Посещений:
ЭПИГЕНЕТИКА ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК

Методы

Epigenetics reloaded: the single-cell revolution
Poonam Bheda,Robert Schneider
Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 11, November 2014, Pages 712-723

Mechanistically, how epigenetic states are inherited through cellular divisions remains an important open question in the chromatin field and beyond. Defining the heritability of epigenetic states and the underlying chromatin-based mechanisms within a population of cells is complicated due to cell heterogeneity combined with varying levels of stability of these states; thus, efforts must be focused toward single-cell analyses. The approaches presented here constitute the forefront of epigenetics research at the single-cell level using classic and innovative methods to dissect epigenetics mechanisms from the limited material available in a single cell. This review further outlines exciting future avenues of research to address the significance of epigenetic heterogeneity and the contributions of microfluidics technologies to single-cell isolation and analysis


A single-cell look at epigenetic inheritance mechanisms


В мире полной генетической предопределенности, все генетически идентичные клетки д. иметь один и тот же фенотип. Однако, мы знаем, что это не так; в многоклеточных организмах клетки подвергаются дифференцировке, чтобы давать различные клоны и даже рассматриваются одноклеточные организмы, изогенные клетки не ведут себя одинаково. Некоторые из различий между изогенными клетками могут быть приписаны стохастической гетерогенности, др. могут возникать в результате различий их эпигеномов (see Glossary).
Эпигенетические механизмы, лежащие в основе трансмиссии изменений в фенотипических признаках потомству независимо от альтераций последовательностей ДНК. Эпигенетические феномены, включая память и/или поддержание определённых транскрипционных состояний, которые сами по себе могут возникать из 'предетерминированных' программ или средовых сигналов, сохраняемых в отсутствие исходных стимулов. Такие процессы включают замалчивание генов, мозаичный эффект положения (variegation), инактивация Х хромосомы, клеточная дифференцировка и транскрипционная память 1, 2 и 3. Ключом для такой регуляции являются некодирующие РНК (ncRNAs) [4], модификации хроматина 5 and 6, модифицирующие и связывающие хроматин факторы и хромосомная архитектура [7]. Т.о., базирующиеся на хроматине механизмы являются основой эпигенетических процессов.
Эпигенетические механизмы могут наследоваться в ходе клеточных делений у одноклеточных организмов или посредством клеток и поколений у многоклеточных организмов. В отличие от высоко стабильного генома эпигенетические характеристики (signatures) неустойчивы, при этом разные эпигенетические феномены обнаруживают разную степень стабильности и изменчивости 8-10. Однако степень, с которой устанавливаются или стираются специфические эпигенетические сигнатуры предетерминирована, наследуема и и/или стохастическая, неясно. Имеется также существенная изменчивость между индивидуальными клетками по уровню специфических эпигенетических процессов. Мозаичный эффект положения является классическим примером такой межклеточной вариабельности [1]. Эта клеточная гетерогенность в комбинации с варьирующими уровнями стабильности, затрудняет определение наследуемости в популяции клеток. Поскольку популяционные эксперименты предоставляют некоторую механистическую информацию о сохраняющихся эпигенетических процессах, присутствующих в значительном проценте клеток, они упускают сложности реакций индивидуальных клеток. Поэтому было бы интересно, выяснить поддержание, наследование и вариабельность эпигенетических процессов в одиночных клетках и их потомстве (Figure 1).

Figure 1. Schematic representation of the stability, variability, and heredity of epigenetic processes in cell lineages. (A) Chromatin modifications, noncoding RNAs (ncRNAs), and chromosome architecture underlie many epigenetic mechanisms. Some of these modifications can be maintained through cell divisions even after the initiating stimulus has been removed. Different cells might have varying levels of a modification or express different levels of ncRNAs (depicted by shades of the same color) due to stochasticity or epigenomic variability. Different epigenetic processes (depicted by different colors) can also vary in stability. For example, cell-lineage specification can be associated with stably inherited chromatin modifications (purple, top panel), whereas cycling environmental conditions might be associated with less stable modifications (green, bottom panel). Following these modifications in cell lineages is essential to reveal epigenetic inheritance from progenitor cells to the following generations, here depicted as shades of cells that are maintained after division in the pedigree chart. Some modifications may be inherited for one or a few generations and then gradually lost (green), while others may be more robust (purple). (B) Variability in stability will contribute to the variance/noise level of a chromatin modification, ncRNA, or chromosome interaction and can be observed in single-cell data at a specific time point or as population-averaged data, which will result in the loss of some persistence and heredity information. In these two panels [which correspond to fluorescence-activated cell-sorting (FACS) data, for example, for the level of fluorescence that would be observed from populations of cells depicted in (A)], it can be observed that the noise/variance is maintained over time for some chromatin modifications (top panel), but can increase over time for other modifications (bottom panel); this information and the source of variability is more clearly observed in single cells with a known pedigree as in (A), which allows mathematical modeling as well as predictions.

Недавно особое внимание одиночным клеткам скорее, чем популяционным данным расширило границы разрешения анализа каждого типа и оказалось особенно информативным в расшифровке эпигенетических механизмов. Вариабельность транскрипционных реакций одиночных клеток и роль модификаций хроматина, хроматин-модифицирующих энзимов, связывающих белков и ncRNAs стало основным направлением исследований. Здесь мы представим технику исследований эпигенетики в отдельных клетках (Figure 2) и обсудим недавнюю информацию, обеспечивающую наше понимание эпигенетических механизмов.

