Наше индивидуальное тело имеет ограниченный срок жизни. Однако благодаря оплодотворению мы способны продолжать жизнь как вид. Роль сперматозоидов заключается в оплодотворении яиц. Однако спермии млекопитающих не могут выполнить этой цели, будучи эйякулироваными. Они д. сначала подвергнуться физиологическому изменению, наз. capacitation и последующим морфологическим изменениям, известным как акросомная реакция на репродуктивный тракт самок. Сперматозоиды также обладают способностью мигрировать в яйцевод, где они взаимодействуют с и впоследствии сливаются с яйцом. Ряд факторов, которые вносят вклад во взаимодействие спермия и яйцеклетки, были идентифицированы, базируясь на наблюдениях с использованием ингибиторов энзимов и антител в системе оплодотворения in vitro (Box 1). Эти исследования привели к заключению, что различные энзимы спермия внутри акросомы растворяют компоненты яйца и что разнообразные мембранные белки используются для соединения с яйцеклетками. Однако недавние эксперименты с использованием нарушения генов таких факторов не приводили к фенотипу бесплодия, указывая тем самым, что они не важны для оплодотворения, хотя они и в самом деле играют роль во время события оплодотворения. Напротив, использование in vivo экспериментов по генному таргетингу, показало, что ряд белков неожиданно появился как важные факторы для оплодотворения. В этом Primer, я обсуждаю факторы, которые участвуют на разных стадиях оплодотворения, в пределах от capacitation и миграции спермиев до слияния спермия с яйцеклеткой.

Box 1. Studying fertilization in vitro

In vitro fertilization (IVF) requires different elements for different species. In mice, eggs are usually collected from the oviduct after treatment with hormones that induce super ovulation. The eggs are introduced into a tiny drop of IVF medium on a dish covered by paraffin oil and cultivated under 5% CO2 in air. Spermatozoa from mice are normally prepared by squeezing them out from an opening made in the epididymis, followed by suspension in IVF medium; alternatively, ejaculated spermatozoa are utilized in larger animals after washing with medium. The spermatozoa are introduced into the egg culture drop at a final concentration of ?1?105 spermatozoa/ml (note that IVF requires a large number of spermatozoa compared with fertilization in vivo, in which only a few spermatozoa are required per egg). The success of fertilization can be assessed by observing: (1) spermatozoa inside the ZP; (2) the formation of pronuclei; or (3) the formation of two-cell embryos. The eggs fertilized by IVF can also be transferred into oviducts of pseudo-pregnant females to assess the developmental outcome of these embryos. When antibodies or inhibitors added to the IVF medium successfully inhibit fertilization, the factors that these antibodies and inhibitors target have traditionally have been viewed as fertilization-related factors.

The nature of eggs

При рождении яичники содержат фиксированное количество ооцитов, заключенных в примордиальные фолликулы. Это количество снижается в результате овуляций и атрезии во время репродуктивной жизни женщины (Faddy, 2000). Ооциты арестованы на dictyate стадии первого мейотического деления. Со временем когорты ооцитов вступают в фазу роста и оказываются самыми крупными клетками тела, их диаметр достигает почти 80 µm и 100 µm у мыши и человека, соотв. Во время роста яйцеклетки образуют внеклеточный матрикс, наз. zona pellucida (ZP) за счет секреции гликопротеинов (Fig. 1A). В яйцеклетках человека ZP из 4-х ZP гликопротеинов (ZP1 - ZP4), тогда как в яйцеклетки мыши она состоит из 3-х ZP белков (ZP1 to ZP3; мышиный Zp4 является псевдогеном). Fig. 1.

Рост ооцитов всё время поддерживается окружающими зернистыми (granulosa) клетками, которые пролиферируют и образуют множественные слои из cumulus клеток, которые окружают овулирующее яйцо (Fig. 1A). Cumulus клетки поддерживают оплодотворение, а оплодотворение in vitro может быть достигнуто более эффективно с ними, чем без них (Jin et al., 2011; Tokuhiro et al., 2012). Молекулярные основы этих наблюдений остаются неясными; однако немногие исследования изучали функцию cumulus клеток (Oren-Benaroya et al., 2008; Shimada et al., 2008).

