Клетки взрослых высших организмов или детерминированы к выполнению высоко специализированных целей или располагаются в пулах стволовых клеток у взрослых с ограниченным потенциалом; поскольку они обладают одной и той же генетической информацией, каждый тип клеток определяется специализированным паттерном экспрессии генов. Во время развития предшественники этих клеток определяют свою судьбу процессом ступенчато-образной дифференцировки, которая управляется с помощью множественных сигналов (позиция, передача сигналов и т. д.) и сопровождается эпигенетическими мерами, подкрепляющими выбранное решение. Эти эпигенетические изменения формируют барьеры, чтобы гарантировать, что спецификация клеточного типа является улицей с односторонним движением. Такие эпигенетические модификации стабильны и наследуемые в ходе митозов, они делают возможным верным и направленным процесс дифференцировки и распространение клон-специфического профиля транскрипции через множество клеточных делений.

Однако эти эпигенетические барьеры также мешают основной задаче полового воспроизведения, при котором подготовка к новому поколению требует перестройки (эпи)генома в базовое, тотипотентное состояние. В частности, у млекопитающих (где зародышевые клетки не определены при оплодотворении, а скорее возникают из поздней эмбриональной ткани), перестройка эпигенома имеет большое значение (Hayashi et al. 2007; Strome and Lehmann 2007). Подготовка к половому воспроизведению является трехступенчатым процессом, состоящим из (хронологической последовательности) стирания соматических сигнатур в предшественниках зародышевых клеток (primordial germ cells [PGCs]) посредством сложного процесса репрограммирования, становления пол-специфических и специфических для зародышевых клеток эпигенетических сигнатур и транскрипционных профилей, делающими возможными очень сложные и специализированные процессы мейотического созревания и оплодотворения, и, наконец, удаление после оплодотворения этих сигнатур, чтобы запустить программу эмбрионального развития и начать новый цикл жизни.

Хотя базовые принципы эпигенетического репрограммирования у эмбрионов и в зародышевых клетках известны и изучаются давно, но основные аспекты, включая динамику этих процессов, остаются загадочными. В последние годы, однако два главных успеха продвинули нас вперед в этой области. Секвенирование следующего поколения сделало возможным эпигенетический анализ всего генома даже в небольших количествах биологического материала, предоставив беспрецедентную информацию об эпигенетическом состоянии зародышевых клеток и ранних эмбрионов на многих стадиях (Borgel et al. 2010; Popp et al. 2010; Smallwood et al. 2011; Smith et al. 2012; Seisenberger et al. 2012;Hackett et al. 2013; Kobayashi et al. 2013). Более того, давний пробел в нашем понимании эпигенетического репрограммирования оказался заполненным открытием ранее ускользающих ферментативных активностей стирания метилирования ДНК в зародышевых клетках и у эмбрионов (Ito et al. 2010; He et al. 2011; Inoue and Zhang 2011; Inoue et al. 2011).

Сегодня наши знания о эпигенетическом репрограммировании накапливаются головокружительными темпами.

The fifth base-5-methylcytosine (5mC) and its functions

Метилирование пятого углерода цитозина дает 5mC, часто обозначаемый как "fifth base" кода ДНК. Метилирование ДНК широко распространено у эукариот от грибов до позвоночных, хотя его значение и функции у этих организмов существенно варьируют. Не обнаруживаемое у определенных дрожжей, нематод и мух метилирование ДНК жизненно важно для развития млекопитающих и гомеостаза у взрослых. Здесь метилирование ДНК чаще всего обнаруживается в симметричных CpG контекстах и хотя изредка метилирование происходит и в не-CpG (CpH), его функция остается неясной (Ramsahoye et al. 2000; Smallwood et al. 2011; Ziller et al. 2011). Первый глобальный метилом показал, что метилирование CpG следует бимодальному распределению (Fig. 1A). В то время как "одиночные" CpGs обычно гиперметилированы (60%-90%, в зависимости от типа клеток), CpG островки (CGIs; регионы длиной в 500-2000-пн с повышенной плотностью CpG) остаются преимущественно гипометилированными (Deaton and Bird 2011). Принимая во внимание нестабильность 5mC из-за его склонности дезаминирования в тимидин, такое бимодальное распределение может быть объяснено эволюционной недостаточной представленностью CpGs в геноме млекопитающих вне CGIs и, напротив, его обогащение неметилированными CGIs (Weber et al. 2007;Cohen et al. 2011).

Figure 1.
DNA methylation in the mammalian genome. (A) Genomic CpG distribution: CGIs are generally hypomethylated and found at promoters or intergenic regions (orphan CpG). Non-CGI CpGs are generally hypermethylated. (B) Three categories of gene promoters according to CpG density respond differently to methylation. (LCP) Low CpG density promoter; (ICP) intermediate CpG density promoter; (HCP) high CpG density promoter. (C) Retrotransposons are repressed by DNA methylation. Derepression can result in coactivation of neighboring genes. (D) Basal transcription of centromeric repeats interferes with chromosome alignment and is repressed by DNA methylation. (E) DNA methylation reinforces gene silencing on the inactivated X chromosome. Transcribed genes on the active X chromosome (and globally) display gene body methylation, possibly repressing spurious expression from cryptic transcription start sites or aiding RNA processing. (F) Genomic imprinting drives allele-specific gene expression. DNA methylation at imprinting control regions (ICRs) regulates binding of insulator proteins or expression of cis-acting, noncoding RNAs.

Role of DNA methylation in transcriptional control

Promoters

CGIs часто ассоциируют с промоторами генов, особенно онтогенетических генов и генов домашнего хозяйства, где они остаются гипометилированными даже если локус транскрипционно молчащий (Weber et al. 2007; Meissner et al. 2008; Deaton and Bird 2011). Внутригенные или межгенные CGIs ведут себя подобно CGIs промоторов, хотя их функция в геноме изучена недостаточно (Fig. 1A). Гипометилированное состояние CGIs промоторов ассоциировано со связыванием транскрипционного фактора (которое предупреждает аппарат метилирования ДНК от обнаружения этих регионов) (Brandeis et al. 1994; Lienert et al. 2011; Meissner 2011; Stadler et al. 2011) также как и со специализированным, триметилированным гистона 3 Lys4 (H3K4me3)-тяжелым состоянием хроматина (Erfurth et al. 2008; Thomson et al. 2010; Smith and Meissner 2013).

Исторически метилирование ДНК связано с репрессией транскрипции. Однако детальный анализ промоторов, ассоциированных с CGI, и их эффекта на транскрипционную активность сделал возможным их классификацию на три категории, базируясь на содержании и длине последовательности CpG (Fig. 1B; Weber et al. 2007; Meissner et al. 2008). Высокая плотность CpG в промоторе (HCPs) редко связана с метилированием ДНК, это подтверждает традиционное мнение, что метилирование ДНК репрессирует транскрипцию. Фактически редкое метилирование HCPs приводит к эффективному молчанию гена. Сходным образом, intermediate CpG density promoters (ICPs) оказываются неактивными, если метилированы (Meissner et al. 2008; Borgel et al. 2010). Однако, ICPs чаще приобретают зависимое от дифференцировки гиперметилирование; т.e., при плюрипотентности промоторы генов, где метилирование ДНК, как полагают, действует как предохраняющий механизм, чтобы укрепить молчание, (гиперметилируются?) во время дифференцировки, также как и промоторы генов, специфичные для зародышевой линии (Maatouk et al. 2006; Weber et al. 2007; Farthing et al. 2008; Meissner et al. 2008; Borgel et al. 2010). Напротив, в low CpG density promoters (LCPs), которые обычно гиперметилированы, остаются транскрипционно активными независимо от состояниях их метилирования (Weber et al. 2007; Meissner et al. 2008).

Enhancers

Энхансеры транскрипции физически взаимодействуют с промоторами генов и поддерживают тканеспецифическую дифференцировку. Подобно промоторам, энхансеры имеют характерные паттерны метилирования ДНК (Stadler et al. 2011), а гипометилирование коррелирует с активной экспрессией гена (Carone et al. 2010; Sandovici et al. 2011). Удивительно, такое метилирование энхансера, как было установлено, более тесно ассоциирует с изменениями в экспрессии генов в раковых клетках, чем само метилирование промотора (Aran et al. 2013).