Figure 2. Three avenues of single-cell epigenetic research. Single-cell lysate epigenomic techniques include quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR) and RNA sequencing (RNA-seq) techniques to detect RNA expression and chromosome conformation capture by Hi-C to identify inter/intrachromosomal contacts. Among chromatin modifications, only DNA methylation can be analyzed from lysates of single cells using either restriction enzyme-based single-cell methylation assay (RSMA) for PCR-based differentiation of methylation at selected loci or bisulfite conversion and sequencing [including reduced-representation bisulfite sequencing (RRBS-seq)]. Nucleosome occupancy is determined by protection against methyltransferase activity on single DNA molecules by the presence of nucleosomes. Fixed-cell methods include fluorescencein situ hybridization (FISH) techniques for both DNA and RNA, as well as immunofluorescence methods for global distributions of chromatin modifications. In situ hybridization coupled with proximity ligation assay (ISH-PLA) labels histone modifications at specific loci in single cells. Live-cell techniques using fluorescence microscopy include chromatin in vivo assay (CiA), fluorescently labeled specific antigen-binding fragments (Fabs)/Histacs, and m6A-Tracer technology. CiA employs small molecule-induced proximity for locus-specific, inducible chromatin modification. Fabs and Histacs label histone modifications by fluorescent antibodies or F?rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters involving histone fusions with modification-specific readers, respectively. In m6A-Tracer technology, a protein-DNA adenine methyltransferase fusion labels DNA with m6A when in proximity to the fusion, which is visualized by a fluorescent m6A-reader protein.



Genomic sequencing-based epigenomic methods


Роль хроматина в эпигенетических процессах сфокусировала исследования в эпигенетике в направлении множественных техник, использующих лизис в клетках популяций, чтобы анализировать экспрессию генов (transcriptomics) корреляции с состояниями хроматина, включая архитектуру хромосом, модификации хроматина и/или присутствие нуклеосом. Методы для изучения этих состояний хроматина на геномной шкале базируются на PCR или высокопроизводительных методах секвенирования ДНК, наз. 'next-generation sequencing' (NGS).
C появлением секвенирования одиночных клеток стало возможным исследование транскриптома, геномной организации и некоторых модификаций одиночных клеток на геномной шкале. Из-за ограниченности примеров эксперименты по секвенированию одиночных клеток нуждаются в выделении индивидуальных клеток (Box 1) и в амплификации шкал в очень незначительных объемах. Использование NGS, техника будет описана ниже, необходим значительный биоинформационный анализ, на сегодня это основное препятствие.

Box 1. Complementary methods: single-cell isolation and analysis techniques

Most single-cell analyses require the separation or isolation of individual cells. Here we discuss some techniques for cell isolation that can be coupled with various cell-analysis methods (Figure I). We specifically highlight the use of microfluidics for single-cell experiments, as it is employed not only for isolation but also plays a vital role in cell-analysis techniques.



Figure I. Single-cell isolation techniques.
  • Flow cytometry Flow cytometry such as FACS can rapidly handle and sort (live or fixed) cells in a high-throughput manner and can be used for single-cell isolation [66]. Using a fluorescent reporter, individual cells can be separated by gene expression or cell type. Expression of a nuclear fluorescent reporter in tissue followed by disaggregation of the tissue and purification of fluorescent nuclei by FACS has aided in the purification of tissue-specific cells (BiTS) [67]. Although BiTS was created for isolating populations of cells of the same tissue for ChIP and Hi-C purposes, this method can be adapted for single-cell purification by FACS or microfluidics.
  • Micromanipulation Micromanipulation tools can be used to hold and mechanically separate single cells, such as individual blastomeres of mouse embryos [68]. Typically, a micromanipulator uses the aid of microscopes and joysticks for fine movements of glass pipette tips that can be used, for example, to keep a cell in place or separate individual cells by aspiration.
  • Microdissection Laser-capture microdissection can be used to cut out and extract a single cell from a tissue section using a laser [69].
  • Microfluidics Microfluidics platforms are a useful accompaniment to single-cell technologies as they have significantly increased the capacity to multiplex single-cell experiments for high-throughput analyses. The main advantages of microfluidics are the automation of high-throughput experiments, reduced amounts of samples and reagents, and lower variability, making single-cell experiments feasible [70]. Single-cell microfluidics systems can visualize gene expression in live cells and can accompany cell-lysate assays where the ability to contain reactions within a small volume is vital to minimize loss of sample. Thus microfluidics has made PCR and even high-throughput sequencing analyses possible from single cells14, 15 and 33. Microfluidics has even enabled the integration of cell-sorting/compartmentalization, phenotype-observation, and lysate-based analyses 70, 71 and 72. For example, fluorescence analyzers can be coupled to microfluidics set-ups to sort cells, which are then lysed and analyzed all within the microfluidics device. These systems are highly customizable such that they can be used with many different types of cells and for many applications [73]. The two main types of microfluidics set-up that are used for single-cell epigenetics analyses are chamber based and droplet based.
  • In chamber-based microfluidics, a single liquid phase flows through a solid chamber comprising many spatially separated compartments, or microchannels, that allow the compartmentalization of cells63 and 74. Chamber-based microfluidics systems are especially suitable for both long-term live-cell imaging and single-cell lysate analysis. The continuous flow of media/buffer is laminar, allowing rapid and precise exchange of conditions with minimal mixing. Cells can be trapped in microchannels and grown in a monolayer to allow for tracking of cell lineages over several generations [75]. Chamber microfluidics designs have also enabled high-throughput screening with time-lapse microscopy of hundreds of individual live cells in >103 individual microchannels, allowing large-scale, simultaneous screening of mutants [76]. Depending on the function, microfluidics chambers can be simple in design or can contain sophisticated systems of valves for on-chip handling of single-cell capture and reagent flow[77]. These developments have facilitated single-cell multiplexed qRT-PCR and RNA-seq experiments. However, the current maximal number of compartments for single-cell analysis in a single device is approximately 4 ? 104 and thus throughput remains lower than in droplet-based microfluidics systems.
  • In droplet-based microfluidics, two immiscible liquids are used such that one liquid forms a droplet within the other continuous phase, which is used as a carrier through the microfluidics apparatus and maintains compartmentalization of the droplets 71 and 78. Each droplet can encapsulate individual cells and different reagents can be mixed by fusing multiple input droplets together. Turbulent flow within droplets ensures fast mixing such that each droplet functions as an independent microreactor. Typically, the volume of a droplet ranges from a few nanoliters down to a few picoliters, thus conferring an advantage over chamber-based systems. Using droplet-based microfluidics to select for antibody-secreting cells, it was estimated that 106 mammalian cells could be analyzed within a single experiment over a span of several hours [78]. However, not all assays are suitable for droplet-based microfluidics, for example, long-term imaging of live cells with pedigree analysis. Since individual cells are suspended within a droplet, they can move, and analyzing these cells as they grow and divide is difficult. Also, because of the lack of continuous flow, reagents in the media can be consumed in a relatively short time. In addition, it is difficult to exchange liquids in the droplet if the assay requires washing steps.