После мейотического созревания яйцеклетки овулируют, готовясь к оплодотворению. После овуляции яйцеклетки высвобождаются (picked up) за счет адгезии между внеклеточным матриксом кумулюсных клеток и клетками яйцеводов из бахромы яйцеводов и затем переносятся в яйцевод (Talbot et al., 2003). Яйцеклетки затем транспортируются в ампульную порцию яйцевода, где они дожидаются сперматозоидов для оплодотворения. Однако существует лишь короткий промежуток 'окно оплодотворения', менее одного дня после овуляции у женщин (Wilcox et al., 1995) и нескольких часов у мышей, во время которого происходит успешное оплодотворение.

The nature of spermatozoa

В семенниках мужчин продуцируется ~1000 сперматозоидов в секунду (Amann and Howards, 1980), хотя причина, почему самцы млекопитающих продуцируют столь много сперматозоидов, чтобы оплодотворить столь немногие яйцеклетки, неясна. Сперматозоиды продуцируются в семенниках и переносятся в эпидидимусы, где они получают различные белки (Busso et al., 2007), возможно частично за счет структуры, наз. epididymosome (Frenette et al., 2010). Сперматозоиды созревают (Fig. 1B), пока они остаются неспособными оплодотворять яйца. Согласно Yanagimachi, мембрана спермиев остается 'биологически замороженной' до тех пор, пока сперматозоиды не покинут тело самца, когда начинается процесс 'размораживания' известный как capacitation, который необходим сперматозоидам, чтобы стать компетентными к оплодотворению (Yanagimachi, 1994).

Во время capacitation происходят различные физиологические изменения в головке, акросоме и хвосте сперматозоида, которые биологически 'размораживают' сперматозоиды и подготавливают их к оплодотворению (Fig. 1B). Известно, что сперматозоиды в суспензии гетерогенны и поэтому, когда суспензия спермиев считается уже активированной (capacitated), определенный процент сперматозоидов в этой суспензии уже деградирует. Многочисленные работы обсуждают фосфорилирование белков спермиев во время capacitation, но неясны механизмы, приводящие к capacitation (Bailey, 2010; Visconti et al., 2011). Это может быть обусловлено , по крайней мере частично, гетерогенностью сперматозоидов.

Глюкоза является важной для успешной capacitation. Она не только служит как источник энергии, позволяющий сперматозоидам плавать, но и также делает сперматозоиды способными к оплодотворению яиц (Goodson et al., 2012; Okabe et al., 1986). Cholesterol, bicarbonate, intracellular Ca²⁺ и многие др. факторы также участвуют в capacitation (Bailey, 2010;Evans, 2012; Florman and Ducibella, 2006; Yanagimachi, 1994); однако точные молекулярные механизмы, лежащие в основе их действия, всё ещё неизвестны.

Как только происходит капацитация сперматозоиды демонстрируют энергичный паттерн плавания, наз. гиперактивацией, движения рассматриваются как дающие сперматозоидам значительную проталкивающую силу, которая позволяет им пронизывать ZP. Оно характеризуется асимметричными биениями жгутика, состоящих из про- и анти-крючкообразных изгибов, сопровождаемых увеличением в цитоплазме Ca²⁺. Специфичные для спермиев CatSper ионные каналы, как полагают, контролируют внутриклеточные концентрации Ca²⁺ и тем самым поведение плавания сперматозоидов (Chang and Suarez, 2011). CatSper1 - 4 важны для оплодотворения у мышей (Qi et al., 2007). Более того, CatSper каналы, по-видимому, активируются прогестероном в сперматозоидах человека (Brenker et al., 2012; Lishko et al., 2011), это интересно в отношении взаимодействий спермий-яйцо, поскольку кумулюсные клетки, как известно, продуцируют прогестерон. Однако прогестерон не описан как активатор мышиных сперматозоидов.

После capacitation, финальной ступенью в развитии спермиев перед оплодотворением является акросомная реакция (Fig. 1B). Акросома, которая является субклеточной органеллой, расположенной на апикальном кончике головки спермия, заполнена разнообразными литическими ферментами и ZP-связывающими белками. За счет плохо изученных механизмов, которые используют SNARE белки (De Blas et al., 2005), плазматическая мембрана и наружная акросомная мембрана сливаются и содержимое акросомы выходит в окружающую среду (Yanagimachi, 1994). Этот процесс обозначается как акросомная реакция, он делает сперматозоиды способным пройти через ZP.