Role of DNA methylation in controlling specialized regions

Transposons

Метилирование ДНК законсервировано в ходе эволюции, чтобы репрессировать эндогенные мобильные элементы, которые составляют ~40% от генома млекопитающих и тем самым вносят существенный вклад в общее состояние гипометилирования генома (Lander et al. 2001; Mouse Genome Sequencing Consortium 2002). В частности, LINEs (long interspersed nuclear elements) LTR (long terminal repeat)-содержащие элементы несут строгие, в целом гиперметилированные промоторы (Fig. 1C). Потеря метилирования может вызывать массивную активацию транскрипции и, потенциально транспозиции ретротранспозонов (Walsh et al. 1998). Дерепрессия ретротранспозонов также связана с совместным активированием соседних генов или химерных транскриптов, состоящих из ретротранспозонами переносимых элементов и эндогенных генов (Peaston et al. 2004). В частности в ооцитах и двухклеточных эмбрионах эта косвенная ретротранспозонами обусловленная регуляция генов может быть критической для успешности развития (Peaston et al. 2004; Macfarlan et al. 2012).

Pericentromeric repeats

Эти элементы обнаруживают латентную транскрипционную активность, которая репрессируется с помощью метилирования ДНК, чтобы достичь соотв. расположения и сегрегации хромосом (Fig. 1D). Важность этой репрессии доказывается редким синдромом иммунодефицита, центромерной нестабильности и лицевых аномалий (ICF), который вызывается миссенс мутациями в гене ДНК метилтрансферазы DNMT3B. Продолжающаяся транскрипция перицентромерных повторов вызывает перестройки вблизи центромер, скорее всего, возникающих в результате неправильного расположения хромосом во время митозов (Okano et al. 1999; Xu et al. 1999; Bestor 2000; Chen and Li 2004; Jin et al. 2008; Gopalakrishnan et al. 2009).

X-chromosome inactivation

Метилирование ДНК обеспечивает контроль над дозой генов путем инактивации второй Х хромосомы у самок (Fig. 1E). В случае инактивации Х-хромосомы метилирование ДНК является результатом каскада событий, начинающихся с активации цис-действующей некодирующей РНКs, Xist, которая покрывает Х хромосому, и тем самым запускает смещение транскрипционных факторов, изменения хроматина и в конечном счете метилирование CpG в CGIs промоторов. Потеря метилирования, однако, оказывает лишь слабый эффект на инактивацию Х, подтверждая, что она функционирует как долговременная страховка скорее, чем как инициатор Х инактивации. Исследования метилирования ДНК при инактивации Х привели к интересному наблюдению, что активные гены обнаруживают высокие уровни метилирования в теле генов, это указывает на репрессию транскрипции со скрытых промоторов или на более значительную доступность активно транскрибируемой ДНК для аппарата метилирования (Fig. 1E; Hellman and Chess 2007). Альтернативно, метилирование ДНК по внутригенным регионам может коррелировать с процессингом РНК и альтернативным сплайсингом, поскольку рисунки метилирования могут маркировать границы между интроном и экзоном (Hodges et al. 2009; Anastasiadou et al. 2011).

Imprinted genes

Метилирование ДНК является жизненно важным, чтобы контролировать экспрессию импринтируемых генов (Fig. 1F;Bartolomei 2009; Ferguson-Smith 2011). Характерным признаком импринтируемых генов является их экспрессия в зависимости от родительского происхождения, которая координируется с помощью дифференциального метилирования ДНК (с отцовского или материнского аллеля) в imprinting control regions (ICRs). Метилирование в ICR контролирует регион-специфические нижестоящие механизмы, такие как связывание инсуляторного белка или антисмысловая экспрессия некодирующей РНК. Это приводит к аллель-специфической экспрессии кластеров генов, которые являются генами или репрессируемыми, или активируемыми. Специфическое родительское происхождение метилирования ДНК привносится во время дифференцировки гамет и поддерживается в течение всей жизни. Геномный импринтинг, следовательно, вносит существенные осложнения в эпигенетическое репрограммирование в жизненном цикле млекопитающих, т.к. паттерны их метилирования д. первыми стираться в PGCs, восстанавливаться аллель-специфическим образом в гаметах и затем сохраняться во время эмбрионального репрограммирования. Паттерны геномного импринтинга играют важную роль в развитии и росте, а нарушение их регуляции существенно влияет на эмбриональный фенотип и может быть основной причиной дефектов у мутантов с дефицитом метилирования.

The machinery

DNA methylation

ДНК метилтрансферазы катализируют перенос метильной группы с S-adenosyl-l-methionine на пятую позицию остатка цитозина в ДНК (Chen and Li 2004). Предпочтительное расположение 5mC в симметричном контексте CpG привело к раннему предположению о наследовании метилирования ДНК с помощью полуконсервативной репликации ДНК, которая подразумевает два разных способа активности метилирования ДНК: поддержание метилирования и метилирование de novo (Holliday and Pugh 1975;Riggs 1975).

Methylation maintenance

Предпосылкой для механизма поддержания является высокое сродство с полуметилированными CpGs (т.e., метилирование палиндромного CpG только на одной нити). Первый энзим у эукариот с ДНК метилтрансферазной активностью (DNMT1) (Bestor 1988) обладал этой предсказанной функцией (Ruchirawat et al. 1987; Hitt et al. 1988; Yoder et al. 1997; Pradhan et al. 1999). Экспрессия Dnmt1 активируется с помощью зависимых от клеточного цикла транскрипционных факторов в S фазе и таким образом экспрессируется на высоком уровне в большинстве митотических клеток (Kishikawa et al. 2003). Привлекаемая с помощью своего proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-взаимодействующего партнера по связыванию, NP95, DNMT1 локализуется в фокусах репликации, где она восстанавливает полуметилированные CpGs до полного метилирования (Leonhardt et al. 1992; Arand et al. 2012). NP95 специфически привлекает DNMT1 на родительскую, метилированную нить, ориентируя энзим и его активность на вновь синтезируемую, неметилированную нить (Bostick et al. 2007; Sharif et al. 2007).

У мыши локус Dnmt1 кодирует две функционально идентичные изоформы: соматическую (Dnmt1s) и ооцит-специфическую (т.е лишь матерински экспрессируемую) изоформу (Dnmt1o) (Rouleau et al. 1992; Gaudet et al. 1998; Mertineit et al. 1998; Ding and Chaillet 2002). Делеция мышиной Dnmt1 летальна во время и после гаструляции приводит к существенной, глобальной потере метилирования ДНК (Ruchirawat et al. 1987; Hitt et al. 1988; Lei et al. 1996; Yoder et al. 1997; Kurihara et al. 2008; Arand et al. 2012). Потеря NP95 вызывает сходные дефекты (Sharif et al. 2007).

De novo methylation

Делеция Dnmt1 в мышиных эмбриональных стволовых клетках (mESCs) вызывает драматическое гипометилирование ДНК, но не полную потерю, указывая на присутствие др. энзимов с метилтрансферазной активностью. Два дополнительных энзима, DNMT3A и DNMT3B, были идентифицированы и, как было установлено, действуют как de novo ДНК метилтрансферазы (Okano et al. 1998a). Dnmt3a предоставляется матерью и преобладает в ооцитах и ранних предимплантационных эмбрионах. DNMT3A устанавливает дифференциальные паттерны метилирования ДНК в ICRs мужских и женских гамет (Kaneda et al. 2004;Kato et al. 2007). Dnmt3b транскрибируется после зиготической активации генов (ZGA) и сильно экспрессируется на ст. бластоциста, в это время она присутствует преимущественно в клоне эпибласта (Watanabe et al. 2002). Делеция Dnmt3b вызывает эмбриональную гибель, тогда как нокаут Dnmt3a дает частично жизнеспособных особей (Okano et al. 1999). Комбинированная генетическая делеция приводит к ранней эмбриональной гибели, указывая, по крайней мере, на частичное функциональное перекрывание двух энзимов (Okano et al. 1999).

Третья de novo ДНК метилтрансфераза, DNMT3L, лишена характерного N-терминального каталитического домена, но тем не менее необходима для метилирования ДНК, преимущественно для становления метилирования ICR в гаметах (Bourc'his et al. 2001; Bourc'his and Bestor 2004). DNMT3L является критическим активирующим кофактором для DNMT3A/B, это объясняет ей эффекты га метилирование несмотря на отсутствие прирожденной каталитической активности (Chedin et al. 2002; Gowher et al. 2005; Jia et al. 2007). Dnmt3l нокаутные мыши жизнеспособны, но лишены метилирования de novo в зародышевой линии, это вызывает стерильность у самцов и эмбриональную летальность эмбрионов от материнского нулевого аллеля (Bourc'his et al. 2001; Bourc'his and Bestor 2004).