    • RNA analysis for open reading frame (ORF) and ncRNA expression: quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR) and RNA sequencing (RNA-seq)


    Методы транскриптомики определяют локус-специфические или геномные профили экспрессии. Поскольку эпигенетические изменения ассоциированы с наследуемыми эффектами в ORF и экспрессии ncRNA 11-14, то важно сравнить экспрессию РНК. Транскриптомные исследования одиночной клетки выявляя различия в профилях транскрипции между индивидуальными клетками, напр., чтобы сравнить разные клетки одного и того же эмбриона, и чтобы идентифицировать специфичные для типа клетки изменения во время развития или вариабельность среди полностью дифференцированных клеток, чтобы наблюдать различия между клетками одного и того же клеточного типа. Такие исследования базируются на анализе экспрессии РНК в одиночных клетках с помощью qRT-PCR или RNA-seq, часто используя microfluidics платформы (Box 1) 11-14. qRT-PCR используется, чтобы исследовать профиль транскрипции индивидуальных мышиных клеток от ооцита до ст. бластоциста, идентифицируя в результате ключевые эпигенетические регуляторы для каждой стадии развития [15]. Анализ экспрессии РНК также использует ncRNAs в качестве регуляторов экспрессии генов. Напр., ядерные длинные ncRNAs могут функционировать или как антисмысловые РНК или как каркасы для привлечения хроматин-модифицирующих энзимов на специфические места [16]. Данные по транскриптам одиночной клетки могут предоставить возможность более глубокого понимания вариабельности экспрессии ncRNA, предоставляя одновременно информацию о нижестоящих эффектах, влияющих на экспрессию ORF.

    Chromosome-conformation analysis: Hi-C


    Образование хромосомных петель, таких как при взаимодействиях энхансера с промоторами или при нахождении ядерных lamin-associated domains (LADs) на периферии ядра, указывает на регуляцию транскрипции и эпигенетическую память. Chromosome-conformation capture (3C) техника расшифровывает эти взаимодействия при исследованиях пространственной организации генома. Эта техника включает исходную 3C и её вариации, такие как 4C, 5C и Hi-C. При этом определяются ДНК взаимодействия с помощью серии ступеней, включая поперечные связывания взаимодействующих регионов вследствие ограничения переваривания ДНК и внутримолекулярные связи поперечно связанных кусочков ДНК 17-22. Поперечные связи затем оказываются перевернутыми (reversed), а взаимодействия ДНК обнаруживаются с помощью PCR, анализа микромассивов или секвенирования. Основным ограничением техник 3C, 4C и 5C является то, что определяются взаимодействия посредством PCR, для этого один или оба взаимодействующие кусочка ДНК д. быть известны. Альтернативно, Hi-C обходит эту потребность при определении (subjecting) связанных кусочков с помощью NGS, делая его геномным, высокопроизводительным методом определения межхромосомных и внутрихромосомных взаимодействий. Эти техники широко используются для эпигенетического анализа клеток в популяции 23-26; однако на сегодня только одно сообщение о chromosome-conformation capture в одиночных клетках. В этом основополагающем сообщении использована Hi-C технология к интактным ядрам одиночных мышиных клеток селезенки, чтобы предупредить разбавление ДНК, что приводило к усилению эффективности связи, взаимодействующих ДНК [27]. Исследование показало, что транскрипционно активные домены хроматина, расположенные на поверхности их хромосомных территорий, тогда как неактивные домены присутствуют на поверхности, ассоциированной с периферией ядра, при этом наблюдается вариабельность некоторых хромосомных контактов и устойчивость др. на геномной шкале между индивидуальными клетками. Было бы важным дальнейшее исследование хромосомных взаимодействий одиночных клеток разных типов, чтобы определить ткане- и/или организм-специфические различия в хромосомной архитектуре и консервацию этих эпигенетических механизмов.

    DNA cytosine methylation analysis: locus-specific restriction enzyme-based single-cell methylation assay (RSMA) and bisulfite sequencing


    Метилирование цитозинов в ДНК это модификации хроматина, которые обычно маркируют транскрипционно молчащие регионы генома, и оно участвует во многих эпигенетических процессах, включая геномный импринтинг и эмбриональное развитие. Статус метилирования обычно исследуется с помощью bisulfite секвенирования или RSMA. Бисульфит превращает неметилированные цитозины в урацил, тогда как метилированные и гидроксиметилированные цитозины остаются неизменными, это сопровождается амплификацией и NGS, чтобы идентифицировать сайты метилирования генома 28 and 29. В одиночных клетках его использование может приводить к гетерогенности из-за неполного превращения и деградации в результате воздействия бисульфита. Несмотря на это модифицированная версия этого метода, reduced-representation bisulfite sequencing (RRBS-seq) была использована с определенным успехом в одиночных клетках, чтобы определить статус метилирования цитозина в цитозиновых остатках по соседству с гуанином (CpGs), которые образуют большинство сайтов метилирования ДНК in vivo [30]. Этот метод также использует бисульфитное секвенирование и т.о., имеет те же самые затруднения; однако в противоположность геномному бисульфитному секвенированию ДНК переваривается до превращения с помощью уникального рестрикционного энзима, разрезая CpGs независимо от состояния метилирования. Это гарантирует, что CpGs будут расположены на концах переваренных фрагментов, снижая необходимое количество секвенирования. RRBS-seq было использовано для сравнения метилирования в CpGs в одиночных гаплоидных клетках спермиев и для индивидуальных мужского и женского пронуклеусов, изолированных из той же самой зиготы на разных стадиях, выявлено быстрое деметилирование мужских пронуклеусов и деметилирование генетических регионов, появляющихся первыми [30]. Др. недавний протокол также модифицировал традиционные протоколы обработки бисульфитом для улучшения анализа метилирования генома одиночной клетки с помощью осуществления бисульфитного превращения до секвенирования связывания адаптора, чтобы минимизировать потери секретируемых фрагментов из-за деградации адаптора во время бисульфитной обработки [31].
    Чтобы избежать ограничений бисульфитного превращения, RSMA поможет изучить метилирование ДНК с высокой аккуратностью в одиночных клетках, но только при ограниченном количестве локусов. RSMA предоставляет рестрикционные энзимы, чувствительные к метилированию ДНК, это сопровождается PCR, чтобы определять количества расщепляющихся продуктов и делать вывод, метилирована ли ДНК в определенном локусе [32]. Этот подход был использован для изучения одиночных клеток эмбрионов мыши в отношении поддержания метилирования ДНК, было установлено, что imprint химеризм, обусловленный ошибками метилирования от аберрантного эпигенетического репрограммирования по отобранным локусам приводит к непредсказуемым фенотипам и аресту развития [33]. Поскольку метилирование ДНК может варьировать существенно у разных организмов и может меняться во время развития, то исследования одиночных клеток д. предоставить новую информацию о динамике метилирования ДНК.