Factors regulating fertilization

Оплодотворение сложный многоступенчатый процесс, с использованием созревания и развития сперматозоидов и яиц, сопровождаемое миграцией спермиев в яйцеводах, заканчивающееся взаимодействием спермия и яйца и их слиянием. Выявляются различные факторы, которые играют роль в каждом из этих событий.

Классическая модель оплодотворения была в основном сфокусирована на зоне связывания спермия и индуцируемой зоной акросомной реакции, исходя из экспериментов in vitro, и многие факторы были постулированы, как необходимые для оплодотворения. Со временем, однако, гены, кодирующие эти факторы, были клонированы и их роль была исследована в экспериментах с разрушением генов у мышей (Box 2). Неожиданно, почти все из них не обнаруживали или давали очень минорные фенотипические отклонения в оплодотворении (Ikawa et al., 2010); хотя они могут играть роль, но нокауты этих индивидуальных факторов не влияли на оплодотворение. Кроме того, начали возникать различные гены, важные для успешного оплодотворения. Большинство из этих линий мышей с разрушенными генами обладало общим фенотипом, обнаруживая: (1) отсутствие миграции в яйцеводы in vivo с аберрантной способностью зоны связывания in vitro; или (2) отсутствие способности к слиянию (Table 1, Class I and II). Интересно, что все сперматозоиды линий мышей класса I лишены ADAM3 (Shamsadin et al., 1999) без исключения, указывая тем самым, что ADAM3 играет ключевую роль в оплодотворении у мышей. Table 1. Factors that are essential for fertilization as indicated by gene-disruption experiments

Box 2. Potential limitations of knockout approaches

There are two main drawbacks to gene-targeting approaches. The first occurs when the knockout mice show a minor or no phenotype. As a matter of fact, not all genes are functionally indispensable. If the function of a gene is minor, the knockout mice may not show a strong phenotype, therefore this gene would not be considered a good candidate for knockout-based experimentation. Furthermore, the issue of redundancy can also complicate interpretation of gene-targeting experiments, as the knockout of one factor could be compensated for by other similar factors. It is also known that some genes require the disruption of other gene(s) as a prerequisite to show a phenotype (Rudnicki et al., 1993); some gene products may interact together and knockout of both/all interacting factors might be needed to observe a phenotype. The factors listed in Table 2, which showed almost no phenotype after knockout, might fall into the above category. A second potential drawback relates to the interpretation of the phenotype. For example, fertilin (an ADAM1b/ADAM2 heterodimer) has been depicted as a sperm-egg fusion protein in many textbooks (Blobel et al., 1992) and this was confirmed by the disruption of Adam2 (Cho et al., 1998), resulting in infertile males. However, when fertilin knockout mice were produced by eliminating Adam1b (the second subunit of the fertilin heterodimer) the males were fertile (Nishimura et al., 2004). Infertility in the Adam2-deficient/fertilin knockout mice was subsequently attributed to the loss of the testicular ADAM1a/ADAM2 protein dimer, which led to the absence of ADAM3 (a protein that does play an essential role in fertilization) from the spermatozoa.

Thus, the interpretation of a knockout phenotype is not always simple. Moreover, the effect of gene disruption might originate from an unexpected route. This includes the unintentional elimination of microRNAs along with the gene of interest (Osokine et al., 2008). In other cases, the gene manipulation may affect other genes located near the intended target and confound the interpretation of phenotypes from alleles designed to be simple null mutations (Olson et al., 1996). Therefore, caution is required when interpreting knockout results.

Table 2. Sperm factors involved in sperm-egg interaction indicated by biochemical means but negated by knockout experiments

Ниже подчеркнуты разные факторы, которые участвуют в процессе оплодотворения.