Наконец, DNMT2 отличается структурно от др. ДНК метилтрансфераз, а нокаутные мыши не обнаруживают фенотипических отклонений (Okano et al. 1998b). В самом деле, DNMT2 это неправильно предложенное название, т.к. она обнаруживает метилирующую активность в отношении РНК (Goll et al. 2006).

DNA demethylation

В противоположность ферментативно контролируемому механизму прямого метилирования, прямая ДНК деметилаза, способная разрывать мостики между углеродами, пока не идентифицирована. Вместо этого несколько альтернативных, активных механизмов деметилирования, осуществляющих пассивное и косвенное деметилирование, было продемонстрировано (Wu and Zhang 2014, 2010).

Passive, replication-dependent dilution

Потеря 5mC в митотических клетках может быть достигнута с помощью подавления или исключения аппарата поддержания метилирования ДНК (DNMT1 или рекрутируемых им факторов, таких как NP95) из ядра (Fig. 2A). Хотя возможно глобальное деметилирование ДНК, пассивный механизм зависит от повторяющейся репликации ДНК и , следовательно, не может объяснить быструю потерю метилирования ДНК в медленно делящихся или не делящихся клетках. Более того, этот механизм не дает возможности локус-специфическому, а только глобальному удалению меток метилирования ДНК.

Figure 2. DNA methylation and demethylation mechanisms. (A) The palindromic nature of the CpG DNA replication creates hemimethylated DNA. DNMT1 restores hemimethylated DNA to full methylation. Absence of the DNMT1 machinery produces unmethylated DNA after a subsequent round of cell division. (Black filled circles) Methylated CpG; (white filled circles) unmethylated CpG. (B) Possible active demethylation pathways: A direct demethylase converting 5mC to cytosine is, to date, speculative. TET enzymes oxidize 5mC to 5hmC, 5fC, and 5caC. Deamination of 5mC and 5hmC, potentially by AID, produces thymidine or hydroxymethyluracil, respectively. The base excision repair (BER) mechanism may target AID deamination products and possibly 5fC and 5caC directly. Direct deformylation or decarboxylation of 5fC and 5caC has been proposed but remains speculative.

Active demethylation

Косвенное, катализируемое энзимами деметилирование ДНК может быть связано с деаминированием 5mC в тимидин с помощью activation-induced deaminase (AID) или apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 1 (APOBEC1) (Fig. 2B). Деаминирование 5mC создает T:G несоответствия, распознаваемые с помощью thymine-DNA glycosylase (TDG) или methyl-CpG-binding domain protein 4 (MBD4), которые катализируют удаление основание тимидина. Abasic сайты затем запускают механизм base pair excision repair (BER), чтобы восстановить не модифицированный цитозин, удаляя эффективно метилную метку (Fig. 2B; Morgan et al. 2004). Диапазон AID-запускаемых механизмов деметилирования ДНК, необходимый для репрограммирования в PGCs и у ранних эмбрионов спорный.

The existence of a 'sixth base'

5-hydroxymethylcytosine (5hmC) и недавно открытая диоксигеназа из семейства ten-eleven translocation (TET) (Tahiliani et al. 2009) предполагают новые возможности активного деметилирования ДНК. TET энзимы катализируют повторяющееся окисление 5mC в 5hmC и далее в 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxycytosine (5caC) (Fig. 2B; He et al. 2011; Inoue et al. 2011; Ito et al. 2011). Все три производные обнаруживаются в клетках, обладающих TET активностью, пока их биологическое значение неясно. Принимая во внимание существование декарбоксилирующих энзимов в пути утилизации отходов метаболизма пиримидина, сходные энзимы могут непосредственно восстанавливать цитозин из 5caC (Ito et al. 2010). Альтернативно, TDG, MBD4, или пока неидентифицированные glycosylase могут удалять окисленные метил-цитозиновые производные, образуя в результате abasic сайт, запускающий BER. Недавние наблюдения подтвердили, что TDG обладает непосредственным влиянием на 5fC и 5caC, не нуждаясь в предварительной ступени деаминирования (Fig. 2B; He et al. 2011; Shen et al. 2013).

5hmC может также содействовать пассивному деметилированию ДНК даже в присутствии DNMT1, которая сама по себе обладает низким сродством к 5hmC полуметилированной ДНК (Valinluck and Sowers 2007). Напротив, NP95 взаимодействует с 5mC и 5hmC. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить этот специфический механизм. Наблюдаемое дивергентное сродство ко многим партнерам по взаимодействию с 5mC и 5hmC (Valinluck and Sowers 2007; Liu et al. 2012) может указывать на др. функции 5hmC; т.e., изменение локального окружения хроматина путем рекрутирования и/или смещения зависимых от метилирования или гидроксиметилирования связываемых белков.

TET-катализируемое превращение 5mC в 5hmC является правдоподобным механизмом, делающим возможным независимое от клеточного цикла удаление метилирования ДНК. У мыши TET семейство представлено тремя членами (Tet1-3), которые дифференциально экспрессируются во время развития и во взрослых тканях (Tahiliani et al. 2009). Tet1 и Tet2 обнаруживаются в ESCs и PGCs. Tet2 экспрессия важна в гематопоэтических клетках; нокауты жизнеспособны, но обнаруживают тяжелые, летальные гематопоэтические озлокачествления в 4-6 мес возрасте (Li et al. 2011; Moran-Crusio et al. 2011; Quivoron et al. 2011; Koh and Rao 2013). Tet1 нокаутные мыши жизнеспособны, обладают ннекоторым уменьшением размера тела, указывающим на потенциальную задержку развития, а нокаутные самцы и самки имеют низкую плодовитость (Dawlaty et al. 2011; Yamaguchi et al. 2012, 2014). Учитывая их частично перекрывающиеся паттерны, предположена определенная степень функционального перекрывания Tet1 и Tet2. В самом деле, двойные нокаутных эмбрионы обнаруживают более выраженные онтогенетические дефекты, всё же потеря Tet1 и Tet2 всё ещё совместима с нормальным развитием (Dawlaty et al. 2013). Паттерн экспрессии Tet3 обнаруживает незначительное перекрывание паттернов экспрессии с экспрессией Tet1/2 и экспрессируется на высоком уровне в ооцитах, спермиях и на ранних предимплантационных стадиях. Материнская потеря Tet3 может вызывать арест развития у ряда эмбрионов (Gu et al. 2011).

Epigenetic reprogramming in PGCs: the true blank slate

Определяются ли PGCs с помощью прирожденной зародышевой плазмы ооцита (мухи, черви, лягушки и рыбы) или происходят из соматических предшественников в эмбрионе с помощью инструктивных сигналов (млекопитающие) (Fig. 3; Strome and Lehmann 2007; Saitou and Yamaji 2012). У мыши небольшая группа PGCs возникает из из проксимальной части эмбриональной эктодермы на день эмбриогенеза 6.5-7.5 (E6.5-E7.5) после получения инструктивных сигналов (самой ранней является передача сигналов BMP4) от висцеральной энтодермы и окружающей самой эмбриональной эктодермы (McLaren and Lawson 2005;Hayashi et al. 2007; Seki et al. 2007; Saitou and Yamaji 2012). Т.к. эпибласт быстро воспринимает соматические эпигенетические признаки после имплантации, то уровни метилирования ДНК и паттерны эмбриональной эктодермы у эмбрионов мыши на ст. E6.5 наиболее сильно близки к соматической ткани, чем внутренняя клеточная масса бластоциста (Borgel et al. 2010; Popp et al. 2010). В частности гены плюрипотентности (т.e., Oct4 и Nanog) и ассоциированные с CGI специфичные для зародышевой линии гены надежно репрессируются с помощью метилирования ДНК, предупреждая любые вредные эффекты, которые могут происходить, если они будут активированы эктопически (Maatouk et al. 2006; Shen et al. 2007; Weber et al. 2007; Straussman et al. 2009; Borgel et al. 2010; Arand et al. 2012; Seisenberger et al. 2012; ). Т.о., PGCs с этой точки зрения обладают профилями транскрипции, модификациями хроматина и уровнями метилирования ДНК и паттернами, характерными для их соматического происхождения (Ohinata et al. 2005; Maatouk et al. 2006; Hajkova et al. 2010; Popp et al. 2010; Seisenberger et al. 2012).