    Nucleosome occupancy on single DNA molecules: locus-specific nucleosome mapping


    Расположение нуклеосом, фундаментальный единиц хроматина представлено гистон-белковыми октамерами, обернутыми ДНК, оно играет важную роль в экспрессии генов, напр., путем регуляции доступности ДНК. Специфически позиционированные нуклеосомы или регионы, свободные от нуклеосом, могут эпигенетический наследоваться, чтобы поддерживать специфические паттерны генной экспрессии и поэтому картирование нуклеосом является широко используемой техникой. Имеется немного сообщений о картировании нуклеосом в одиночных участках ДНК специфических локусов 34-36, оно еще не распространено на весь геном в одной и той же клетке. Эти методы в основном базируются на метилировании цитозина с помощью GpC-специфической метилтрансферазы незащищенных GpCs (т.e., в частях ДНК, свободных от нуклеосом), это сопровождается бисульфитным превращением оставшихся неметилированнными (защищенных с помощью нуклеосом) цитозинов. Бисульфитом преобразованные фрагменты могут затем быть клонированы и секвенированными в отношении расположения нуклеосом в специфических локусах. Анализ одиночного локуса индуцибельного гена Pho5 в индивидуальных дрожжевых клетках выявил достоверную межклеточную вариабельность позиционирования нуклеосом на этом промоторе, а также корреляцию между расположением нуклеосом и экспрессией генов, это предоставило информацию о гетерогенности экспрессии генов 34 and 36.

    Chromatin analysis for localization of chromatin-associated factors and histone modifications: chromatin immunoprecipitation-quantitative PCR/sequencing (ChIP-qPCR/seq) and DNA adenine methyltransferase identification (DamID)


    ChIP-qPCR/seq используется, чтобы определить присутствие белков или гистонов на специфических геномных последовательностях. При этих методах клетки лизируются и антитела против интересующих белков или гистоновых модификаций используются, чтобы очистить ассоциированные ДНК, это сопровождается PCR или NGS, чтобы идентифицировать локализацию геномных регионов. ChIP-qPCR и ChIP-seq находятся среди наиболее широко используемых хроматиновых методов исследования популяций. Однако их использование для одиночных клеток пока отсутствует, поскольку эффективность базирующейся на антителах иммунопреципитации ограничена и выборки недостаточно обильные для амплификации. На сегодня на небольшом количестве клеток ChIP-seq и ChIP-qPCR требуют популяций, по крайней мере, из 104 или 103 клеток, соотв., хотя дальнейшее развитие microfluidics может позволить уменьшить эти количества [37]. Т.о., клеточно-специфичный ChIP пока ограничивается или гомогенными субпопуляциями отсортированных клеток или изолированных одиночных клеток, дающих популяцию клон.
    DamID ещё один метод для идентификации взаимодействий белок-ДНК. С этой целью энзим Dam сливается с интересующим белком для метилирования аденинов ДНК, которые приходят в тесную близость в результате этого слияния [38], это может быть затем идентифицировано с помощью NGS. DamID предлагает одиночный моментальный снимок истории взаимодействий между интересующим белком и ДНК, тогда как ChIP предоставляет снимок в определенный момент времени. Хотя DamID может иметь высокий фон в результате случайных взаимодействий Dam с ДНК и более низкое разрешение, чем ChIP, этот метод пригоден, когда недоступны антитела против интересующего белка. Хотя пока не сообщалось, DamID обладает более высоким потенциалом применения к одиночным клеткам, поскольку возможно амплифицирование метилированной ДНК с помощью PCR, гарантирующее, что сигнал достаточен для анализа; однако это недостаточно пригодный подход для модификацие6й гистонов, поскольку модификации не могут сливаться с белком Dam

    Locus-specific in situ hybridization methods


    Помимо анализа лизатов клеток базирующиеся на микроскопии методы визуализации используются для изучения эпигенетических механизмов в одиночных клетках. Эти инструменты, используются давно, включая in situ hybridization (ISH) и иммунофлюоресценцию (IF), чтобы сделать возможной визуализацию нуклеиновых кислот или белков, соотв. До некоторой степени эти методы были замещены техникой секвенирования генома, рассмотренной выше, поскольку они ограничивались визуализацией немногих специфических молекул или взаимодействиями во времени. Однако эти методы оказались выгодными, поскольку одиночные клетки могут быть быстро выделены и фиксированы для микроскопии и могут легко выявляться внутри гистологического образца. Многие клетки могут быть исследованы в короткое время, предоставляя статистически важные данные для анализа.

