithful transmission to F1 then requires survival through maternally mediated reprogramming events such as the replacement of protamines with maternal H3. Recent evidence suggests that despite this reprogramming, certain marks such as H3K27me3 might be retained from sperm through the two-cell stage. As in spermatogenesis, it remains unknown but plausible that bromodomains or other readers may similarly mark epigenetic loci. Gametogenesis also poses a threat to the epigenetic memory, however mounting evidence suggest that H3K27me3 and even H3K36me3 can be faithfully propagated throughout gametogenesis perhaps through the methyltransferase NSD1. From gametogenesis, the cycle would then repeat thus allowing propagation to F2 and on until this epigenetic memory is either diluted or otherwise erased.

    Epigenetic propagation through spermatogenesis


    Первая ступень в наследовании эпигенетической памяти нуждается в трансмиссии F0 опыта на гаметы, процесс, остающийся всё ещё неуловимым. Последующее прохождение эпигенетического сигнала через гаметогенез сталкивается с огромными трудностями в свете сложных альтераций хроматина, наблюдаемых во время сперматогенеза. Вовремя мейотической интерфазы S, трансмиссия через репликативную вилку может использовать механизмы, рассмотренные в первой части этого обзора, поскольку канонические нуклеосомы или небольшие вариации остаются в основном интактными и сходный аппарат, как было установлено, обеспечивает репликацию в митозе и мейозе [68]. Поскольку могут существовать специфичные для семенников варианты гистонов даже в ранних сперматогониях (напр., H3T), многие, по-видимому, инкорпорируются незадолго перед вторым мейотическим делением [69]. Сюда входят линкерные гистоны H1t, H1t2, HILS1, также, как и стержневые гистоны H2A.Lap1, H2AL1/2, H3T и TH2A/B [70]. Такой обмен гистонами ставит под вопрос мнение, что гистоны сами по себе могут сохранять эпигенетическую память. В частности, остается неизвестным, модифицируются ли эти варианты тем же самым способом, что и канонические гистоны и будут ли такие метки испытывать влияние со стороны канонических гистонов. Недавние доказательства подтвердили, что это в самом деле может быть возможным в принципе, т.к. TH2B сохраняется после оплодотворения [71].
    Дальнейшим осложнением выживанию эпигенетической памяти является нестабильность нуклеосом, нуждающаяся в замещении гистонов, инкорпорации временных белков и в последующей упаковке ДНК зрелых спермиев протаминами (PRM1 и PRM2 у млекопитающих). Однако рассмотрение каждой ступени необходимо, чтобы извлечь из этого перехода некоторые ключи к разгадке. Первоначально, специфичные для семенников гистоновые варианты оказываются ключевыми игроками, поскольку их кислая C терминальная поверхность ослабляет взаимодействия между ДНК и белком. Фактически TH2B истощается, и сперматогенная система компенсируется за счет увеличения модификаций в доменах стержневых гистонов (напр., crotonylation), чтобы дестабилизировать нуклеосомы [71]. Также критическим для замещения гистонов является гиперацетилирование гистонов после мейоза I [72]. Такое гиперацетилирование в конечном итоге приводит к компакции хроматина, скорее всего, благодаря связыванию bromodomain белка BRDT, который в свою очередь облегчает замещение гистонов благодаря своему шаперон-подобному действию 73 and 74. Действительно ли BRDT или др. bromodomain белки экспрессируются на высоком уровне в раннем сперматогенезе, такие как BRD2 [75], и могут метить определенные локусы, это интригующая, но не проверенная гипотеза, которая нуждается, скорее всего, в своей ассоциации с небольшим процентом гистонов, сохраняющихся во время сперматогенеза (see below). После замещения гистонов, происходит замещение протаминами, часто контролируемое посредством промежуточных переходных белков (TP1 и TP2) 70 and 76. Вполне допустима, пока не протестированная гипотеза, что протамины сами по себе несут определенную эпигенетическую информацию по выбору локусов, учитывая их пост-трансляционные модификации [77]. Одна метка, фосфорилирование серина в доменах, богатых аргинином, в PRM2, скорее всего, ослабляет ассоциацию ДНК с PRM2, окружающим эти специфические остатки, предоставляя вообще-то такую метку, но с неизвестными функциональными последствиями 77 and 78.
