Посещений:
ЭПИДЕРМИС ЭМБРИОНОВ ЧЕЛОВЕКА

Предшественники клеток Лангерганса

Human embryonic epidermis contains a diverse Langerhans cell precursor pool
Christopher Schuster, Michael Mildner, Mario Mairhofer, Wolfgang Bauer, Christian Fiala, Marion Prior, Wolfgang Eppel, Andrea Kolbus, Erwin Tschachler, Georg Stingl and Adelheid Elbe-Burger
Development. 2014 Feb;141(4):807-15. doi: 10.1242/dev.102699.

Despite intense efforts, the exact phenotype of the epidermal Langerhans cell (LC) precursors during human ontogeny has not been determined yet. These elusive precursors are believed to migrate into the embryonic skin and to express primitive surface markers, including CD36, but not typical LC markers such as CD1a, CD1c and CD207. The aim of this study was to further characterize the phenotype of LC precursors in human embryonic epidermis and to compare it with that of LCs in healthy adult skin. We found that epidermal leukocytes in first trimester human skin are negative for CD34 and heterogeneous with regard to the expression of CD1c, CD14 and CD36, thus contrasting the phenotypic uniformity of epidermal LCs in adult skin. These data indicate that LC precursors colonize the developing epidermis in an undifferentiated state, where they acquire the definitive LC marker profile with time. Using a human three-dimensional full-thickness skin model to mimic in vivo LC development, we found that FACS-sorted, CD207- cord blood-derived haematopoietic precursor cells resembling foetal LC precursors but not CD14+CD16- blood monocytes integrate into skin equivalents, and without additional exogenous cytokines give rise to cells that morphologically and phenotypically resemble LCs. Overall, it appears that CD14- haematopoietic precursors possess a much higher differentiation potential than CD14+ precursor cells.


Рисунки к статье


Langerhans cells (LCs) являются antigen-presenting cells (APCs), которые выполняют важные роли в качестве иммунных стражей в коже (Romani et al., 2012a). Во время развития кожи человека её предшественники впервые обнаруживаются в эпидермисе на ст . 7-9 недель estimated gestational age (EGA), исходя из экспрессии CD45 (PTPRC - HGNC), HLA-DR, CD1c и ATPase (Foster et al., 1986; Fujita et al., 1991; Schuster et al., 2009). Отличительной особенностью LCs в эпидермисе взрослых людей являются Birbeck гранулы, CD207/langerin и CD1a, обнаруживаемые только спустя 11 недель EGA (Foster et al., 1986; Schuster et al., 2009). Наше наблюдение, что не все HLA-DR-позитивные (HLA-DR+) эпидермальные клетки в коже эмбрионов человека экспрессируют LC маркеры CD1a, CD1c или CD207/langerin, позволило нам предположить, что во время онтогенеза LC фенотип необходим в эпидермисе (Schuster et al., 2009), мнение, которое недавно было проанализировано на мышах (Sere' et al., 2012). Благодаря этому постепенному развитию LC фенотипа, вполне возможно, что др. молекулярные структуры, необходимые для инициации иммунного ответа, включая MHC-II молекулы (напр. HLA-DR), могут быть также необходимы эпидермису. Т.о., можно установить ранние стадии развития оригинального фенотипа предшественников LC. В самом деле, ранние исследования идентифицировали дендритные и округлые эпидермальные клетки в первом триместре, которые экспрессировали фагоцитарный рецептор CD36 (Fujita et al., 1991). Одновременно HLA-DR+ эпидермальные клетки становятся более частыми клетками, а клетки CD36+ в эпидермисе человека снижаются в количестве и в здоровой взрослой коже не обнаруживаются в конце первого триместра. Их происхождение, точный фенотип и окончательная судьбы пока не установлены. На ст. 7 недель EGA, самый ранний временной промежуток, когда обнаруживаются эпидермальные предшественники LC (Foster et al., 1986), наблюдается активный гематопоэз в желточном мешке человека, регион аорта-гонады-мезонефросы и печень плода, представляют собой потенциальные места возникновения этих предшественников, но они неактивны в костном мозге (Tavian and Pe'ault 2005). Хотя была описана локальная пролиферация в эпидермальных лейкоцитах во время первого триместра (Schuster et al., 2009), тип(ы) предшественников, которые колонизируют эпидермис и их взаимоотношения с гематопоэтическими стволовыми клетками остаются неизвестными. Целью данного исследования является дальнейшая характеристика фенотипа предшественников LC в первом триместре эпидермиса человека, в частности анализ совместной экспрессии HLA-DR с различными молекулами, часто присутствующих в предшественниках LC, такими как CD14, CD36 и CD45, чтобы расширить наше понимание их онтогенеза in vivo. Более того, чтобы расширить и подтвердить наши наблюдения in vivo, мы использовали трехмерные в полную толщину модели кожи человека, которые оценивали в отношении потенциала дифференцировки LC из различных клеток, происходящих из пуповинной крови и периферической крови, фенотипически напоминающих клетки предшественники, обнаруживаемые во время онтогенеза.