    Fixed-cell imaging of nucleic acids and proteins/chromatin modifications: fluorescent ISH (FISH) and IF


    ДНК и РНК FISH имеет преимущества в виде комплементарных oligos для флуоресцентного мечения специфических последовательностей ДНК или РНК в одиночных фиксированных клетках для визуализации их пространственной организации или экспрессии [39]. Классически IF был использован для визуализации глобального распределения модификаций хроматина в одиночных фиксированных клетках. Различные адаптации и комбинации из ISH и/или IF используются, чтобы определить экспрессию и (ко)локализацию [39]. Напр., ISH методы были адаптированы, чтобы различать между метилированной и неметилированной ДНК, предоставляя информацию о паттернах моделирования ДНК мажорных и минорных сателлитных повторах и о аберрантных гиперметилированных цитозинах раковых клеток 40 and 41. Более того, комбинированный РНК-ДНК-FISH может выявлять различия в экспрессии аллелей, тогда как РНК-FISH в комбинации с IF может быть использован, чтобы коррелировать транскрипцию или локализацию ncRNA с модификациями хроматина. FISH/IF исследования играют критическую роль в понимании и инактивации Х; в частности, в экспрессия Xist РНК и покрытие ею хромосомы следуют за транскрипционным молчанием X-сцепленных генов в цис-положении. РНК-FISH в комбинации с двойной IF показала, что длинная ncRNA Xist, которая покрывает неактивную Х хромому, ко-локализуется с репрессивной гистоновой модификацией H3K27me3, тогда как РНК полимераза в основном исключается из этих регионов в одиночных клетках [39].

    Fixed-cell imaging of histone modifications at specific loci: the ISH-proximity ligation assay (PLA) method


    Как обсуждалось выше, анализ в одиночных клетках гистоновых модификаций с помощью ChIP сегодня невозможен. Чтобы обойти это ограничение, был разработан метод наблюдения сайт-специфических гистоновых модификаций в одиночных клетках фиксированных образцов в комбинации с ISH с PLA [42]. Biotinylated комплементарные зонды были использованы для ISH на специфических ДНК последовательностях и затем антитела против биотина и интересующие гистоновые модификации комбинировали со вторичными антителами, которые имеют ДНК oligos, прикрепленные к ним. Эти oligos соединялись вместе, когда антитела соединялись в непосредственно близости. Rolling-circle амплификация затем давала несколько сот копий, соединенных oligos, которые можно определить с разрешением в одну клетку, используя флуоресцентные комплементарные oligos. Этот ISH-PLA метод делает возможной визуализацию диметилирования гистона H3K4 на специфических промоторах активных генов в одиночных гладкомышечных клетках в образцах тканей млекопитающих. Несмотря на их пригодность, техники ISH и IF не позволяют проведение time-lapse исследований на одной и той же клетке, поскольку клетки д. быть фиксированными. Однако эти методы были использованы для сравнения разных одиночных клеток в определенный период времени и в ходе развития; следовательно, time-resolved вариации ISH-PLA могут предоставлять новую информацию о модификациях хроматина в эпигенетических процессах.

    Real-time visualization methods


    Многие сообщения используют термин 'эпигенетический' для модификаций хроматина, это коррелирует с транскрипционным состоянием, которое д. сохраняться в ходе клеточных делений; однако немногие исследования оказались способны адресовать наследование локус-специфических модификаций хроматина и транскрипционных состояний, поскольку современные техники неспособны определять хроматиновые модификации с течением времени. Удовлетворение этих критериев вообще-то наиболее затруднительно, поскольку большинство одноклеточных техник нуждается в фиксации клеток или их лизисе. Чтобы действительно установить эпигенетический феномен, необходимы экспериментальные доказательства, что процесс осуществляется во времени и и через деления клеток и это требует методов с живыми клетками. В последние годы методы визуализации модификаций хроматина на уровне живых одиночных клеток были опубликованы; однако эти методы имеют ограничения в отношении визуализации модификаций на глобальных уровнях.

    Understanding epigenetic phenomena: microscopy using fluorescent reporters to detect gene expression


    Сегодня визуализация на живых клеток модификаций хроматина по определённому локусу невозможна. Чтобы обойти эту проблему эпигенетические процессы д. отслеживаться с помощью цейтраферной (time-lapse) микроскопии, используя базирующиеся на флюоресценции in vivo сообщения, такие как GFP, чтобы визуализовать экспрессию генов и наследование паттернов экспрессии в одиночных живых клетках. GFP-нагруженные фактор споруляции у Bacillus subtilis показал, что эпигенетическая память экспрессии фактора споруляции наследуется следующими поколениями, чтобы способствовать быстрой дифференцировке спор в определённых клонах [43].
    Для поиска новых факторов/модификаций, участвующих в наследовании и регуляции экспрессии генов, необходимо определить подлежащие механизмы или с помощью принципа восходящего анализа, которые д. использовать крупномасштабный скрининг для мутаций, которые нарушают или усиливают эпигенетический процесс, или принцип нисходящего анализа, который сначала коррелирует эпигенетический феномен с потенциальной транскрипцией и эпигенетическими механизмами и затем тестирует отобранные кандидаты. Такого типа скрининг был использован недавно в важной области эпигенетических исследований, нацеленных на контролируемую дифференцировку или 'репрограммирование' дифференцированных клеток в плюрипотентные клетки [44]. Используя Nanog-GFP репортер, которые экспрессируется в плюрипотентных, но не в дифференцированных клетках, скрининг нокдауна, базирующегося на малых интерферирующих РНК (siRNA), с fluorescence-activated cell-sorting (FACS) анализом был проведен (Box 1) для факторов, которые увеличивают экспрессию Nanog-GFP в индивидуальных клетках, это позитивно коррелирует с эпигенетическим репрограммированием. Скрининг идентифицировал Mbd3, компонент комплекса NuRD, который деацетилирует гистоны и ремоделирует хроматин, чтобы регулировать репрессию генов, предоставляя дельнейшие доказательства важности меток эпигенетического хроматина для развития.