Figure 3. Biphasic demethylation dynamics in mouse PGCs. Biphasic demethylation dynamics in mouse PGCs. PGCs are derived from the embryonic ectoderm of the E6.5 embryo and display high (somatic) 5mC levels (green lines) and low 5hmC levels (red lines). Upon migration, PGCs proliferate, and 5mC levels are passively diluted. Coincidently, hemimethylated DNA strands accumulate transiently and are subsequently lost (purple dashed line). Post-migratory PGCs enter a phase of active DNA demethylation, resulting in an almost complete loss of 5mC and a transient enrichment of 5hmC. At E13.5, both 5mC and 5hmC levels are low.

Основной целью эпигенетического репрограммирования к тотипотентности, которое происходит в ранних PGCs, является завершение с помощью тщательно разработанных программ управления PGCs, удерживая их от дифференцировки и форсируя интимно связанную повторную экспрессию ключевых маркеров плюрипотентности (rev. Hayashi et al. 2007; Saitou and Yamaji 2012). Во время этого процесса PGCs пролиферируют и мигрируют из проксимальной части эпибласта вдоль задней кишки к генитальному гребню, где их геномы обнаруживают очень низкие уровни глобального метилирования ДНК (E12.5-E13.5) (Fig. 3; Popp et al. 2010; Guibert and Weber 2012; Seisenberger et al. 2012). Этот процесс репрограммирования также дает задний ход для некоторых соматических эпигенетических признаков: родительский импринтинг стирается (Hajkova et al. 2002; Sasaki and Matsui 2008), и молчащая Х хромосома реактивируется в PGCs эмбрионов самок мыши (Chuva de Sousa Lopes et al. 2008).

DNA demethylation mechanisms in PGCs

Первоначально предполагалось, что скорость пролиферации PGCs недостаточна, чтобы позволить пассивное деметилирование (Fig. 2A), и было предположено, что используются все активные механизмы деметилирования ДНК (Fig. 2B). Однако, в реальности крупное удаление по всему геному почти всех 5mCs с помощью активных способов,по-видимому, энергетически маловероятно и приводит к высокому риску двунитчатых разрывов (если задействован BER). В самом деле, недавние исследования показали, что пассивное устранение метилирования может быть достаточным для глобального деметилирования, предоставляя энергетически более подходящий, мощный механизм. С помощью методов геномного анализа небольших количеств клеток, выявляется комбинаторный, почти последовательный и вообще контекст-зависимый процесс активного и пассивного деметилирования ДНК (Fig. 3).

Passive DNA demethylation in PGCs

Замалчивание ключевых генов аппарата метилирования ДНК в PGCs д. облегчить пассивное деметилирование ДНК. На ст. E9.5, de novo метилтрансферазы (Dnmt3a/b) репрессируются и остаются действительно нерабочими в течение всего периода репрограммирования (Seki et al. 2005; Yabuta et al. 2006; Kurimoto et al. 2008;Seisenberger et al. 2012; Kagiwada et al. 2013). Кроме того, хотя поддержание метилтрансферазы Dnmt1 сохраняется в экспрессированном состоянии и белок остается многочисленным, его важный кофактор, Np95, репрессируется на ст. E9.5, а белок NP95 исключается из ядра (Kurimoto et al. 2008; Seisenberger et al. 2012; Kagiwada et al. 2013). Соотв., окрашивание DNMT1 сильно снижено в S-фазе репликационных фокусов, подтверждая плохое поддержание метилирования в PGCs. Только после ст. E12.5 уровни белка NP95 слегка увеличиваются и локализация DNMT1 на репликационных фокусах медленно восстанавливается (Kagiwada et al. 2013).

Большинство PGCs арестовывается в фазе G2 клеточного цикла, когда они мигрируют в направлении задней кишки (E7.5-E8.5), но пролиферация быстро возникает на ст. E9.5 (Fig. 3; Seki et al. 2007). В противоположность ранним данным, подтвержден 16-ч клеточный цикл в PGCs (Tam and Snow 1981) с помощью экспериментов пульсового мечения BrdU, описавших более быструю (~12 x на цикл) экспоненциальную пролиферацию вплоть до ст. E12.5, повышая существенно шансы пассивного деметилирования (Kagiwada et al. 2013). Это зависимое от репликации деметилирование ДНК создает полу-метилированные нити ДНК (Fig. 2A), которые могут в самом деле обнаруживаться с помощью секвенирования bisulfite шпилек (Arand et al. 2012), при этом увеличивается показатель у E9.5-10.5 PGCs (Fig. 3, pink dashed line;Seisenberger et al. 2012).

Bisulfite conversion (BSC) и после секвенирования из PGC происходящей ДНК показали, что деметилирование в самом деле затрагивает глобальный геном, включая промоторы, CGIs, интроны, экзоны и межгенные регионы. Однако субнабор последовательностей, включая импринтированные гены, промоторы генов, необходимых для формирования зародышевых клеток и мейоза и CGIs из неактивной Х хромосомы у самок, по-видимому, следует медленной кинетике и становится полностью гипометилированным только после втрой волны деметилирования (Fig. 3; Seisenberger et al. 2012). Наблюдаемое позднее репрограммирование differentially methylated regions (DMRs) в PGCs согласуется с некоторыми исследованиями, показавшими стирание импринтов после E11.5, когда PGCs вступают в гонады (Hajkova et al. 2002; Guibert and Weber 2012), но находится в противоречии с др. исследованиями, показавшими раннее деметилирование DMR с кинетикой, параллельной с глобальным деметилированием (Lee et al. 2002; Kagiwada et al. 2013).

Active DNA demethylation in PGCs

Двухфазный процесс деметилирования в PGCs (Guibert and Weber 2012;Seisenberger et al. 2012; Hackett et al. 2013; Yamaguchi et al. 2013) ставит вопрос, как молекулярные механизмы участвуют в этом распознавании. Скорее всего, что специфические последовательности, защищены от пассивного деметилирования в ранних PGCs, но затем деметилируются с помощью пассивного, активного или комбинации обоих способов на поздних стадиях. Превалирующая экспрессия и присутствие в ядре DNMT1, но снижение и исключение из ядра NP95 могут указывать на неканонический механизм подержания метилирования ДНК, возможно параллельно с защитой метилирования в импринтируемых генных локуса у ранних эмбрионов.

Ранние предположения о более быстрой кинетике пролиферации PGC привели к интенсивным поискам механизмов активного деметилирования ДНК в этих клетках (Hajkova et al. 2008, 2010; Feng et al. 2010; Popp et al. 2010; Wu and Zhang 2010; Cortellino et al. 2011; Dawlaty et al. 2011, 2013; Yamaguchi et al. 2012, 2013, 2014;Hackett et al. 2013; Vincent et al. 2013). AID экспрессируется на ст. E12.5 в PGCs (Morgan et al. 2004) и связано с активным деметилированием ДНК. Aid-дефицитные E13.5 PGCs обнаруживают довольно слабое увеличение уровней метилирования ДНК по сравнению с аналогами дикого типа; однако они также подвергаются очевидному глобальному деметилированию ДНК между E8.5 и E13.5 (Popp et al. 2010). Процессы генерального деметилирования в PGCs являются т.о., или AID-независимыми или компенсируются за счет др. деаминаз, возможно APOBEC белков. Однако потеря или APOBEC1, APOBEC2/3 или AID не затрагивает серьезно плодовитость (Muramatsu et al. 2000; Mikl et al. 2005; Popp et al. 2010). Влияние AID на 5mC также значительно ниже, чем на неметилированный цитозин in vitro (Neuberger and Rada 2007), а экспрессия Aid и Apobec1, по-видимому, очень низкая или отсутствует в ходе всего репрограммирования PGC (Kagiwada et al. 2013), возникает вопрос, действительно ли иди до какой степени AID и/или др. деаминазы участвуют в репрограммировании PGC. Локус-специфическая повторная проверка Aid-дефицитных PGCs, особенно по импринтируемым генетическим локусам, с использованием методов уточняющего (refined) анализа, позволит решить эти неопределенности.