    Вообще-то наиболее многообещающий способ отцовского эпигенетического наследования был установлен после открытия, что гистоны, составляющие нуклеосомы, сохраняются в ходе всего сперматогенеза 79 and 80 в ~1-10% генома мыши и человека, соотв. 81 and 82. Важно отметить, что специфическая композиция этих сохраняемых нуклеосом в зрелых спермиях, неизвестна, но возможно представлена 4 стержневыми гистонами, которые обладают метками, сходными с каноническими нуклеосомами [77]. Не смотря на некоторые оставшиеся вопросы, эти сохранившиеся гистоны являются первыми кандидатами на роль эпигенетического наследования, поскольку некоторые доказательства подтверждают сохранение CpG-богатых последовательностей, лишенных метилирования ДНК, включая большое количество импринтированных локусов, а также мишеней Polycomb и Trithorax 81-83. Однако эти описания сохранения гистонов находятся в контрасте с недавними сообщениями, подтверждающими, что гистоны истощаются на на промоторах, но обогащены поверх регионов, бедных генами 84 and 85, или альтернативно имеют относительно нормальное распределение по всему геному [83]. Расхождения между этими результатами могут быть обусловлены незначительными вариациями в экспериментальной процедуре [86], поэтому необходимы дополнительные исследования, чтобы установить точную геномную локализацию нуклеосом спермия. Независимо от их точной локализации, становится ясно, что эти гистоны сохраняются и модифицируются способом, согласующимся с их значением в формировании определенных фенотипов во время эмбриогенеза. В самом деле, недавнее исследование показало, что отцовская диета м. повлиять на H3K27me3 статус в спермиях, подтверждая, что гистоны в гаметах могут приобретать и сохранять сигнатуры от эпигенетических стимулов [87].
    Поскольку имеются множественные потенциальные сигнатуры хроматина эпигенетической памяти на каждой ступени сперматогенеза, то перенос этой памяти между каждой ступенью остается в основном неизвестен. Если протамины в самом деле сохраняют и переносят эпигенетическую информацию, то CHD5 может представлять один ключевой регулятор, поскольку он, как было установлено, является критическим в контролировании множественных ступеней в переходе от гистонов к протаминам, включая гиперацетилирование гистонов, экспрессию гистоновых вариантов и временных белков, а также отложение протаминов [88]. Точный механизм действия CHD5 неясен, но он может перебрасывать мостики эпигенетических PTMs на гистоны с протаминами, учитывая предпочтительность его PHD доменов для H3, лишенных K4me3, и распознавания H3K27me3 с помощью его хромодоменов 89 and 90. Путь poly(ADP-ribose) также жизненно важный кандидат, т.к. разрушение этого пути приводит к драматическому увеличению сохранения гистонов в зрелых спермиях [91]. Др. шапероны также могут участвовать в этом процессе, т.к. разные наборы шаперонов, таких как NASP и NAP1L, скорее всего, ассоциируют с разными гистоновыми вариантами, протаминами и переходными белками в спермии [92]. Фактически, недавно было предположено, что p75 субъединица Drosophila CAF-1 может быть критической для отложения протаминов [93].
    Гистонами обеспечиваемая эпигенетическая трансмиссия через разные стадии сперматогенеза, скорее всего, использует комбинацию зависимых от репликации факторов, описанных выше во время мейоза I (напр., ASF1, CAF-1 и PCNA) и др. недавно описанные шапероны во время последних периодов зависимого от репликации оборота нуклеосом. Поскольку H3.3 в спермиях, то H3.3-специфические шапероны, такие как HIRA или ATRX/DAXX, скорее всего, участвуют. Фактически, HIRA может откладывать гистон H3.3, в частности, чтобы дестабилизировать нуклеосомы, или в присутствии RNA Pol II на сайтах старта транскрипции [94]. Обратное также может быть верным, при этом HIRA обеспечивает отложение H3.3 на локусы с репрессированным polycomb [95]. Эти наблюдения подчеркивают интересную возможность, что гистон-специфические шапероны, также, как и PRC2 могут быть критическими медиаторами, поддерживающими эпигенетическую память во время периодов высокого оборота гистонов во время сперматогенеза.

