Посещений:
МОРФОГЕНЕЗ ЭКВАТОРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ХРУСТАЛИКА

Роль EphA2 and Src

EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development
Catherine Cheng, Moham M. Ansari, Jonathan A. Cooper and Xiaohua Gong
Development140, 4237-4245. 2013

High refractive index and transparency of the eye lens require uniformly shaped and precisely aligned lens fiber cells. During lens development, equatorial epithelial cells undergo cell-to-cell alignment to form meridional rows of hexagonal cells. The mechanism that controls this morphogenesis from randomly packed cuboidal epithelial cells to highly organized hexagonal fiber cells remains unknown. In Epha2-/- mouse lenses, equatorial epithelial cells fail to form precisely aligned meridional rows; moreover, the lens fulcrum, where the apical tips of elongating epithelial cells constrict to form an anchor point before fiber cell differentiation and elongation at the equator, is disrupted. Phosphorylated Src-Y424 and cortactin-Y466, actin and EphA2 cluster at the vertices of wild-type hexagonal epithelial cells in organized meridional rows. However, phosphorylated Src and phosphorylated cortactin are not detected in disorganized Epha2-/- cells with altered F-actin distribution. E-cadherin junctions, which are normally located at the basal-lateral ends of equatorial epithelial cells and are diminished in newly differentiating fiber cells, become widely distributed in the apical, lateral and basal sides of epithelial cells and persist in differentiating fiber cells in Epha2-/- lenses. Src-/- equatorial epithelial cells also fail to form precisely aligned meridional rows and lens fulcrum. These results indicate that EphA2/Src signaling is essential for the formation of the lens fulcrum. EphA2 also regulates Src/cortactin/F-actin complexes at the vertices of hexagonal equatorial cells for cell-to-cell alignment. This mechanistic information explains how EphA2 mutations lead to disorganized lens cells that subsequently contribute to altered refractive index and cataracts in humans and mice.


Рисунки к статье

Катаракта определяется как любое помутнение хрусталика, остается ведущей причиной слепоты (Asbell et al., 2005). Хрусталик это бессосудистая, прозрачная, высоко преломляющая и двояковыпуклая структура, которая фокусирует световые изображения на сетчатку. Хрусталик состоит из монослоя эпителиальных клеток, которые покрывают спереди полушарие из большого количества удлиненных волокон и он покрыт базальной мембраной, наз. капсулой хрусталика. Механизмы, которые регулируют рост, гомеостаз и продолжающуюся всю жизнь прозрачность хрусталика всё ещё недостаточно изучены. Во время раннего развития задние клетки хрусталика удлиняются формируя первичные волокна, тогда как передние клетки дифференцируются в эпителиальные клетки. В течение всей жизни эпителиальные клетки хрусталика постоянно дифференцируются в клетки вторичных волокон на экваторе хрусталика (Piatigorsky, 1981). Высокий индекс рефракции и пожизненная прозрачность хрусталика базируются на точном расположении клеток хрусталиковых волокон, которые накладываются на предыдущие генерации клеток волокон концентрическим способом. Межклеточная организация начинает формироваться, когда экваториальные эпителиальные клетки подвергаются морфогенезу, чтобы сформировать меридиональные ряды гексогональных клеток непосредственно перед дифференцировкой клеток волокон и элонгацией на экваторе хрусталика (Bassnett et al., 1999).
Одним из ключевых событий во время развития хрусталика является гексогональная форма и геометрия упаковки клеток хрусталиковых волокон, которые являются гексогональными на поперечном разрезе и плотно упакованы, чтобы устранить межклеточные пространства, тем самым устанавливается высокий индекс рефракции и минимизируется рассеивание света (Kuszak, 1995). Структурная организация сократительных и адгезивных элементов (N-cadherin/actin/myosin) необходима для упаковки клеток и соотв. миграции и расположения клеток удлиняющихся волокон (Bassnett et al., 1999). N-cadherin/actin комплексы формируют гексогональную решетку на базальных концах клеток волокон с помощью контрактильных белков миозина и caldesmon, которые располагаются в центре клетки волокна (Bassnett et al., 1999). F-actin пучки одной клетки выравниваются с таковыми соседней клетки. Paxillin, myosin light chain kinase (MLCK) и focal adhesion kinase (FAK) также обнаруживаются в комплексах базальной мембраны клеток волокон. Tropomodulin 1 также необходим для поддержания гексогональной геометрии внутренних клеток хрусталиковых волокон у мышей (Nowak et al., 2009). Однако ничего неизвестно о механизмах, контролирующих инициацию на экваторе хрусталика межклеточного расположения, когда случайно упакованные пре-экваториальные эпителиальные клетки оказываются организованными в меридиональные ряды из гексогональных клеток на экваторе хрусталика.