Судя по уровням экспрессии мРНК, Tdg экспрессируется в PGCs (Kagiwada et al. 2013). Однако белок не был обнаружен с помощью иммунофлюоресценции (IF) (E10.5-13.5) (Hajkova 2010). Биаллельное метилирование Igf2r импринтируемого региона может быть обнаружено в Tdg мутантных PGCs, подтверждая, что TDG активность, по крайней мере, необходима для поддержания неметилированного аллеля в этом локусе. Однако, скорее всего, что гиперметилирование происходит перед спецификацией PGC , т.к. метилирование ДНК de novo репрессируется в PGCs (Cortellino et al. 2011). Компоненты пути BER были также обнаружены в PGCs (Hajkova et al. 2002), вообще-то это указывает на репарацию ДНК после активности AID/TDG или даже TET.

Принимая во внимание сомнительную экспрессию Aid, но продолжающуюся экспрессию Tet энзимов и Tdg, последовательное окисление 5mC в 5fC или 5caC, которые могут быть непосредственными мишенями для TDG, по-видимому, наиболее вероятный сценарий механизма активного деметилирования в PGCs. Предыдущие попытки оказались не в состоянии выявить резкие изменения в уровнях 5fC/5caC в ходе всего перида репрограммирования с помощью IF (Hackett et al. 2013; Yamaguchi et al. 2013). Однако до сих пор важность каждого из производных окисления 5mC остается нерешенной in vivo.

Два недавних исследования, посвящённых распределению и динамике 5hmC в PGCs, лишь увеличивали сложность нашего понимания процесса деметилирования (Hackett et al. 2013; Yamaguchi et al. 2013). Эти находки показали временное увеличение 5hmC в E9.5/E10.5 PGCs, что сопровождалось снижением уровней 5mC за счет редукции уровней 5hmC на ст. E11.5/E12.5 (Fig. 3, red and green lines). Комбинированный нокдаун Tet1 и Tet2 выявил легкое повышение уровней 5mC in vitro в генерируемых PGC-подобных клетках, всё же in vitro спецификация PGC оставалась неизменной (Hackett et al. 2013).

Детальный анализ Tet1 нокаутной линии мышей выявил снижение зародышевых клеток у самок и размера оварий. Этот фенотип, скорее всего, следствие снижения экспрессии генов, затрагивающих мейоз, которые сохраняют необыкновенно высокие уровни метилирования промоторов в мутантных гаметах (Yamaguchi et al. 2012). Недавно, TET1, как было установлено, необходим для эффективного стирания импринтов в отцовской зародышевой линии (Yamaguchi et al. 2014). Однако низкая пенетрантность фенотипа предполагает функциональное перекрывание и частичное восстановление фенотипа за счет TET2. Tet1/2 двойные нокаутные PGCs полностью лишены 5hmC (как определено с помощью IF). Интересно, что глобальные уровни 5mC не повышены в этих клетках (также определены с помощью IF), а потеря TET1/2 может быть совместима с развитием, при этом и мутантные самцы и самки сохраняют плодовитость (Dawlaty et al. 2013). Однако большинство Tet1/2-нулевых мутантов погибает во время эмбриогенеза или вскоре после рождения из-за различных аномалий (Dawlaty et al. 2013). Примечательно, потомство Tet1/2-нулевых самцов и самок обнаруживает гиперметилирование по некоторым регионам импринтированных генов, подтверждая роль 5hmC в удалении импринтов в PGCs, возможно во время второй волны деметилирования (Fig. 3). Однако эти дефекты изменчивы и даже в отсутствие TET1/2, обычное стирание импринтов может происходить у части потомства (Lee et al. 2002; Kagiwada et al. 2013). Настораживает в этих исследованиях, что они были осуществлены на смешанном генетическом фоне, что само по себе может объяснить наблюдаемую фенотипическую изменчивость (Dawlaty et al. 2013).

Germ cell specialization and sex-specific remethylation

Пол-специфическая дифференцировка мышиных эмбрионов, начинается со ст. E12.5 (McLaren 1984; Saitou and Yamaji 2012). Становление меток специфического для зародышевых клеток метилирования после репрограммирования PGC происходит в разнвое время и в разных клеточных окружениях у самцов и самок, приводя в конечном счете к паттернам, специфическим для спермиев и ооцитов (Sasaki and Matsui 2008; Saitou and Yamaji 2012). В зародышевых клетках самок уровни метилирования ДНК остаются низкими на ст. E16.5. Напротив, в то же самое время PGCs самцов уже имеют 50% глобального метилирования ДНК, поскольку повторное метилирование инициируется со ст. E14.5 в про-сперматогониях, которые арестованы в G1 фазе митоза (Kota and Feil 2010). Паттерны метилирования в зародышевых клетках самцов полностью устанавливаются к рождению (дни 19-21) и затем сохраняются в течение многих клеточных циклов митотических делений перед вступлением клеток в мейоз (Davis et al. 2000; Henckel et al. 2009). Шансы накопления ошибок метилирования ДНК и распространения мутаций, возникающих в результате спонтанного деаминирования 5hmC, во время этого длительного периода репликации и клеточных делений значительно выше у самцов, чем у самок. У самок повторное метилирование гамет начинается только при рождении во время фазы роста ооцита, тогда как яйцеклетки арестовываются в профазе мейоза I (Kota and Feil 2010).

Несмотря на различия в развитии и в динамике повторного метилирования, DNMT3L и DNMT3A необходимы в становлении пол-специфических импринтов (Bourc'his et al. 2001;Hata et al. 2002; Bourc'his and Bestor 2004; Kaneda et al. 2004; Kato et al. 2007). Потеря DNMT3A или DNMT3L у самцов вызывает катастрофический арест мейоза в сперматогониях, активацию IAPs и LINE элементов, и апоптическую потерю сперматоцитов (Walsh et al. 1998; Bourc'his and Bestor 2004). С др. стороны, de novo метилирование у поврежденных ооцитов может давать эмбрионов, погибающих на ст. E10.5 из-за отсутствия контроля импринтинга (Bourc'his et al. 2001).

Хотя центральные игроки метилирования ICR идентифицированы в дифференцирующихся зародышевых клетках, всё ещё неясно, как они доставляются к импринтируемым регионам. Есть несколько предположений, такие как последовательность специфичности, структура подлежащего хроматина и гистоновые модификации или пересечение транскрипции (Smallwood and Kelsey 2012;Strogantsev and Ferguson-Smith 2012; Kelsey and Feil 2013). Недавние успехи по расшифровке ооцит-специфичного, спермий-специфичного и специфичного для ранних эмбрионов метилома, однако пролило иной свет на специфичность импринтинга, механизмы метилирования ДНК (Smallwood et al. 2011). В дополнение к ICRs материнской зародышевой линии, которые структурно являются CGIs, более тысячи не импринтируемых CGIs также дифференциально метилируются в ооцитах по сравнению со спермиями. Однако во время репрограммирования после оплодотворения менее 15% из них действительно сохраняют свой (дифференциальный) паттерн метилирования ДНК, включая все матерински импринтируемые регионы (Smallwood et al. 2011). Поэтому новая концепция предполагает, что матерински метилируемые CGIs не подвергаются действию подлежащих последовательностей, а скорее испытывают гистоновые модификации, определяемые с помощью активной транскрипции, делающей возможным доступ для метилирования de novo (Kelsey and Feil 2013).

Epigenetic reprogramming in preimplantation embryos: selective DNA methylation maintenance

Вторая волна глобального эпигенетического репрограммирования происходит во время раннего эмбриогенеза и является критической для становления плюрипотентности. Вновь формируемые эмбрионы подвергаются массивному, глобальному деметилированию ДНК, так что оно достигается к моменту стадии раннего бластоциста (32-64 клеток), уровни метилирования оказываются самыми низкими (Fig. 4A). Однако процесс у эмбрионов отличается от такового в PGCs. Во-первых, деметилирование близкое к абсолютному в PGCs, за исключением немногих резистентных ретроэлеменов, тогда как метилирование ДНК регионов импринтируемых генов сохраняется у эмбрионов, делая возможным экспрессию генов со специфическим родительским происхождением в поздних тканях. Также импринтируемая инактивация отцовской Х, обнаруживаемая у ранних мышиных эмбрионов, не меняется на обратную вплоть до поздней ст. эпибласта. Во-вторых, геном зиготы (который содержит гаплоидный вклад от генома ооцита и спермия, каждый со своими собственными специфическими свойствами хроматина) следует иной кинетике деметилирования ДНК после оплодотворения (Fig. 4A; Mayer et al. 2000; Oswald et al. 2000; Santos et al. 2002; Santos and Dean 2004).