Factors regulating sperm migration

Все из 11 Class I линии самцов с нарушенными генами, представленные в Table 1, обладают одним и тем же дефектом миграции спермиев в яйцеводе, дефект, который не возможно идентифицировать в исследованиях in vitro . У мышей матка и яйцеводы встречаются в структуре, наз. uterotubal junction (UTJ), которое существенно уменьшает количество сперматозоидов, достигающих яйца. Течение UTJ является двунаправленным. После соития сперматозоиды должны двигаться вверх, чтобы достичь яйца, после слияния гамет, возникающие в результате эмбрионы из оплодотворенных яиц д. двигаться вниз по UTJ, чтобы имплантироваться в матку. Как UTJ регулирует этот двунаправленный ток, неизвестно. Однако ясно, что миграция спермиев не регулируется простым открытием или закрытием входа в UTJ у мышей. Специфичный для семенников молекулярный шаперон, calmegin, является одним из важных генов, необходимых для миграции сперматозоидов в яйцеводе (Ikawa et al., 1997). Используя химерных мышей, которые выбрасывают как дикого типа, так и GFP-нагруженные, с нарушенным calmegin сперматозоиды, было установлено, что только сперматозоиды дикого типа мигрируют в яйцеводе, тогда как столь же подвижные с нарушенным calmegin, сперматозоиды остаются в матке (Nakanishi et al., 2004). Эти наблюдения указывают, что вступление в яйцевод регулируется системой распознавания между индивидуальными сперматозоидами и UTJ, но молекулярный механизм, лежащий в основе этой системы, только предстоит определить.

The zona-binding ability of spermatozoa

Взаимодействие между спермием и зоной пелюцида регулируется по принципу всё или ничего, как показано на Fig. 2. In vitro, многие сперматозоиды могут соединяться (или прикрепляться) к ZP неоплодотворенных яиц, но они не могут присоединяться к яйцам на ст. двух клеток, подтверждая, что соединение спермия с зоной может контролироваться. Потеря способности соединяться с зоной, которая обычно наблюдается в линиях нокаутных мышей Class I, может быть легко оценена при смешивании сперматозоидов с яйцом, лишенным кумулюсных клеток, и первоначально не сомневались, что бесплодие вызывается потерей способности соединяться с зоной. Однако это предположение оказалось некорректным. Fig. 2.

Мыши, дефицитные по специфичному для семенников молекулярному шаперону PDILT, продуцируют сперматозоиды, неспособные соединяться с зоной (Tokuhiro et al., 2012). После скрещивания с линией с трансгенными флюоресцентно нагруженными спермиями (Hasuwa et al., 2010), неспособность спермиев к миграции в яйцевод была продемонстрирована вживую. Однако, когда сперматозоиды помещали непосредственно в ампулу яйцевода, обходя UTJ, то яйца оказывались оплодотворенными (Fig. 2). Сходным образом, сперматозоиды от бесплодной линии мышей Adam1a^-/-, которые также обнаруживали нарушение способности спермия соединяться с зоной in vitro, могли оплодотворять яйца, которые были покрыты кумулюсными клетками (Nishimura et al., 2004). Неизвестно, что влечет за собой настоящее взаимодействие спермия с зоной, но эти исследования показывают, что т.наз. 'zona-binding ability' , измеряемая способностью соединения с яйцами, лишенными кумулюсных клеток, in vitro, по-видимому, несущественна для оплодотворения in vivo (Fig. 2).