Недавние исследования, включая нашу работу, сообщили, что мутации EphA2 или ephrin A5 вызывают катаракту с изменчивой тяжестью или неполной пенетрантностью у людей и мышей (Cheng and Gong, 2011; Cooper et al., 2008; Jun et al., 2009; Kaul et al., 2010; Masoodi et al., 2012;Park et al., 2012; Shi et al., 2012; Shiels et al., 2008; Sundaresan et al., 2012; Tan et al., 2011; Zhang et al., 2009). Двунаправленные сигналы, обеспечиваемые закрепленными на мембране ephrins и Eph рецепторными тирозин киназами играют важные роли в широком наборе событий межклеточного распознавания, включая нахождение пути аксонами, раннюю сегментацию и морфогенез органов путем модулирования клеточных отталкивающих и притягивающих сигналов через множественные нижестоящие белки, такие как Ras/Rho, MAP kinase, Akt или FAK, которые являются критическими для внутриклеточной сигнальной трансдукции и цитосклетной динамики (Arvanitis and Davy, 2008;Himanen et al., 2007; Kullander and Klein, 2002). Eph рецепторные киназы обеспечивают сигналы прямой связи в одной клетке, тогда как ephrin лиганды осуществляют передачу сигналов в противоположном направлении в соседней клетке (Davy et al., 1999; Holland et al., 1996). Eph семейство рецепторных тирозин киназ включает 16 членов, подразделяемых на EphA (1 - 10) и EphB (1 - 6) киназы. Семейство ephrin лигандов подразделяется на ephrin-A (1 - 5) и ephrin-B (1 - 4 и 6). EphA рецепторы преимущественно соединяются с glycosyl-phosphatidylinositol (GPI)-закрепленными ephrin-A лигандами, тогда как EphB рецепторы соединяются с трансмембранными ephrin-B лигандами. Каждый рецептор взаимодействует со множественными лигандами и vice versa. Кроме того, также могут происходить перекрестные взаимодействия между EphA и ephrin-B или между EphB и ephrin-A. Напр., EphA4 и EphB2 взаимодействуют с ephrin B2 и ephrin A5, соотв. (Himanen et al., 2004; Takemoto et al., 2002). Комплементарные или перекрывающиеся паттерны экспрессии Ephs и ephrins подтверждают разнообразие функций передачи сигналов Eph-ephrin в тканевом развитии и гомеостазе (Poliakov et al., 2004). Eph-ephrin двунаправленные сигналы возникают как главные межклеточные зависимые от контактов коммуникации, чтобы координировать не только онтогенетические процессы, но и также нормальную физиологию и гомеостаз зрелых органов. Измененная функция Eph-ephrin вносит вклад в разные болезни (Pasquale, 2008).
Передача сигналов Eph-ephrin важна для прозрачности хрусталика. Мутации EPHA2 вызывают у человека врожденные доминантные (Park et al., 2012; Zhang et al., 2009) и рецессивные (Kaul et al., 2010) катаракты. Кроме того, не-синонимные SNPs в EPHA2 оказались сцепленными связанными с возрастом кортикальными катарактами у людей (Masoodi et al., 2012; Shiels et al., 2008; Sundaresan et al., 2012; Tan et al., 2011). У мышей потеря EphA2 нарушает структуру и организацию клеток хрусталиковых волокон, ассоциированных с изменениями N-cadherin адгезивных соединений (Cheng and Gong, 2011; Jun et al., 2009), а также вызывает повышенную стрессовую реакцию, что отражается повышением уровней Hsp27 (Hspb2) (Jun et al., 2009). Epha2-/- нокаутные хрусталики обнаруживают существенные изменения рефракторного индекса (Shi et al., 2012). Efna5-/- мыши обнаруживают тяжелые связанные с возрастом ядерные катаракты (Cooper et al., 2008) или передние катаракты (Cheng and Gong, 2011) в зависимости от генетического фона линии и это отличает их от Epha2-/- хрусталиковых фенотипов. Неясно, как мутации EphA2 или ephrin A5 приводят к таким патологическим изменениям или почему изменчивые фенотипы хрусталиков появляются у Epha2-/- или Efna5-/- мышей.