Figure 4. DNA demethylation dynamics and imprinting maintenance in preimplantation embryos. Active DNA demethylation of the paternal genome (A) Distinct characteristics of maternal and paternal genomes impose an epigenetic asymmetry in the zygote. The maternal genome (red pronucleus; red line) undergoes passive DNA demethylation throughout several rounds of DNA replication. The paternal genome (blue pronucleus; blue lines) undergoes active demethylation before DNA replication in the zygote ensues. Concomitant with global loss of paternal 5mC, 5hmC (blue dotted line) and the further oxidation derivatives (5fC and 5caC; blue dashed line) are enriched. Although selected loci are restored to unmodified cytosines, the bulk of paternal 5hmC is passively diluted, paralleling demethylation of the maternal genome. (B) In the zygote, STELLA prevents TET3-dependent oxidation of 5mC through binding to H3K9me2-marked chromatin (maternal genome and paternally imprinted regions) and subsequent active restoration of cytosine by BER (or other pathways). (C) Throughout early cleavage stages, DNMT1 is largely excluded from the nucleus and requires noncanonical targeting to imprinted regions by the ZFP57/TRIM28 complex binding to its methylated consensus sequence found at most ICRs. Nonimprinted regions are efficiently demethylated through replication, while ICRs are maintained by DNMT1 and DNMT3A/B. (D) At later stages of embryogenesis and in adult tissues, high DNMT1/NP95 levels during replication maintain DNA methylation by targeting hemimethylated DNA in a canonical fashion.

Геном зрелого спермия обнаруживает 80%-90% метилирования всех CpG, наивысший уровень глобального метилирования ДНК в любой из клеток мыши (Popp et al. 2010), всё же отцовский геном оказывается полностью деметилированным вскоре после образования зиготы (Fig. 4A, blue line; Mayer et al. 2000; Oswald et al. 2000). Эта потеря может быть обусловлена механизмом активного деметилирования, т.к. он завершается перед началом репликации ДНК на pronuclear stage 3 (PN3). Напротив, материнский геном обнаруживает низкие уровни глобального метилирования (~40%) и подвергается зависимому от репликации деметилированию (Fig. 4A, red line), тем самым возникает существенная эпигенетическая асимметрия в раннем эмбрионе (Fig. 4; Mayer et al. 2000; Oswald et al. 2000; Santos et al. 2002).

Противоречивые наблюдения сделаны с помощью IF анализа в зиготах и секвенирования ДНК после BSC, создающих загадку относительно деметилирования ДНК и репрограммирования. Поскольку потеря 5mC в отцовском пронуклеусе доказывается с помощью IF, BSC анализ не полностью подтверждает это наблюдение (Hajkova et al. 2008; Wossidlo et al. 2010). Только после расшифровки 5hmC, продукта окисления 5mC с помощью ТET энзимов, мы получим удовлетворительное объяснение (Gu et al. 2011; Iqbal et al. 2011; Wossidlo et al. 2011). BSC не может различать между 5mC и 5hmC, тогда как окисление 5mC удаляет эпитом, распознаваемый с помощью IF.

В самом деле, TET3 специфически локализуется в отцовском пронуклеусе (Gu et al. 2011), где он ответственен за превращение 5mC в 5hmC (Fig. 4A, dotted blue line). В его отсутствие 5hmC не обнаруживается (Gu et al. 2011; Wossidlo et al. 2011), т.о., исключается функциональное перекрывание с др. TET белками в зиготе. Отсутствие TET3 может приводить к задержке активации отцовских аллелей генов, необходимых для эмбрионального развития и становления плюрипотентного эпибласта (напр., Nanog и Oct4), это в принципе может вызывать снижение плодовитости и частичную неспособность к развитию материнских TET3-нулевых потомков (Gu et al. 2011).

The fate of paternal 5hmC

Большая часть 5mCs в отцовском огеноме гидроксилируется в поздней зиготе, но лишь немногие регионы, как было установлено, полностью возвращаются к немодифицированному цитозину перед первым делением дробления. Активность BER может объяснить эту потерю 5mC и гипометилирование промоторов Nanog и Oct4 (Gu et al. 2011). Несколько компонентов пути BER специфически располагаются в отцовском пронуклеусе; напр., XRCC1 (X-ray repair cross-complementing protein 1) крепко связан с отцовской, но не материнской ДНК (Hajkova et al. 2010; Wossidlo et al. 2010). Сопутствующие 5hmC, продукты глубокого окисления 5mC (5fC и 5caC), которые могут быть непосредственными мишенями для пути TDG/BER (He et al. 2011; Maiti and Drohat 2011), также обнаруживаются в зиготе (Fig. 4A, dotted/dashed blue lines; Inoue et al. 2011). Однако этот путь деметилирования нуждается в дальнейшем исследовании, т.к. TDG не обнаруживается в зиготах (Hajkova 2010). Безусловно, др. энзимы со сходной активностью д. осуществлять гликозилирование. Альтернативно, непосредственное декарбоксилирование 5caC было описано в др. системах (Schiesser et al. 2012).

Однако имеются также неотразимые доказательства, что отцовские 5mC активно превращаются в 5hmC (и возможно деле в 5fC и 5caC), которые затем подвергаются зависимому от репликации разбавлению в ходе последующих делений дробления (Fig. 4A, dotted/dashed blue lines; Inoue and Zhang 2011; Inoue et al. 2011). Соотв., поддерживаемая метилтрансфераза DNMT1 обнаруживает очень ограниченное сродство к окисленным производным 5mC (Hashimoto et al. 2012) и в целом исключается из ядра предимплантационных эмбрионов (Howell et al. 2001; Hirasawa et al. 2008).

Distinction of parental pronuclei

Как TET3 находят отцовский геном, не затрагивая материнский геном? До описания динамики 5hmC в зиготе, был найден белок STELLA (Payer et al. 2003), участвующий в специфической доставке, затем была выявлен аппарат активного деметилирования в ранней зиготе (Fig. 4B; Nakamura et al. 2006). В его отсутствии наблюдалась потеря 5mC в обоих пронуклеусах, сопровождаемая накоплением 5hmC в материнском пронуклеусе (Wossidlo et al. 2011). Т.о., дивергентная динамика деметилирования в материнскои и отцовском геноме в зиготе имеет следствием специфическую защиту материнского генома от TET3-обеспечиваемого окисления 5mC с помощью STELLA. Хотя STELLA, по-видимому, располагается в обоих пронуклеусах зиготы, её соединение с отцовским геномом слабое (Nakamura et al. 2012). Защитная функция специфически обеспечиваемая с помощь dimethylated histone H3 Lys9-меченного хроматина (H3K9me2), который обогащен в материнском, но не отцовском пронуклеусе (Santos et al. 2005). Это взаимодействие STELLA и H3K9me2 нуклеосом изменяет конфигурацию хроматина, предупреждая связывание и активность TET3 (Nakamura et al. 2012). Помимо своей глобальной функции в материнском геноме, STELLA также защищает два отцовски метилированных, импринтированных генетических локуса (Rasgrf1 и H19, но не IG-DMR) от аберрантного деметилирования (Nakamura et al. 2006). Эти локусы сохраняют H3K9me2-маркированный хроматин во время сперматогенеза и замену протаминов, которая обеспечивает их защиту после оплодотворения (Nakamura et al. 2012). Однако не все отцовски или матерински импринтированные регионы затрагиваются в равной степени и возможно др. механизмы (описаны ниже) действуют частично перекрываясь со STELLA (Messerschmidt 2012). Удивительно, в отсутствие STELLA, потеря метилирования ДНК в импринтированных генетических локусах в зиготе полная (Nakamura et al. 2006). Т.о., регионы импринтированных генов подвергаются активному удалению 5hmC или быстрому повторному окислению в 5caC с помощью TET3 (Wu and Zhang 2010). Интересно, что BER компонент XRCC1, который обычно исключительно располагается в отцовском геноме, найден в обоих пронуклеусах у мутантов STELLA (Hajkova 2010).

Эмбрионы, лишенные STELLA, обнаруживают тяжелые фенотипы, редко развиваясь после ст. 4-х клеток, при этом лишь немногие эмбрионы доживают до рождения. Удивительно, хотя STELLA-дефицитные эмбрионы не обнаруживают ни метилирования, ни дефектов развития до оплодотворения (Nakamura et al. 2006). Это особенно интересно, т.к. TET3 присутствует в ооцитах, но только затрагивает (в отсутствие STELLA) материнский геном после оплодотворения, в зиготическом контексте (Nakamura et al. 2006;Gu et al. 2011). Взаимодействие этих двух противодействующих факторов д. исследоваться боле детально, чтобы определить, действительно ли TET3 только предупреждает от действия на материнский геном или должен быть молекулярно нацелен на его отцовский субстрат.