Многие исследования постулировали участие углеводов в соединение спермиев с зоной. Необходимо отметить, однако, многие из этих предположений базировались на исследованиях in vitro ? а важная роль таких углеводных остатков пока не подтверждена in vivo. Удаление с помощью ферментов терминального остатка Gal (Bleil and Wassarman, 1988) или GlcNAc (Shur and Hall, 1982) из яиц, напр., устраняет способность ZP3 подавлять связывание спермиев. Однако, мыши с нарушенными генами, лишенными этих остатков в своей зона пелюцида, были фертильны (Asano et al., 1997; Thall et al., 1995), демонстрируя, что эти остатки не важны для оплодотворения. Fucose в Lewis X- и A-содержащих гликанах, как было установлено, также играет роль в связывании спермиев с зоной (Kerr et al., 2004), но мыши, лишенные соотв. fucosyltransferase (Fut9), были плодовиты (Kudo et al., 2004). Роль маннозы, присутствующей в гликанах, также предполагается (Cornwall et al., 1991), но это отрицается воздействием N-glycanase (Florman and Wassarman, 1985). В экспериментах in vitro была также выявлена активность спермиев по связыванию O-сцепленных олигосахаридов с боковыми цепочками, присоединенными к Ser332 и Ser334 в ZP3 (Chen et al., 1998). Однако трансгенные мыши с мутациями в Ser332 и 334 были плодовитыми (Liu et al., 1995). Более того, гликозилирование не наблюдается в этих остатках в нативных ZP белках (Boja et al., 2003). Далее, нарушения ZP3-связывающего белка SP56 (ZP3R - Mouse Genome Informatics) на сперматозоидах (Bookbinder et al., 1995) почти не приводили к фенотипическим отклонениям оплодотворения (Muro et al., 2012). Наконец, энзимы, которые дают стержневые гликаны, также были нарушены, и яйца, лишенные сложных и гибридных гликанов, также как и core-1-derived O-гликанов, оплодотворялись нормально (Shi et al., 2004; Williams et al., 2007). Гипотезы, что углеводы играют важную роль во взаимодействиях спермиев с зоной, пока не подтверждены.

Недавно было установлено, зона пелюцида теряет своё сродство к сперматозоидам, если ovastacin (также известная как astacin-like metalloendopeptidase), энзим, содержащийся в кортикальных гранулах яйца (Burkart et al., 2012), расщепляет ZP2 после оплодотворения (Bleil et al., 1981; Gahlay et al., 2010). Было также предположено, что происходящий из печени циркулирующий в крови гликопротеин fetuin-B очень необходим для подавления преждевременного расщепления ZP2 за счет подавления ovastacin (Dietzel et al., 2013).

Итак, эти исследования показали, что могут возникать различные взаимодействия между спермием и зоной, но они не абсолютно необходимы для успешного оплодотворения. Необходимо также вспомнить, что 'sperm-zona binding', описанное выше, может не отражать реального взаимодействия между спермием и яйцом, необходимого для оплодотворения in vivo (Fig. 2).

Анатомические или поведенческие отличия между видами гарантируют, что самцы и самки двух разных видов не могут обычно скрещиваться. Тем не менее, проникновение в taxon-специфическую зону было продемонстрировано (Rankin et al., 2003). Однако, если сперматозоиды не нуждаются в способности соединяться с зоной, то как они различают ZP того же самого вида? Можно предположить, что имеется пока не установленное сродство между яйцами, покрытыми кумулюсными клетками, и сперматозоидами. Можно предположить, что одни и те же молекулы, отвечающие за связывание зоны, используются для распознавания спермием UTJ, это могло бы объяснить, почему дефекты в связывании зоны и в прохождении через UTJ возникают совместно (Table 1).

Белок спермиев zonadhesin (ZAN) , как полагают, вносит вклад в видоспецифическое связывание зоны пелюцида (Tardif et al., 2010), но это не было подтверждено путем восстановления Zan^-/- с помощью Zan др. видов. Более того, когда мышиные ZP белки помещали вместе с человеческими гомологами с помощью семикратного их повышения (за счет манипуляции по разрушению трех генов mZP1 - mZP3 и инсерции четырех hZP1 - hZP4 трансгенов), то было установлено, что человеческие сперматозоиды м. соединяться и проникать через очеловеченную ZP (Baibakov et al., 2012). Эти данные могут указывать на проникновение через таксон-специфическую зону. Однако, Gahlay et al. также упоминают, что мышиные сперматозоиды м. также проникать в гуманизированную ZP, это в известном смысле указывает, что возможно проникновение мышиными сперматозоидами таксон неспецифической зоны. Необходимо отметить, что сперматозоиды полёвок, как было установлено, проникают через зону пелюцида мышей и хомячков, не нуждаясь в акросомной реакции (Wakayama et al., 1996).