В данном исследовании мы продемонстрировали, что EphA2 необходим для образования хрусталиковой точки опоры (fulcrum) и организованных меридиональных рядов гексогональных, дифференцирующихся, хрусталиковых экваториальных эпителиальных клеток. Потеря EphA2 приводит к отсутствию хрусталиковой fulcrum, дезорганизации меридиональных рядов, изменению формы экваториальных эпителиальных клеток и в конечном итоге к нарушению расположения клеток хрусталиковых волокон. EphA2 является важным для активации и фосфорилирования Src и cortactin, которые в свою очередь рекрутируют F-actin на верхушки экваториальных гексогональных клеток. Этот сигнальный каскад Eph/Src контролирует морфогенез хрусталиковых экваториальных клеток во время развития. Отсутствие EphA2 устраняет активацию Src и др. нижестоящую регуляцию, чтобы разрушить хрусталиковую fulcrum и расположение вновь дифференцированных гексогональных клеток на экваторе хрусталика, это затем вносит вклад в нарушение рефрактерного индекса и прозрачности хрусталика.

DISCUSSION


Эта работа показала, что передача сигналов EphA2 и активация Src являются важными частями сигнального каскада, который контролирует образование хрусталиковой fulcrum организацию меридиональных рядов гексогональных эпителиальных клеток во время морфогенеза хрусталиковых экваториальных клеток (Fig. 8). Двунаправленная передача сигналов EphA2/ephrin фосфорилирует нижестоящие молекулы, включая Src и cortactin, чтобы регулировать динамику актинового цитоскелета. Актиновый цитоскелет контролирует форму клеток, межклеточные взаимодействия и/или миграцию, которые необходимы для образования организованных меридиональных рядов. и Epha2-/- и Src-/- хрусталики обнаруживают нарушение хрусталиковых fulcrums и неправильное расположение экваториальных эпителиальных клеток. Без EphA2, ни Src, ни cortactin не фосфорилируются (не активируются) на верхушках клеток, и измененные актиновые филаменты нарушают образование организованных меридиональных рядов и гексогональную форму Epha2-/- эпителиальных клеток. Т.о., EphA2 и Src являются ключевыми сигнальными молекулами, которые контролируют морфогенез и дифференцировку хрусталиковых экваториальных клеток во время развития.
Механизм инициации накопления EphA2 на верхушках экваториальных эпителиальных клеток остается неясным. Образование кластеров EphA важно для её киназной активности, чтобы регулировать нижестоящие мишени (Groves and Kuriyan, 2010; Salaita et al., 2010; Xu et al., 2011). Предполагается, что образование кластеров EphA2 (или лигандов ephrin) является одним из ранних или инициальных событий, которые запускают нижестоящую передачу сигналов посредством Src и cortactin. чтобы рекрутировать актин на верхушки гексогональных клеток в меридиональных рядах. EphA2 рецепторы, как известно, собираются в кластеры на клеточной мембране путем само-олигомеризации или посредством взаимодействия с ephrin лигандами (Himanen et al., 2010; Salaita et al., 2010). Центр кластера EphA2 обладает наивысшим уровнем фосфорилирования тирозина и наитеснейшей клеточной адгезией с субстратом, это приводит к реорганизации актинового цитоскелета. Необходимы дальнейшие исследования ephrin лигандов для выяснения механизма образования кластеров EphA2 в эпителиальных клетках экватора хрусталика.