Is active DNA demethylation of the paternal genome required?

Бесспорно, что глобальное деметилирование у ранних эмбрионов мыши необходимо, чтобы наложить открытое, тотипотентное или плюрипотентное состояние в формирующемся эпибласте. Однако неясно, почему только отцовский геном подвергается действию активного деметилирования или в самом ли деле активное деметилирование необходимо для всех. Хотя TET3-обусловленное деметилирование Nanog и Oct4 промоторов связано с жизнеспособностью эмбрионов, потеря TET3 тем не менее совместима с нормальным развитием (Gu et al. 2011). Фактически, эмбрионы происходящие от ооцитов, которым ввели округлые сперматиды (содержащие связанную с гистонами отцовскую ДНК, которая не деметилируется активно в зиготе), могут развиваться в жизнеспособных мышат (Polanski et al. 2008). У др. видов млекопитающих активное деметилирование отцовского генома сопровождается непосредственным de novo повторным метилированием до параллельного пассивного деметилирования материнского и отцовского генома (Fulka et al. 2004;Park et al. 2007; Abdalla et al. 2009). Т.о., поскольку активное деметилирование отцовского генома является выгодным, вообще-то оно просто предоставляет дополнительные меры для гарантии эффективного репрограммирования. Др. гипотеза заключается в том, что ооцит запрограммирован, чтобы удалять отличающиеся отцовские эпигенетические признаки, это может предоставить дополнительные преимущества любому индивидуальному эмбриону. Это в "интересе матери" распределять ресурсы поровну среди ее потомства, вызывая потребность к удалению любых отцовских эпигенетических меток, которые бы способствовали бы в пользу определенного эмбриона (Moore and Haig 1991). Более детальные исследования д.б. адресованы 5hmC и локус-специфическому деметилированию у эмбрионов, происходящих из округлых сперматид, это связано с base-resolution мнением на динамику 5mC и продуктов его окисления, необходимых для углубленного понимания этих процессов.

Passive DNA demethylation and maintenance of parental imprints

Материнский геном, по крайней мере, глобально, резистентен к гидроксилированию с помощью TET3, всё же несмотря на потерю большей части специфичного для ооцитов паттерна метилирования ДНК за счет обусловленной репликацией растворения 5mC во время преидмплантационного развития (Fig. 4A, red line). В этом случае пассивная потеря 5mC достигается с помощью исключения из ядра DNMT1 (Howell et al. 2001; Ratnam et al. 2002; Branco et al. 2008; Hirasawa et al. 2008) скорее, чем подавления NP95, как это предполагается для PGCs (Kagiwada et al. 2013).

Исключение из ядра DNMT1, однако, выдвигает проблему необходимости поддержания геномных импринтов и др. последовательностей, которые д. сохранять паттерны своего метилирования ДНК в ходе развития. Хотя зиготическая делеция DNMT1, как известно, вызывает массивную потерю метилирования ДНК как глобальной, так и импринтированных генных локусов, и является эмбриональной леталью (Li et al. 1992, 1993), роль DNMT1 у ранних предимплантационных эмбрионов была выявлена лишь недавно. Специфичная для ооцитов форма DNMT1 (DNMT1o) , как было установлено, необходима для поддержания импринтов только во время одного клеточного цикла на ст. 8-клеток, где DNMT1o , как было установлено, временно транслоцируется в ядро (Carlson et al. 1992; Howell et al. 2001; Ratnam et al. 2002). Поскольку соматическая форма DNMT1 (DNMT1s) не обнаруживается вплоть до ст. бластоциста, поддержание импринтов во время ранних делений дробления приписывается неидентифицированным ДНК метлитрансферазам. Повторная проверка экспрессии и функции DNMT3A, DNMT3B и DNMT1o/s наконец-то разрешила вопрос сначала с помощью исключения de novo ДНК метилтрансфераз в поддержании генерального импринтинга у эмбриона (Hirasawa et al. 2008). Полный (материнский и зиготический) нокаут DNMT1, однако, полностью устранял метилирование ДНК во всех импринтируемых генных локусах (Cirio et al. 2008; Hirasawa et al. 2008; Kurihara et al. 2008). Т.о., DNMT1o и DNMT1s вносят вклад в поддержание метилирования ДНК в импринтируемых регионах даже если большие количества белка исключены из ядра (Branco et al. 2008).

Noncanonical targeting of DNMT1 to imprinted regions in preimplantation embryos

DNMT1 необходима для поддержания импринтов, всё же в то же самое время уровни её ядерного белка сильно снижены, чтобы сделать возможным глобальное деметилирование. Как DNMT1 доставляется к импринтируемым генным локусам? STELLA необходима для поддержания импринтинга. Однако, глобальное связывание STELLA's и защита всего материнского генома от активного деметилирования делает её маловероятным кандидатом на роль поддержания метилирования ДНК в специфических локусах. ZFP57, Krueppel-associated box (KRAB) доменовый белок цинковые пальчики, также оказался ассоциированным с поддержанием импринтинга (Fig. 4C; Li et al. 2008; Mackay et al. 2008). Потеря ZFP57 у эмбрионов мыши и в ESCs вызывает гипометилирование как отцовских, так и материнских ICRs и неправильную регуляцию импринтированных генов (Li et al. 2008; Quenneville et al. 2011; Zuo et al. 2012). Эта функция ZFP57 эволюционно законсервирована; у человека мутации потери функции также приводят к гипометилированию ICR, вызывая в конечном итоге временный, диабет новорожденных (Mackay et al. 2006, 2008).

KRAB белки цинковые пальчики часто действуют как эпигенетические репрессоры благодаря своему взаимодействию с TRIM28. TRIM28 является компонентом многофункционального репрессорного комплекса, состоящего, напр., в данном случае, из нуклеосомы ремоделирующего и гистоны деацтилирующего (NuRD) комплекса, H3K9me3-catalyzing гистоновой метилтрансферазы SETDB1, гетерохроматиновго белка 1 (HP1) и ДНК метилтрансфераз DNMT1, DNMT3A и DNMT3B (Fig. 4C; Schultz et al. 2001,2002; Iyengar and Farnham 2011; Quenneville et al. 2011; Zuo et al. 2012). В то время как дефекты поддержания метилирования ДНК менее выражены у зиготических ZFP57 мутантов и отсутствие материнского ZFP57 замещается экспрессией отцовского Zfp57 (Li et al. 2008), потеря материнского Trim28 в отдельности является эмбриональной леталью (Messerschmidt et al. 2012). Время гибели и эмбриональные фенотипы материнских Trim28 мутантов чрезвычайно изменчивы, также как и появление гипометилирования некоторых материнских и отцовских ICRs (Messerschmidt et al. 2012). Анализ метилирования ДНК индивидуальных бластомеров подтвердил, что стохастические, случайные дефекты метилирования (и фенотипы) базируются на мозаичной композиции ранних Trim28 материнских нулевых эмбрионов, несущих обычно и аберрантно импринтированные генетические локусы (Messerschmidt 2012; Messerschmidt et al. 2012; Lorthongpanich et al. 2013).