Regulation and importance of the zona-induced acrosome reaction

Различные энзимы были рассмотрены, как содействующие проникновению сперматозоидов слоёв кумулюсных клеток и ZP, после высвобождения с помощью акросомного экзоцитоза (Florman and Ducibella, 2006). Выбор времени акросомной реакции, как полагают, важен для спермиев, когда они приближаются к яйцу. Поэтому многие исследователи полагают, что акросомная реакция оплодотворяющего спермия вызывается контактом с ZP и что сперматозоиды, которые подвергаются акросомной реакции до контакта с ZP, оказываются неспособными к оплодотворению (Bleil and Wassarman, 1983). Недавно было показано, что добавление растворенной ZP может вызвать акросомную реакцию (Florman and Ducibella, 2006), и часичные последовательности ZP3 могут сопровождаться тем же самым эффектом (Hinsch et al., 2005). В этом контексте белки, связывающие зону, как полагают, индуцируют сигнальный каскад в сперматозоидах (Gong et al., 1995). Фактически различные белки, связывающие зону пеллюцида, были отысканы и очищены из сперматозоидов. Однако разрушение генов для этих факторов не приводило к заметным фенотипическим отклонениям в оплодотворении [e.g. GalTase (Lu and Shur, 1997), Sp56 (Muro et al., 2012), zonadhesin (Tardif et al., 2010), Crisp1 (Da Ros et al., 2008), acrosin (Baba et al., 1994)]. Т.о., хотя эти факторы могут играть роль в индукции акросомной реакции, важность этих факторов и зоной индуцируемой акросомной реакции во время оплодотворения, неясна.

A zona-independent acrosome reaction

Ранние исследования с трансгенными сперматозоидами, с GFP в их акросомах, оказались безуспешными для наблюдения акросомной реакции в ответ на ZP, а добавление calcium ionophore A23187 к зоне связывания сперматозоидов оказалось необходимым для индукции акросомной реакции (Nakanishi et al., 1999). Др. группа предположила, что проникающее действие через сетчатую структуру скорее, чем соединение с поверхностью д. приводить к экзоцитозу акросом, поскольку это совсем не обнаруживается при акросомной реакции сперматозоидов, связанных с ZP (Baibakov et al., 2007). Недавние исследования in vitro также подтвердили, что сперматозоиды не нуждаются в контакте с ZP, чтобы вызывать акросомную реакцию. Скорее всего, большинство оплодотворяющих сперматозоидов фактически проходят акросомную реакцию до достижения ZP in vitro (Jin et al., 2011). Это вместе с сообщением, что сперматозоиды, лишенные способности соединяться с зоной, могут оплодотворять яйца при определенных экспериментальных условиях (Nishimura et al., 2004; Tokuhiro et al., 2012), ставит под вопрос важность вызываемой зоной акросомной реакции и её физиологическое значение.

Интересно, что сперматозоиды хомячка завершают акросомную реакцию примерно во время прохождения через кумулюсные клетки или незадолго до или после контакта с поверхностью ZP in vivo (Cummins and Yanagimachi, 1982). Сходным образом, сперматозоиды морских свинок, участвующие в оплодотворении, по-видимому, подвергаются акросомной реакции, достигнув проксимальной части яйцевода, или когда они оказываются очень близко к яйцу (Yanagimachi and Mahi, 1976). Кроме того, сперматозоиды кроликов, возвращенные из перивителлинового пространства оплодотворенных яиц, могут всё ещё проникать и оплодотворять свежие ооциты (Kuzan et al., 1984). Эти результаты подтверждают, что способность сперматозоидов к оплодотворению сохраняется и после акросомной реакции. Согласуется с этим мнением и то, что были описаны компартментализованные структуры внутри акросом (Kim et al., 2001) и асинхронное высвобождение акросомных белков во время экзоцитоза акросом (Hardy et al., 1991; Kim and Gerton, 2003; Nakanishi et al., 2001).

Недавно было показано, что сперматозоиды мыши после акросомной реакции проникают в свежие, заключенные в кумулюсные клетки интактные зоны яиц, а возникающие в результате оплодотворенные яйца развиваются в срок после трансплантации в матку (Inoue et al., 2011). Эти результаты подтверждают, что время наступления акросомной реакции может быть гибким. Было также предположено, что критическое взаимодействие спермия с зоной происходит между ZP и прошедшими акросомную реакцию скорее, чем с acrosome-intact, сперматозоидами.