Удивительно, что и фосфорилированная Src и фосфорилированный cortactin отсутствуют в Epha2-/- эпителиальных клетках. Активация Src в основном базируется на передаче сигналов EphA2 на экваторе хрусталика. Данные по хрусталикам Src-/- подтверждают, что активация Src является важной для формирования хрусталиковой fulcrum и организации меридиональных рядов и Src также, по-видимому, частично ответственна за организацию клеток хрусталиковых волокон. Активация Src играет ключевую роль в морфогенезе экваториальных клеток хрусталика, возможно регулируя изменения в актиновом цитоскелете. Src, как известно, участвует в клеточном гомеостазе и в большом количестве физиологических функций, включая пролиферацию и жизнеспособность клеток и контроль формы клеток, регуляцию цитоскелета, поддержание нормальных межклеточных контактов, динамику адгезий клетка-матрикс. подвижность и миграцию (Thomas and Brugge, 1997; Yeatman, 2004). Src обеспечивает основные события передачи сигналов от receptor tyrosine kinases (RTKs) и от адгезивных рецепторов, включая интегрины и E-cadherin (Bjorge et al., 2000). RTKs и адгезивные рецепторы могут действовать синергично, чтобы повлиять на жизнеспособность, пролиферацию, организацию цитоскелета и инвазию клеток и эти рецепторы могут непосредственно ассоциировать с сигнальными комплексами, в которых Src используется в качестве общей сигнальной молекулы (Abram and Courtneidge, 2000; Huveneers and Danen, 2009; McLean et al., 2005).
Интересно, эта работа подтверждает, что активация Src в пространстве и во времени контролируется с помощью EphA2, чтобы регулировать расположение клеток на экваторе хрусталика. Известно, что EphA2 может непосредственно фосфорилировать Src в др. типах клеток (Parri et al., 2007). Важно изучить др. молекулы, которые участвуют в ограниченной активации Src и cortactin, чтобы создать организованные меридиональные ряды для элонгации и дифференцировки клеток волокон. Недавно сообщалось, что Fyn, др. член семейства Src, используется, чтобы регулировать N-cadherin соединения клеток хрусталиковых волокон в хрусталиках кур (Leonard et al., 2013). Т.к. нарушение клеток хрусталиковых волокон у Src-/- менее тяжелые, чем в клетках хрусталиковых волокон Epha2-/- (Fig. 7B), то возможно, что EphA2 может также контролировать и др. члены семейства Src, такие как Fyn, чтобы регулировать клеточные соединения и F-actin для организации и поддержания клеток волокон в хрусталиках мышей. Изучение а эксплантах хрусталика кур и перепелов подтвердило, что Src может участвовать в возникновении задних капсулярных катаракт и кортикальных катаракт (Leonard et al., 2013; Walker et al., 2007; Zhou et al., 2007; Zhou and Menko, 2004). Однако не сообщалось, что Src непосредственно ассоциирует с катарактами человека. Необходимы дальнейшие исследования, чтоб понять участие белков семейства Src в нарушениях хрусталиков у человека.
Фосфорилирование cortactin зависит от присутствия EphA2 в эпителиальных клетках экватора, организованных в меридиональные ряды. Предыдущая работа подтвердила, что фосфорилирование cortactin способствует миграции клеток. Cortactin ассоциирует с F-actin цитоскелетом посредством F-actin-связывающих тандемных cortactin повторов и N-терминального кислого домена, который взаимодействует с комплексом actin-related protein (Arp) 2/3 для нуклеации дендритного актина (Kelley et al., 2010; May, 2001). C-конец cortactin взаимодействует с FAK в фокальных адгезиях и может быть фосфорилированным с помощью комплекса FAK-Src (Tomar et al., 2012; Wang et al., 2011). Фосфорилирование тирозина cortactin с помощью комплекса FAK-Srcуменьшает его взаимодействие с FAK, скорее всего, за счет увеличения оборота фокальных адгезий, чтобы способствовать подвижности клеток в др. типах клеток. Сходный механизм может управлять подвижностью и реструктуированием клеток, когда экваторальные эпителиальные клетки подвергаются изменениям своей формы, чтобы выстроиться в меридиональные ряды. Однако, изменения в cortactin д. быть или причиной или результатом измененной организации в Epha2-/- экваториальных эпителиальных клетках.