    Survival of epigenetic memory in the zygote; transfer to F1


    После успешного сохранения отцовской эпигенетической памяти в ходе гаметогенеза, такая память д. затем выживать во время драматического перепрограммирования, которое происходит в зиготе. Перед первым раундом репликации после оплодотворения, одним из инициальных репрограммирующих событий становится деконденсация пронуклеуса спермия и замещение протаминов материнскими H3.3 с помощью HIRA. Это событие является критическим для образования гетерохроматина на локусах, важных для поддержания сегрегации хроматина и геномной стабильности (напр., перицентромер; 96 and 97). Если так, то как эпигенетическая информация переносится с помощью протаминов, выживающих в этом процессе, неизвестно. Однако в противовес протаминам, гистоны, сохранившиеся в спермиях, могут персистировать в зиготе, т.к. локусы, маркированные с помощью H3K27me3, показывают, что спермии мышей продолжают обнаруживать репрессию у преимплантационных эмбрионов 82 and 83. У человека метка H3K4me3 сохраняется в спермиях и это, по-видимому, коррелирует ранней экспрессией генов у эмбриона. Следовательно, H3K27me3 и H3K4me3 могут быть ценными проводниками эпигенетического наследования, мнение, которое всё ещё нуждается в прямом тестировании. В свете доказательств, что определенные состояния хроматина (напр., бивалентные домены) могут маркировать локусы для последующего метилирования ДНК [98], интригующей возможностью является то, что CpG-ассоциированные гистоновые модификации сохраняются в ходе всего сперматогенеза и могут служить в качестве сигнала для 're'-метилирования генов, важных для эпигенетической памяти.
    Динамика хроматина в ходе первого митотического деления зиготы и затем переходы через имплантацию менее изучены. Используя методы, которые в основном выявляют модификации масс гистонов, ранние исследования подтвердили, что имеется родительская асимметрия, так что материнский пронуклеус обнаруживает концентрацию ряда гистоновых модификаций, которые относительно низки в отцовском пронуклеусе (напр., H3K9me3). Находка родительской асимметрии в комбинации с доказательствами, что PRC1 маркирует отцовский хроматин во время ранней фазы пронуклеуса, сопровождаемой становлением H3K27me3 во время первой репликации ДНК, привело к предположению, что отцовский клон первоначально предназначен для формирования гетерохроматина с помощью материнских PRC1 и Suv39h 99 and 100. Т.о., матерински обусловленное репрограммирование вызывает серьезную проблему для любой предполагаемой отцовской эпигенетической памяти. Не смотря на это крупномасштабное репрограммирование, многие отцовские эпигенетические программы, скорее всего, становятся запасными. Фактические недавнее исследование предоставило убедительный случай возможности того, что небольшая фракция гистонов, сохраняемая в спермиях, переносится в эмбрионы двухклеточной стадии и обеспечивает раннюю эмбриональную транскрипцию [91]. В этом исследовании разрушение пути poly(ADP-ribose) (напр., PARP и PARG) приводит к повышенному сохранению гистонов, отобранных локусов в спермиях, это приводит в результате к альтерации транскрипционных профилей на локусах, обогащенных гистонами. Интересно, что эти обогащенные гистонами спермии оплодотворяют яйцеклетки и дают эмбрионов (две клетки), показывая достоверную корреляцию с регионами, богатыми гистонами и профилями генной экспрессии, наблюдаемыми в спермиях. В принципе это демонстрирует, что гистоны спермиев могут оказывать значительное воздействие на ранее эмбриональное программирование и подтверждает, что любые гистоны, сохранившиеся во время сперматогенеза могут быть субстратами для передачи эпигенетической памяти даже в ходе первого митоза.
    В отношении программ распространения активной генной экспрессии, имеется еще одна непроверенная возможность, что bromodomain белки имеют метку ацетилирования и тем самым указание, что ранее активные гены важны для позднейшей активации в развивающемся эмбрионе. В самом деле недавнее исследование подтвердило правдивость этой идеи, показав, что бромодоменовые белки, такие как BRD4 или p300 могут отмечать активные гены и облегчать сохранение пре-митотической экспрессии вовремя и после митоза в соматических клетках 101 and 102.