Sperm-egg fusion

После слияния сперматозоиды активируют яйцо, индуцируя тем самым осцилляции кальция и завершение второго мейотического клеточного деления (Miyazaki and Ito, 2006) PLCζ из сперматозоидов рассматривается как ответственный активатор во время этого процесса (Nomikos et al., 2012), но др. факторы такж могут участвовать (Harada et al., 2011). Активация яйца ведет к экзоцитозу из расположенных по периферии кортикальных гранул. Ovastacin является ферментом, который накапливается в кортикальных гранулах, и в результате этого происходит расщепление белка ZP2, это рассматривается как уменьшение сродства к сперматозоидам (Burkart et al., 2012). Этот феномен, предупреждающий полиспермию, наз. реакцией зоны пелюцида.

Чтобы идентифицировать факторы, участвующие в слиянии спермия с яйцом, были охарактеризованы антигены с помощью моноклональных антител, которые препятствуют слиянию in vitro (Blobel et al., 1992; Okabe et al., 1987; Okabe et al., 1992) и это привело к идентификации молекул, таких как CD46 (Taylor et al., 1994), IZUMO1 (Inoue et al., 2005) и fertilin (ADAM1b/ADAM2 гетеродимер) (Blobel et al., 1992). Чтобы оценить роль этих молекул in vivo исследователи обратились к экспериментам по нарушению генов у мышей. Первоначально внимание привлек fertilin, но оказалось он не нужен для оплодотворения in vivo (Box 2). Линия мышей с нарушенным Cd46, также была полученаt, хотя семенники оказались единственным местом, где экспрессируется CD46 у мышей, но не обнаружено эффекта на способность к оплодотворению сперматозоидов от мышей этой линии (Inoue et al., 2003). Возможно, что эти белки могут выполнять перекрывающиеся роли и, будучи в нокауте их функция может быть скомпенсирована др. белками. Альтернативно, возможно, что эти факторы взаимодействуют с или полагаются на др. факторы, необходим нокаут дополнительных взаимодействующих факторов, чтобы выявить эффект in vivo (see Box 2 ).

Не смотря на их потенциальные ограничения нарушения функции генов иногда приводят к случайным находкам. Напр., ген, кодирующий tetraspanin CD9, первоначально был нарушен, чтобы прояснить его роль в иммунологии, но он стал первым известным важным фактором слияния спермия и яйцеклетки (Kaji et al., 2000; Le Naour et al., 2000; Miyado et al., 2000). Недавно мы нарушили ещё один ген, Izumo1, который, как было установлено, важен для оплодотворения; Izumo1^-/- мыши продуцируют нормально выглядящие сперматозоиды, но полностью бесплодные. Нарушенные по Izumo1 сперматозоиды были способны нормально проникать через слои кумулюсных клеток и ZP, но были неспособны сливаться с яйцеклетками (Inoue et al., 2005), это подчеркивает важность IZUMO1 для события слияния спермия с яйцом.

Базируясь на таких исследованиях по нарушению генов, CD9 на яйцеклетках и IZUMO1 на сперматозоидах являются лишь двумя важными для слияния факторами из описанных. Однако, взаимодействие между двумя факторами не было обнаружено и структурно ни один из факторов не обладает fusogenic доменом, это указывает на то, что они могут действовать посредством дополнительных взаимодействующих белков. Однако, нарушения недавно идентифицированного и ассоциирующего с IZUMO1 белка (angiotensin converting enzyme 3; ACE3) дают плодовитых самцов (Inoue et al., 2010), демонстрируя, что д. быть др. дополнительный фактор, который участвует в слиянии.