    Live-cell imaging: chromatin in vivo assay (CiA) for induction of chromatin modifications to initiate gene silencing


    Недавно разработанная CiA является одной из немногих техник, адресованных динамическим модификациям гистонов и их эффектам на состояние транскрипции in vivo [45]. Базируясь на химически индуцированной близости, эта техника позволяет инициировать рекрутирование геномных локус-специфических и временно контролируемых ассоциированных с хроматином факторов, чтобы индуцировать специфические состояния хроматина, позволяющие проверку паттерна гистоновых модификаций и экспрессии нижестоящих генов. С помощью этого подхода Heterochromatin Protein 1 (HP1), известный фактор взаимодействия с гистоновыми метилтрансферазами, был рекрутирован на специфический промотор, приводя к молчанию флуоресцентного репортера в одиночных клетках. Более того, это замалчивание наследовалось в течении многих генераций. Кроме того, рекрутирование HP1 и транскрипционное молчание коррелировали с триметилированием H3K9 в этом локусе, что было определено с помощью ChIP-qPCR на популяции клеток. Этот метод также выявил, что постепенное приобретение метилирования ДНК помогает стабильно поддерживать репрессию и молчание. Т.к. CiA разработан лишь недавно, его использование по индукции др. хроматиновых модификаций в специфических сайтах дело будущего.

    Live-cell imaging of chromatin modifications: fluorescently labeled specific antigen-binding fragments (Fabs) and Histacs


    Хотя ISH-PLA и CiA продвинули нас в направлении локус-специфической визуализации гистоновых модификаций, они не пригодны для непосредственной визуализации гистоновых модификаций в специфических локусах с наблюдением живых одиночных клеток. ISH-PLA требует, чтобы клетки были фиксированы, тогда как CiA может предоставить лишь косвенные доказательства гистоновых модификаций, поскольку считывание данных является сообщением о транскрипции, а не о модификации в той же самой клетке на затронутом (targeted) локусе. Техника визуализации гистоновых модификаций на живых одиночных клетках по-прежнему остается ограниченной, при этом наиболее распространенные техники используют только отслеживание глобального распределения гистоновых модификаций с помощью флуоресцентных антител или белков, которые связаны с модификациями ('readers'). Fabs может быть внесен в живые клетки или механически (кусочками; напр., в культуру клеток) или с помощью инъекции (напр., в эмбрионы мыши), чтобы пометить эндогенные гистоновые модификации [46]. Однако, Fabs разбавляется во время клеточных делений, делая получение долговременных изображений этих клеток неосуществимым. Чтобы преодолеть это ограничение, модификациями связываемые фрагменты одноцепочечных антител (chromobody, mintbody) или специфичные к модификациям считыватели (readers) д. экспрессироваться постоянно in vivo как слияния с флуоресцентными белками (напр., GFP) 47-49, так что события деления не будут влиять на уровни флуоресцентных белков, т.к. все клетки будут постоянно экспрессировать новые белки. Однако этот подход может приводить к к высокому уровню сигнальных шумов из-за флюоресценции с экспрессируемых, но не связанных флуоресцентных белков.
    Чтобы обойти высокий уровень фоновых шумов необходимы измерения в реальном времени гистоновых модификаций с помощью базирующихся на Forster resonance-energy transfer (FRET) зондах, наз. Histacs, которые используются для визуализации состояния ацетилирования гистона H4. Histacs экспрессируются как слияния гистона H4 со специфичными для модификаций bromodomains, каждый из которых сцеплен с FRET партнерами. Статус ацетилирования H4 определяет эффективность FRET, так что, когда H4 не модифицирован, то FRET пара находится в тесной близости и продуцирует FRET сигнал. Однако, когда bromodomain связан с ацетилированным H4, эффективность FRET снижается в результате конформационных изменений в слитом белке, это увеличивает расстояние между FRET партнерами. Специфичность определенных сайтов ацетилирования управляется с помощью используемого bromodomain. Напр., в первом сообщении Histac использовался белок BRDT, который соединяется с ацетилированным гистоном H4 по K5 и K8 [50], тогда как в последующих сообщениях использовался BRD2 bromodomain для специфичности соединения с ацетилированным H4K12 [51]. Эта техника может быть использована для визуализации динамики ацетилирования H4 in vivo в течение времени, поскольку сродство связывания считывателя зависит от статуса ацетилирования. Поскольку эта методология предлагает in vivo экспрессию и обратимые низко фоновые преимущества, она также нуждается в экспрессии не эндогенных гистонов. Т.к. эпигенетическое наследование паттернов ацетилирования гистонов спорно, то техника, предлагающая визуализацию живых одиночных клеток в ходе клеточных делений, необходима, чтобы разрешить эти вопросы, но для этого необходимо дальнейшее улучшение для изучения присутствия этих модификаций в специфических геномных локусах.

    Live-cell tracking of protein-DNA interactions: m6A-Tracer technology


    Недавно разработанная технология m6A-Tracer базируется на методе DamID [52], она делает возможной визуализацию взаимодействий белок-ДНК in vivo с помощью флуоресцентной микроскопии специфического считывателя метилирования ДНК. Them6A-Tracer является methyladenine-binding domain-GFP слитым белком, экспрессирующимся в клетках, которые также экспрессируют интересующий белок, слитый с Dam, меткой, взаимодействующей с метилированным аденином ДНК (m6A). Этот подход был использован для отслеживания геномных регионов, которые взаимодействуют с ядерной ламиной (NL), также известной как LADs. Слитый lamin-Dam в клетках с m6A-Tracer чтобы визуализировать историю ассоциаций LAD с NL посредством цетраферной микроскопии одиночных живых клеток. Далее ChIP исследование клеточной популяции подтвердило, что эти LADs соответствуют гетерохроматину, маркированному диметилированным гистоном H3K9. Трассер m6A сегодня единственная техника, пригодная для отслеживания истории взаимодействий белок-ДНК в течение времени в индивидуальных клетках. m6A-Tracer может быть использован в разных комбинациях Dam слияний, чтобы количественно оценить взаимодействия между ДНК и регуляторами хроматина или их ассоциации со специфическими ядерными структурами, такими как ядрышки, хромоцентры или ядерные тельца.