    Epigenetic inheritance during early gametogenesis


    Наконец, критическая ступень обнаруживается в точности распространения эпигенетической памяти через зародышевую линию. Последняя критическая ступень использует строгое распространение эпигенетической памяти через зародышевую линию в развивающихся F1 эмбрионах, впоследствии передаваясь на F2. Хорошо известно, что репрограммирование зародышевой линии как метилированием ДНК, так и гистоновыми метками (напр., H3K9me2) происходит после 8-го дня эмбриогенеза 67 and 103. Как и в случае матерински обусловленного репрограммирования после оплодотворения, возникают вопросы, как выживают отцовские энграммы (engram). Элегантная работа на зародышевой линии начата, чтобы показать, что гистоновые PTMs устанавливают эпигенетические программы, которые метят отобранные локусы для дальнейшей транскрипционной активации или репрессии. Напр., у Caenorhabditis elegans, MES-4, гомолог SD семейства H3K36me3 метилтрансфераз млекопитающих, рекрутируется на гены, которые ранее экспрессировались в материнской зародышевой линии [104]. У млекопитающих взаимодействие H3K27me3, H3K4me3 и ДНК метилирования также начинают выявляться как мишени для эпигенетического программирования в ходе гаметогенеза. Для этого необходимо перемещение этих эпигенетических программ из ESC в примордиальные зародышевые клетки и самообновление, и детерминация стволовых клеток зародышевой линии у взрослых, порождая сперматоциты. Недавно было показано, что определенные эпигенетические программы, такие как бивалентность нуклеосом могут переноситься из ранних развивающихся зиготических ESC в зародышевую линию. Став стволовыми клетки зародышевой линии эти профили обнаруживают ряд типичных (напр., совместное появление H3K27me3, H3K4me3 и гипометилирования ДНК), также и атипичных профилей, таких как обогащение локус-специфичных H3K9ac, H3K4me3 и метилирование ДНК [105]. Итак, это обеспечивает специфические транскрипционные программы, которые могут переноситься через сперматогенез, предоставляя тем самым жизненно важную, еще не протестированную платформу, с которой переносится эпигенетическая память с оплодотворенного эмбриона посредством гаметогенеза( Figure 3; 105,106 and 107).

    Concluding remarks


    Despite such robust reprogramming throughout development, numerous mechanisms ranging from chromatin dynamics to non-chromatin based mechanisms may be capable of linking the seemingly impossible path from an experience at F0 to the transgenerational epigenetic inheritance of that phenotype. Many of these remain to be directly tested, but those reviewed above have emerged as leading candidates, such as those that may propagate repression in somatic cells through PRC1 and PRC2. By contrast, less is known about how heterochromatin formation might also be systematically thwarted by the concerted action of mechanisms aimed to retain active transcriptional profiles, such as those involving bromodomain-containing proteins, thereby facilitating epigenetic tagging of gene expression profiles important for epigenetic memory. What we can say for sure is that histones and other core components of chromatin clearly exert a surprising phenotypic influence over progeny at the cellular and organismal levels. Evidence to their epigenetic nature is fast progressing as some of these proteins are shown to survive the passage of replication forks and even perhaps an entire meiotic process. Such molecular 'bookmarks' are expected to facilitate a biological adaptation to changing environments but are also pertinent to disease as they regulate developmental programs. While many of these mechanisms are largely speculative and are not without caveats, they surely foster many exciting, future studies that should ultimately advance fundamental principles in basic biology and disease.