Было предположено, что путь двунаправленной передачи сигналов Eph-ephrin и молекуля соединений эпителиальных клеток работают в тесном сотрудничестве, чтобы регулировать целостность эпителиальных клеток или осуществлять процессы клеточной сортировки во время пролиферации и дифференцировки эпителиальных (Miao and Wang, 2009). Активация EphA2 изменяет экспрессию E-cadherin и снижает межклеточную и клетка-матрикс адгезию (Zantek et al., 1999), а активация или подавление E-cadherin также может нарушать экспрессию Eph рецепторов или ephrin лигандов (Orsulic and Kemler, 2000). Ephs и ephrins выполняют двойную роль в облегчении сортировки клеток в противоположные компартменты путём завершения коммуникаций между компартментами посредством щелевых соединений (Mellitzer et al., 1999). Наши данные подтверждают, что EphA2-зависимая активация Src и cortactin, скорее всего, является ключевой передачей сигналов, которая рекрутирует актиновые филаменты, чтобы сформировать базально-латеральные клеточные верхушки для становления гексогональной формы клеток и для контроля точной организации эпителиальных клеток в меридиональные ряды. Однако, в хрусталиковом fulcrum, EphA2-зависимая активация Src инициирует накопление E-cadherin и F-actin без фосфорилирования cortactin. Предположительно, что разные F-actin-связывающие белки участвуют в хрусталиковом fulcrum. Потеря EphA2 предупреждает активацию Src-Y424 и фосфорилирование cortactin-Y466, это приводит к изменениям в распределении F-actin и E-cadherin белков, приводя к изменениям базально-латеральной формы клеток и межклеточного выстраивания при переходе от эпителиальных к клеткам волокон на экваторе хрусталика.
Наши результаты подтверждают, что EphA2 и Src контролируют образование хрусталикового fulcrum на апикальных концах экваториальных эпителиальных клеток, также как и локализацию cortactin/F-actin комплекса на базально-латеральных верхушках этих гексогональных клеток на экваторе хрусталика. Активация Src на апикальных кончиках (lens fulcrum) и на верхушках гексогональных экваториальных эпителиальных клеток контролируется исключительно с помощью EphA2. Активация Src важна для образования хрусталикового fulcrum и организации меридиональных рядов (cell-to-cell alignment) на экваторе хрусталика. Хрусталики Src-/- не имеют ожидаемого помутнения и не имеют дефектов, наблюдаемых в Src-/- сетчатке и роговице. Следовательно, дефекты в Src-/- хрусталиках, скорее всего, являются не вторичными эффектами, обусловленными аномалиями др. тканей глаз. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять развитие др. тканей глаз у Src-/- мышей. Интересно, что в противовес Epha2-/- хрусталикам, которые имеют нормальный вес хрусталиков, но тяжело нарушенную организацию клеток волокон, Src-/- хрусталики обнаруживают ~15% уменьшение веса хрусталиков с незначительными изменениями клеток волокон (data not shown). Фенотипическая изменчивость между Epha2-/- и Src-/- клетками хрусталиковых волокон указывает на то, что др. RTKs, скорее всего, контролируют активацию Src, чтобы регулировать пролиферацию эпителиальных клеток хрусталика и размер хрусталика; др. члены семейства Src, такие как Fyn, могут действовать на нижестоящие мишени для передачи сигналов EphA2/ephrin , регулируя организацию клеток хрусталиковых волокон воздействуя на локализацию N-cadherin (Jun et al., 2009; Leonard et al., 2013). Данная работа согласуется с недавним исследованием, показавшим дезорганизацию хрусталиковых клеток и изменение рефрактерного индекса в Epha2-/- хрусталиках(Shi et al., 2012). Дисфункция EphA2 , обусловленная мутациями и др. воздействиями, скорее всего, нарушает морфогенез клеток хрусталиковых волокон, нарушает организацию и взаимодействия между клетками хрусталиковых волокон, вызывает аномальный индекс рефракции и приводит к врожденным и зависимым от возраста катарактам у человека и мыши (Jun et al., 2009; Kaul et al., 2010; Park et al., 2012; Shiels et al., 2008; Sundaresan et al., 2012; Tan et al., 2011; Zhang et al., 2009).