    Chromatin compaction in single cells: histone multiphoton fluorescence-lifetime imaging microscopy (FLIM)-FRET


    Плотно упакованные нуклеосомы могут устранять связывание транскрипционных факторов и компонентов комплекса РНК полимеразы. Наблюдение компакции хроматина в живых клетках в основном базируется на флуоресцентных репортерах. Техника FLIM-FRET была использована для непосредственного наблюдения компакции хроматина в одиночных живых клетках [53]. Гистон H2B был слит с GFP (donor) или mCherry (acceptor), так что FRET происходит, когда H2B молекулы с соседних нуклеосом оказываются в тесной близи в результате компакции хроматина. Однако визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии может не отличать между сигналом свободного fluorophore и FRET сигналами; т.о., близость была измерена с помощью FLIM, продолжительность жизни флюоресценции донорского флюорофора, которая снижалась. когда FRET происходил между донором и акцептором, когда они оказывались в тесной близости [53]. FLIM выявил, что интерфазный хроматин не обнаруживается на двух разных уровнях компакции (т.e., в виде гетерохроматина и эухроматина), но скорее существует как спектр уплотнений (compaction). Этот метод может также предоставить информацию не только о глобальном уровне компакции хроматина в клетках и поэтому, скорее всего, будет пригоден для тестирования эффектов разных воздействий на глобальные уровни экспрессии генов.

    Single-cell epigenetics: the next generation


    Феномен настоящего мечения, такой как эпигенетика нуждается с способности отслеживания его через клеточные деления. На сегодня большинство экспериментальных техник на одиночных клетках предоставляет снимок транскрипционных профилей или состояний хроматина в определенное время, поскольку они зависят от лизиса клеток. Чтобы преодолеть эти ограничения индивидуальные клетки стали анализировать в нескольких временных точках. Поскольку это давало интересные результаты, то некоторые из из заключений стали в конечном итоге популяционно усредненными данными, т.к. каждая временная точка оказывалась усредненной по отношению к др. временным точкам от разных клеток. Большая часть информации о персистенции и наследовании теряется и динамические события, такие как транскрипционный взрыв или стохастическое переключение оказались нераспознанными.
    Чтобы полностью понять эпигенетические механизмы, мы предполагаем разработку интегрированных подходов к визуализации в живых клетках локус-специфического хроматина и РНК в динамике в одиночных клетках. Т.к. некоторые техники были приспособлены для живых одиночных клеток, но очень немногие были способны наблюдать эти эффекты на специфических локусах. Хотя пока ещё не сообщалось, мы можем вообразить дальнейшее развитие современных методов в направлении локус-специфических эпигенетических исследований. Напр., Cas9 белки и transcription activator-like effectors (TALEs) делают возможным целенаправленное нахождение геномных локусов 54 and 55; следовательно, может оказаться возможным использование FRET пар [56], обладающих дефицитом нуклеаз Cas9/TALE для специфического воздействия на локусы и Fab/chromobody/mintbody 46- 48 или считыватели [49] для модификации связывания, чтобы достичь FRET, когда определенная модификация обнаруживалась в специфицированном локусе. Этот метод д. позволить динамичную, локус-специфичную, зависимую от времени визуализацию модификаций хроматина in vivo (Figure 3). Однако основным ограничением может быть низкая чувствительность FRET, которая, по-видимому, не будет предоставлять достаточный сигнал для визуализации одиночного локуса в одиночной клетке. Для системы, базирующейся на Cas9, это может быть преодолено с помощью tiled массивов single-guide RNAs (sgRNAs), которые управляют Cas9 в его геномном локусе, и в интересующем локусе [57]. Др. возможность может быть связана с использованием комплементации флуоресцентного белка (напр., split GFP) одной половиной связанного с Cas9/TALE, а другой фрагмент, содержащей связывание модификации или считыватель модификаций. Однако половинки флуоресцентного белка часто обладают высоким сродством др. к др., что делает их взаимодействие необратимым, и, следовательно, неподходящим для визуализации динамических взаимодействий [58].

    Figure 3. Proposed method to visualize locus-specific chromatin modifications in single live cells. Cas9 fusion with a fluorescent protein could be directed to a genomic sequence by a synthetic single-guide RNA (sgRNA) and a fluorescent signal could be observed when there is fluorescent protein complementation (e.g., split GFP) or F?rster resonance energy transfer (FRET) with, for example, modification-specific antibodies (e.g., Fabs, chromobodies, mintbodies).

    Т.к. каждая техника имеет свои собственные затруднения, предложение новых методов будет важным для изучения механизмов эпигенетического наследования, базирующегося на РНК, ассоциированного с хроматином фактора в одиночных живых клетках. Эти методы будут особенно важными для эпигенетических исследований, тк. они позволяют отслеживание локус-специфических базирующихся на хроматине механизмов во многих генерациях. Напр., комбинация аналитических техник для живых клеток, как было предположено выше, и клональные маркеры позволят отслеживать наследование транскрипционных и/или хроматиновых состояний в родословных клеточных клонов, чтобы приблизиться к детальному описанию стабильности, вариабельности и наследованию эпигенетических процессов как на Figure 1.