Связывание обоих белков и присутствие H3K9me3, продукта комплекса TRIM28, было выявлено в импринтируемых локусах эмбрионов (Messerschmidt et al. 2012) и в mESCs (Quenneville et al. 2011). Будучи ДНК-связывающим транскрипционным фактором, локализация ZFP57 в ICRs открывает захватывающую перспективу сиквенс-специфического распознавания и поддержания импринтируемых локусов. В самом деле, анализ последовательностей локусов, обогащенных H3K9me3, TRIM28, и ZFP57, как было установлено с помощью иммунопреципитации хроматина (ChIP) в комбинации с глубоким секвенированием (ChIP-seq) в mESCs, выявило консенсус из 6 нуклеотидов в сайте распознавания в ZFP57 (TGCCGC), который очень консервативен в 81 из 91 идентифицированных (H3K9me3/TRIM28/ZFP57) сайтов (Quenneville et al. 2011). Удивительно, соединение TRIM28 с гипометилированными сайтами устранялось у эмбрионов с Trim28 материнским нулевым доменом и не восстанавливалось после повторной экспрессии TRIM28 с отцовского аллеля на ст. 2-х и 4-х клеток, указывая тем самым, что метилирование ДНК, зависит от связывания комплекса ZFP57/TRIM28. Фактически, ZFP57 обладал значительно более высоким сродством связывания с его метилированным консенсусом сайта связывания in vitro (Quenneville et al. 2011; Liu et al. 2012). Будучи утерянным метилирование ДНК не может быть восстановлено с помощью комплекса ZFP57/TRIM28 in vivo (Messerschmidt et al. 2012) или эктопической повторной экспрессии ZFP57 в Zfp57-дефицитных ESCs (Zuo et al. 2012). Подчеркнем, взаимодействие TRIM28 с DNMT1/NP95 подтверждает не каноническую, ZFP57-обусловленную доставку аппарата поддержания метилирования ДНК на ICRs у предимплантационных эмбрионов (Fig. 4C). Такой способ доставки д. компенсировать резкое снижение ядерной DNMT1 во время ранних делений дробления и тем самым сделать возможным поддержание метилирования ДНК в импринтируемых регионах (Messerschmidt 2012). Только на поздних эмбриональных стадиях, после того, как уровни DNMT1 значительно увеличиваются в ядрах, осуществляется каноническое поддержание метилирования ДНК (Fig. 4D).

Поддержание метилирования в импринтируемых регионах у предимплантационных эмбрионов, как полагали, очень сильное до тех пор, пока анализ метилирования по своему геному не показал, что даже ICRs частично деметилированы, особенно в периферических регионах (Tomizawa et al. 2011; Kobayashi et al. 2012). такая потеря, однако, имеет мало или не имеет последствий на то как долго сам сайт связывания ZFP57 будет оставаться метилированным и будет подвергаться действию комплекса ZFP57/TRIM28. Энзимы De novo метилирования DNMT3A и DNMT3B, которые также обнаруживаются в комплексе ZFP57/TRIM28 (Quenneville et al. 2011; Zuo et al. 2012), могут объяснить восстановление метилирования ДНК в этих периферических регионах на поздних ст. развития (Tomizawa et al. 2011; Kobayashi et al. 2012).

Наконец, принимая во внимание, что механизмы метилирования ДНК действуют во время раннего эмбрионального развития, резкое снижение уровней метилирования ожидается и действительно обнаруживается на поздних предимплантационных стадиях. Неожиданно, помимо импринтированных генов и ретротранспозонов , существенное количество дифференциально метилированных CGIs в специфических для ооцитов и в субнаборе специфических для спермиев метилированных регионов сохраняют метилирование ДНК на значительно более высоких уровнях, чем ожидалось при беспрепятственном пассивном деметилировании ДНК (Smallwood et al. 2011; Kobayashi et al. 2012). Остается посмотреть, действительно ли эти CGIs, как это было показано для ICRs, обнаруживаются и защищаются с помощью ZFP57/TRIM28, др. KRAB белков цинковые пальчики или за счет совершенно иных механизмов.

Concluding remarks

The veritable flood of new, genome-wide methylation data and insights into epigenetic reprogramming of embryos and PGCs allows us to view this process from a new angle. It is now clear that passive DNA demethylation is the most parsimonious mechanism of both PGCs and preimplantation embryos and is probably sufficient for that purpose. Moreover, the exact time and concentration of gene products at specific sites in the genome are now clarified. Nevertheless, these new insights also accentuate the limitations of our current understanding of the reprogramming process. Although global, genome-wide methylation and demethylation pathways have been identified, their disruption produces embryos with less than fully penetrant phenotypes, leading to confounding and confusing interpretations (Li et al. 2008; Popp et al. 2010; Dawlaty et al. 2011, 2013; Gu et al. 2011; Messerschmidt et al. 2012; Yamaguchi et al. 2012). Loss of TET3 in the early embryo, for instance, causes developmental arrest in only a subset of embryos, which is likely the result of delayed activation of the paternal pluripotency genes (Gu et al. 2011). Nonetheless, in wild-type embryos, the bulk of paternal 5mC undergoes conversion to 5hmC, which is then passively removed over subsequent cleavages. However, TET3-independent passive demethylation also occurs in the maternal genome, thus calling into question the significance of the conversion of the global paternal genome. Similarly, TET1/2-mediated oxidation in PGCs might have a broader genomic range than merely to ensure robust demethylation of meiotic and imprinted genes. It is therefore prudent not to assume active reversion to unmodified cytosine if TET-mediated oxidation is involved; divergent biological function and relevance of 5mC and 5hmC must also be considered.

We are far from understanding active DNA demethylation. The direct removal of 5mC or its deamination via AID/APOBECs has still not been conclusively addressed in vivo. TET-dependent demethylation can occur via multiple, interconnected pathways (Wu and Zhang 2010, 2014). However, even in the absence of TETs, AID, APOBECs, etc., PGCs and early embryos can develop into functional gametes or give rise to live pups, although often inefficiently. The long-term transgenerational effects of epigenetic defects in these surviving pups have yet to be addressed. Therefore, it appears that several redundant, fail-safe proofing mechanisms have evolved to act in parallel to ensure the profound erasure of epigenetic marks. Future experiments addressing these redundancies will determine whether the enzymes mediating active demethylation do indeed act in separate, parallel pathways or upstream of or downstream from one another.

With new experimental data, more parallels between PGC and embryo reprogramming have begun to manifest themselves. The protection of imprinted regions in the embryo is demonstrated in PGCs, where imprinted and meiotic genes appear to be specifically targeted for demethylation after being excluded from the wave of passive demethylation. Whether this delay is of functional significance or merely a byproduct of the imprint-specific maintenance mode evolved in embryos yet impacting on PGCs remains to be seen. Importantly, demethylation of imprinted regions following the same kinetics as that of the bulk of the genome has also been observed (Kagiwada et al. 2013), and even in the absence of TET enzymes, meiotic and imprinted genes are eventually reprogrammed (Dawlaty et al. 2013). This is in clear contrast to the case of the early embryo, where it is vital that DNA methylation http://genesdev.cshlp.org/content/28/8/812/F1.expansion.htmlmaintenance of imprints is never overcome.

The novel concept of noncanonical DNA methylation maintenance in the face of reprogramming is now well established during preimplantation development. ZFP57/TRIM28-mediated targeting of scarce nuclear DNMT1 protein to imprinted gene regions ensures their faithful maintenance (Messerschmidt 2012). Are genes such as Trim28 and Zfp57 also expressed in PGCs, and do they influence the demethylation dynamics of these regions? Preliminary findings suggest that ZFP57-binding sites are enriched in "late demethylating" genomic regions (Seisenberger et al. 2012). Also, in preimplantation embryos, DNA methylation maintenance may go beyond imprinting. Many other transiently, differentially methylated regions detected in oocytes are protected through the blastocyst stage (Smallwood et al. 2011; Kobayashi et al. 2012; Smith et al. 2012). Furthermore, ChIP-seq in mESCs has identified numerous additional ZFP57 targets in addition to known imprinted regions. These findings offer an exciting prospect that merits closer scrutiny (Quenneville et al. 2011). Although ZFP57 is the only TRIM28-interacting KRAB zinc finger protein known to display methylation-dependent DNA binding, it is possible that other KRAB family members with similar properties mediate analogous functions at different target sites.

The overall question is: Why do mammals exhibit these complex epigenetic reprogramming processes in the first place? Does the goal of totipotency, which entails such developmental flexibility, offset the lack of guiding, developmental determinants found in frogs, flies, fish, or worms? Did these processes evolve to enable and preserve genomic imprinting as an essential mechanism for mammalian development? Epigenetic reprogramming differs in details among mammalian species, suggesting that demethylation-methylation in PGCs and subsequent demethylation-methylation in the embryo are novel mechanisms and that we are witnessing the evolutionary selection of the optimal one.

DNA methylation dynamics during epigenetic reprogramming in the germline and preimplantation embryos Daniel M. Messerschmidt, Barbara B. Knowles and Davor Solter doi: 10.1101/gad.234294.113 Genes & Dev. 2014. 28: 812-828

DNA methylation dynamics during epigenetic reprogramming in the germline and preimplantation embryos
Daniel M. Messerschmidt, Barbara B. Knowles and Davor Solter
doi: 10.1101/gad.234294.113 Genes & Dev. 2014. 28: 812-828