DISCUSSION


В данном исследовании мы сфокусировались на развитии эпидермальных лейкоцитов в первом триместре, показав, что эпидермис человека содержит множество фенотипически отличающихся предшественников LC в противовес единообразию LCs в коже взрослых. Используя трехмерную полной толщины модель кожи человека, мы установили, что происходящие из пупочной крови клетки предшественники CD14+ обладают потенциалом давать CD207+ LCs (Schaerli et al., 2005), хотя в значительно меньшей степени, чем предшественников CD1a+CD14- и CD1a-CD14- в сходных условиях.

LC precursors in human first trimester skin are heterogeneous


HLA-DR+ лейкоциты в эмбриональном эпидермисе могут быть подразделены в соответствии с экспрессией фагоцитарного рецептора CD36, как было описано ранее (Fujita et al., 1991). Интересно, мы установили, что 23.8% эпидермальных лейкоцитов между 9 и 11 неделями EGA не экспрессируют ни CD36, ни HLA-DR и что экспрессия HLA-DR на CD45+ клетках приблизительно равняется экспрессии CD36, подтверждая и тем самым расширяя предыдущие результаты (Fujita et al., 1991). Эти эпидермальные лейкоциты являются CD45+CD36+HLA-DR+, CD45+CD36+HLA-DR-, CD45+CD36-HLA-DR+ или CD45+CD36-HLA-DR-. В конце первого триместра, HLA-DR становится доминирующим, тогда как экспрессия CD36 снижается и не может быть обнаружена на более поздних стадиях развития. CD14 на эпидермальных лейкоцитах обнаруживается менее часто, чем CD36, всё же он почти всегда экспрессируется совместно с CD36. Подобно CD36, CD14 также не обнаруживается на эпидермальных клетках после 18 недель EGA. Необходимо подчеркнуть, что более низкая частота CD14+ по сравнению с CD36+ эпидермальными клетками может быть объяснена запутанной детекцией CD14 с помощью иммунофлюоресценции. У мыши было показано, что во время воспаления кожи Gr1+ моноциты могут давать эпидермальные LCs (Ginhoux et al., 2006). CD36 и CD14 также обнаруживаются на субнаборе моноцитов крови человека (Zamora et al., 2012), следовательно, нельзя исключить, что эти клетки представляют собой моноцитные предшественники LC. Конечно, субнабор CD45+CD36+ LC предшественников в первом триместре в эпидермисе экспрессирует CD1c, показывая, что детерминированные дендритные клетки могут также экспрессировать одновременно CD36 (Schuster et al., 2009).
Отсутствие CD34 на эпидермальных лейкоцитах указывает на то, что инициальный предшественник не обладал потенциалом гематопоэтических стволовых клеток. Учитывая, что экспрессия CD34 наивысшая на недетерминированных стволовых клетках и всё более теряется по мере дифференцировки предшественников, нельзя исключить, что эти эпидермальные лейкоциты в коже первого триместра обнаруживают низкий уровень экспрессии CD34, который не определяется с помощью иммунофлюоресценции Ordo'nez 2012). Благодаря отсутствию соотв. иммуногистохимических маркеров для разных стадий дифференцировки потомства гематопоэтических стволовых клеток, в настоящее время невозможно исследовать эти ранние предшественники, обладающие, по крайней мере, некоторым регенеративным потенциалом. Однако ранее было показано, что лейкоциты кожи развивающихся мышей и человека обладают более высокой пролиферативной способностью, чем таковый во взрослой коже (Chang-Rodriguez et al., 2005; Schuster et al., 2009; Chorro et al., 2009).
Фенотипическая гетерогенность предшественников LC во время развития кожи является результатом присутствия и отсутствия молекул, характерных для LCs в здоровой коже взрослых. Принципиальная причина такого разнообразия остается необъяснимой и возможны различные сценарии: (1) избыток и/или отсутствие антигенов, (2) асинхронное созревание предшественников или (3) колонизация с помощью различных клеток предшественников. У человека формирование крови начинается в желточном мешке и позднее сдвигается в регион aorta-gonad-mesonephros region, печень плода и наконец около 11 недель EGA, в костном мозге (Pe'ault and Tavian, 2003). Возможно, что предшественники LC отличаются в зависимости от своего происхождения (Hoeffel et al., 2012). Доказательства этому получены в экспериментах по картированию судеб у мышей, показавших, что примитивный эпидермис колонизируется при первой волне предшественниками, происходящими из желточного мешка и макрофагов (Hoeffel et al., 2012). Впоследствии эти ранние предшественники в основном замещаются предшественниками, происходящими из печени плода. Базируясь на этих данных, мы предположили, что гетерогенность эпидермальных лейкоцитов человека может также отражать разные предшественники. Кстати, эта концепция не была оценена у человека, потому что иммунные клетки из желточного мешка человека остаются плохо охарактеризованными (Janossy et al., 1986). Однако, принимая во внимание, что гематопоэз в этих органах эмбрионов и плода человека перекрывается (Pe'ault and Tavian, 2003), то выяснение точного источника без одновременного рассмотрения мест гематопоэза может быть тщетным. Дальнейший анализ тормозится поскольку сегодня не возможно анализировать эмбриональную кожу до 9 недель EGA, принимая во внимание чрезвычайно низкие количества эпидермальных лейкоцитов в этот временной период.