    Concluding remarks


    The epigenetics field is influenced by the current trends for larger scale and higher throughput, but also by the need to readdress these questions at the level of individual cells to understand epigenetic and chromatin mechanisms. Hence, the field finds itself breaking ground in single-cell epigenetics. Ultimately, the benefit of single-cell epigenetic analyses will be the ability to simultaneously address the inheritance of specific chromatin states or epigenetic signatures at specific loci as one cell divides into two and to clarify the stability through generations. This information will allow a more detailed understanding of epigenetic mechanisms, for example, by identifying factors responsible for establishing and maintaining epigenetic processes. Thus, single-cell analyses are at the forefront of epigenetics research.
    Single-cell epigenetics and chromatin research has not only addressed current topics in the field, but has also raised new questions. Single-cell data have shown that there is variation in gene expression among genetically identical single-cell organisms and even phenotypically similar cells from the same cell lineage in multicellular organisms 59 and 60. These differences have mechanistically been linked to ncRNA, chromatin architecture, and chromosome dynamics 4, 5, 6 and 7. It will be interesting to see how these variabilities affect epigenetic inheritance and whether they are an important epigenetic mechanism.
    Single-cell epigenetics during the development of multicellular organisms is intriguing, as epigenetic reprogramming is required to give rise to a totipotent zygote [61]. Yet, transgenerationally inherited epigenetic traits/modifications must bypass this reprogramming. Studies of transgenerational inheritance are tracing epigenetic mechanisms from somatic cells in parents to individual germ cells as they mature and become fertilized, and further in individual cells within an embryo as it goes through developmental transitions from totipotent to pluripotent to differentiated cells, until germ cells are formed in the new organism.
    Single-cell epigenetic studies are likely to also have clinical significance. It is increasingly clear that many diseases result from a series of transitions. Disease states are often accompanied by changes to the transcriptional profile. Changes in gene expression in individual cells that give rise to clonal populations of cells might be epigenetically inherited and might play a major role in disease progression (e.g., privileged subpopulations in certain tumors that drive tumor propagation). Anticipating the epigenetic transitions of individual cells from a normal to a diseased state would have clear diagnostic value, especially if those epigenetic changes precede any disease phenotype. Thus, identifying disease- and development-associated epigenetic modifications in single-cell epigenetic analyses in vivo would aid in understanding disease processes.

    Glossary


  • Bisulfite sequencing: a method to differentiate between methylated/hydroxymethylated DNA and unmethylated DNA. Bisulfite converts unmethylated cytosines to uracil while methylated and hydroxymethylated cytosines are unaffected. Conversion is usually followed by PCR amplification and NGS to identify the methylation status 28 and 29.
  • Bromodomain: a protein domain found in some modification-reader proteins that recognizes acetylated lysine residues such as those on histones. Although conserved, bromodomains can be selective toward acetylation of specific lysine residues.
  • Cas9: RNA-guided nuclease found in Archaea and some eubacteria for immunity against foreign DNA. These proteins have been exploited for their ability to be directed to a specific genomic locus by synthetic sgRNAs, which hybridize with their complementary DNA for targeted recruitment [55]. See also TALE.
  • Chromatin: histone-DNA complex that packages DNA in the nucleus of a eukaryotic cell.
  • Chromatin immunoprecipitation (ChIP): a technique to identify genomic DNA sequences that are associated with chromatin-associated factors or histone modifications. Antibodies against proteins or histone modifications are used to purify the DNA associated with the protein or modification of interest, followed by locus-specific PCR or NGS methods.
  • Chromatin-modifying enzymes: proteins that catalyze modifications of DNA or histones.
  • DNA adenine methyltransferase identification (DamID): DamID functions by expressing a Dam fused to the protein of interest. Dam is not present in higher eukaryotes but can be expressed to methylate adenines that come in close contact with the enzyme. These methylated adenines can then be mapped, allowing the identification of binding sites in an antibody-independent approach.
  • DNA cytosine methylation: cytosines in DNA can be methylated/hydroxymethylated, which is generally associated with transcriptional repression.
  • Fluorescencein situhybridization (FISH): can detect DNA regions and nascent transcription of specific RNAs [39].
  • Forster resonance energy transfer (FRET): occurs between two chromophores when the donor chromophore excites the second acceptor chromophore when in close proximity [56].
  • Hi-C: a genome-wide, high-throughput method to detect chromosomal interactions, based on the 3C method, in which DNA interactions are detected by crosslinking of interacting regions followed by restriction digestion of the DNA and ligation of the crosslinked pieces, which are then processed in various ways. Hi-C uses biotinylation before ligation to mark ligation sites, which is subsequently used to purify ligation products, which are then sequenced by NGS 21, 22 and 62.
  • Histones: small basic proteins important for organization of DNA. The core histones H2A, H2B, H3, and H4 form octameric complexes around which DNA is wrapped, while histone H1 is bound to DNA between these octamers. Histones are modified by post-translational modifications, of which the most well known are acetylation, methylation, phosphorylation, and ubiquitination, which can, for example, affect the affinity of the histones for DNA or recruit specific binding proteins.
  • Immunofluorescence (IF): fluorescently labeled antibodies with specificity for the modification or protein of interest are used for visualization in fixed cells by microscopy.
  • m6A-Tracer: a methylated adenine (m6A)-binding domain fused to GFP that allows the visualization of adenines in DNA that have been methylated by the Dam methyltransferase [52].
  • Multiphoton fluorescence-lifetime imaging microscopy-F?rster resonance energy transfer (FLIM-FRET): a highly quantitative type of FRET (see above) in which the fluorescence lifetime of the donor fluorophore provides the readout for FRET such that the lifetime fluorescence of the donor decreases when FRET occurs when the donor and acceptor are in close proximity [53].
  • Next-generation sequencing (NGS): massively parallelized DNA-sequencing methods for high-throughput analyses 63 and 64.
  • Nucleosome: the basic unit of chromatin, a histone-DNA complex comprising approximately 146 bp of DNA wrapped around an octamer of two of each of four histone proteins (H2A, H2B, H3, and H4).
  • Quantitative reverse-transcription PCR (qRT-PCR): an RNA detection and relative quantification method. Conventional qRT-PCR uses a reverse transcriptase to make cDNA from RNA and then applies locus-specific primers to amplify the cDNA of interest.
  • RNA sequencing (RNA-seq): a method to detect RNAs globally using NGS methods 13 and 14.
  • Transcription activator-like effectors (TALEs): originally involved in bacterial infection of plants, these proteins recognize DNA sequences by specific amino acids in a variable region of a repeat domain that has been exploited for redirecting TALE fusions (e.g., with GFP) to specific DNA sequences of interest [65]. See also Cas9.