Чтобы оценить роль IZUMO1 во время оплодотворения исследовали локализацию IZUMO1 во время слияния, используя нагруженный mCherry IZUMO1. IZUMO1 первоначально скрыт под плазматической мембраной до акросомной реакции, но затем перемещается с плазматической мембраны на наружную акросомную мембрану во врем акросомной реакции у живых сперматозоидов (Satouh et al., 2012). Это указывает на то, что дополнительной функцией акросомной реакции является наделение сперматозоидов способностью сливаться с яйцом путем переноса IZUMO1, и возможно др. белков, на поверхность спермия (Fig. 3A). Отметим, что наблюдались три паттерна локализации IZUMO1 после акросомной реакции: (1) экваториальный (EQ) паттерн флюоресценции; (2) паттерн флюоресценции в головке (H) ; или (3) слабый паттерн флюоресценции acrosomal cap (AC) (ACdim) (Fig. 3C-E). Формирование паттерна ACdim примечательно, поскольку этот паттерн рассматривается, как вызываемый фагоцитозом внутренней акросомной мембраны после первого (маргинального ) события слияния, сопровождаемого участием мембраны спермия, вызывая тем самым отсоединение от плоскости слияния (dividing fusion) (Fig. 3D,E). Формирование паттерна ACdim это продукт второй ступени слияния (Fig. 3F). Каждое событие слияния имеет характерную природу, каждый может нуждаться в индивидуальных факторах слияния. Во всяком случае, необходимо идентифицировать больше факторов, участвующих в слиянии спермия с яйцом. Fig. 3.

Perspectives

Возникает новая точка зрения (Fig. 4) на механизм оплодотворения. Это мнение связано с уменьшением важности т. наз. 'связывающей зону способности' спермия, с независимой от зоны акросомной реакции и способностью проникать через зону сперматозоидов, изъятых из превителлинового пространства. Это обновленное мнение в основном базируется на наблюдениях in vivo у животных с нарушенной функцией генов, в то время как классические модели в основном концентрируются на наблюдениях оплодотворения in vitro (IVF). В условиях IVF яйцеклетки должны подвергаться действию 105 спермиев на мл (смесь с спермиев интактной акросомой, с акросомой реактивированной и деградирующих сперматозоидов). Однако, лишь немногие (преимущественно после акросомной реакции) сперматозоиды приближаются к яйцу для оплодотворения in vivo. Более того, недавние исследования показали, что многие факторы, описанные как важные для оплодотворения in vitro, могут быть генетически нарушены с незначительным или с отсутствием эффекта на оплодотворение (см Box 2). Эти исследования подчеркивают, что важно оценить молекулы кандидаты у животных с измененными генами, чтобы сфокусироваться на важных для плодовитости. Оплодотворение может быть одной из наиболее подходящих областей исследований, использующих животных с измененными генами, чтобы осуществить исследования in vivo, поскольку мистическое поведение гамет, по-видимому, трудно для воспроизведения Fig. 4. Mechanism of fertilization: old and new models. In the classical scheme (left), the spermatozoa have hyaluronidase (PH-20; also known as SPAM1) (pink triangles) on their surface and penetrate the cumulus layer and attach to the zona pellucida (ZP). Many zona-binding proteins on spermatozoa have been postulated (Table 2). ZP3 was reported to be the molecule to which spermatozoa bind (or attach) and had acrosome reaction-inducing ability. The timing of the acrosome reaction was also proposed to be important for zona penetration because it was believed that the acrosomal enzymes (such as acrosin) must be released upon binding to zona. Sperm fertilin was also thought to function during egg fusion, with eggs using integrin ?6?1 for its counterpart. However, none of these gene-disrupted mice became infertile (He et al., 2003). In the modern scheme (right), the spermatozoa penetrate the cumulus layer with or without the acrosome reaction. Acrosome-reacted spermatozoa can even penetrate the cumulus and zona for a second time (Inoue et al., 2011). Although the so-called 'zona-binding' ability is not required for spermatozoa to fertilize eggs, it is known that the 'zona-binding' ability is attributable to ADAM3 (pink dots) on the surface of sperm. If ADAM3 became aberrant, spermatozoa could not migrate into the oviduct and hence failed to approach eggs. If ADAM3 became aberrant, spermatozoa could not migrate into the oviduct and hence failed to approach eggs. However, ADAM3 is a pseudogene in human (Grzmil et al., 2001). Therefore, if a general mechanism does exist among mammalian species, we might still not have found the key factor for fertilization. IZUMO1 on spermatozoa and CD9 on eggs were shown to be essential for fusion but the precise mechanism of fusion is yet to be clarified.

The cell biology of mammalian fertilization Masaru Okabe Development. 2013 Nov;140(22):4471-9

The cell biology of mammalian fertilization
Masaru Okabe
Development. 2013 Nov;140(22):4471-9