CD207- precursors integrate in artificial skin


Чтобы прямо тестировать, дают ли CD14+CD36+ эпидермальные лейкоциты LCs, мы использовали трехмерную полной толщины модель кожи (Mildner et al., 2010) и изучали интеграцию различных клеток предшественников во вновь формирующийся эпидермис. Кстати, лишь немногие группы оказались способны достичь интеграции предшественников LC или LCs в кожные эквиваленты (Bechetoille et al., 2007; Hubert et al., 2005; Laubach et al., 2011; Ouwehand et al., 2011;R?gnier et al., 1997; Schaerli et al., 2005). Мы оказались первыми успешно и оценившими способность к дифференцировке разных субнаборов предшественников, используя искусственную кожу. Наши находки, что предшественники из крови пупочного канатика, но не CD14+CD16- моноциты из периферической крови были способны созревать в CD1a+CD207+ LCs, это может указывать, что CD36+ или CD14+ лейкоциты в первом триместре эпидермиса человека не являются моноцитами, но фенотипически сходны и предшественниками или прародителями (Ziegler-Heitbrock et al., 2010). Конечно, хотя существуют функциональные различия между плодными или у новорожденных или взрослых моноцитами (Adkins et al., 2004; Fadel and Sarzotti, 2000; Levy, 2005), всё ещё неизвестно, обладают ли моноциты высокой способностью к дифференцировке во время первого триместра по сравнению с взрослой жизнью. Неожиданно, CD1a+ предшественники, которых обычно относят к дендритным клеткам, не обнаружили более высокого потенциала, чем CD1a-CD14- гематопоэтические предшественники. Предполагается, что как и в случае различных исследований in vitro - CD14+ предшественники из пупочной крови представляют собой промежуточную стадию между CD34+ гематопоэтическими стволовыми клетками и CD1a+ предшественниками (Caux et al., 1992;Jaksits et al., 1999). Конечно, CD36 в разной степени обнаруживается во всех этих субнаборах, происходящих из пупочной крови, а также на CD14+ моноцитах. Следовательно, в противоположность CD14, CD36 не может быть использован для дальнейшего определения фенотипа потенциальных предшественников LC.

Similarities between LC development in mice and humans


Развитие LCs у мыши и человека отличается по разным аспектам, напр., постнатальному приобретению MHC class II и затем langerin у мыши (Chorro et al., 2009; Elbe et al., 1989; Romani et al., 1986; Tripp et al., 2004). У человека, напротив, 54.2% эпидермальных лейкоцитов экспрессируют HLA-DR на ст. 11 недель EGA. Этот процент увеличивается in utero до 88.0% после 12 недель EGA. Хотя хронологические ступени развития предшественников LC у мыши и человека различаются (Chorro and Geissmann, 2010; Elbe-B?rger and Schuster, 2010; Ginhoux and Merad, 2010), недавние эксперименты показали удивительное сходство. После инъекции дикого типа костного мозга мышам IdD2-/-, полностью лишенных LCs, генерировалась сеть LC спустя 3 недели (Romani et al., 2012b; Sere' et al., 2012). Интересно, что CD45+ и менее многочисленные HLA-DR+ предшественники LC присутствовали спуся 1 неделю после трансплантации костного мозга, тогда как в более многочисленных CD11c и CD207 экспрессия не обнаруживалась вплоть до 2-3 недель. Т.о., последовательное приобретение поверхностных маркеров не только напоминает мышей, но и также онтогенез человека и и приводит к мнению, что CD45+ предшественники колонизируют эпидермис, где они последовательно приобретают свой фенотип. Принимая это во внимание: (1) T клетки не присутствуют в пренатальной коже до 18 недель EGA (Di Nuzzo et al., 2009; Schuster et al., 2012); (2) не существует др. иммунных клеток с тропизмом к эпидермису; и (3) апоптоз не обнаружим в первом триместре среди эпидермальных лейкоцитов, мы предполагаем, что CD45+CD36-HLA-DR- клетки эмбриональной кожи являются предшественниками LC . CD45+HLA-DR- клетки также были идентифицированы в эпидермисе здоровой кожи человека, но эти клетки в большинстве своей, по-видимому, являются лимфоцитами, как сообщалось ранее (Foster and Elbe, 1997).
Мы идентифицировали фенотипически гетерогенные предшественники LC в эпидермисе эмбрионов человека, тогда как лейкоциты, напоминающие фенотипически LC взрослых могут только обнаруживаться в конце второго триместра. Итак, наша находка, что определенные субнаборы из пупочной крови фенотипически сходны с таковыми из эмбрионального эпидермиса, могут указывать на то, что LCs в трехмерной модели кожи, согласно нашим данным, являются важной ступенью нашего понимания биологии LC в коже человека.