Морфогенез печени мыши инициируется приблизительно на день эмбриогенеза (E) 8.5, с перехода области печеночной энтодермы в цилиндрический эпителий, с началом экспрессии Hnf4a, альбумина и альфа-фетопротеина (Afp), и с последующего утолщения и вздутия печеночного эпителия. На ст. E10.0, базальная мембрана, окружающая печеночный дивертикул, начинает исчезать; уровень экспрессии E-кадгерина (Cadherin 1 - Mouse Genome Informatics) подавляется и печеночные предшественники (или гепатобласты) начинают отслаиваться и заполнять окружающую стромальную ткань (Si-Tayeb et al., 2010).

или

Гепатобласты являются бипотентными предшественниками, которые развиваются или в гепатоциты (основные эпителиальные клетки печени) или холангиоциты (эпителиальные клетки, выстилающие внутрипеченочные желчные протоки). Образование гепатоцитов и холангиоцитов разделено во времени и пространстве, это предполагает, что локальные индукторы или репрессирующие механизмы оперируют непосредственно управляя любой из судеб (Zaret, 2002). Сеть транскрипционных факторов, обогащенных в печени, представлена 6 стержневыми регуляторами [Hnf1α Hnf1β , FoxA2, Hnf4α, Hnf6 (Onecut1 - Mouse Genome Informatics) и Nr5a2 (также известным как Lrh-1)] управляет дифференцировкой паренхимных гепатобластов в гепатоциты (Kyrmizi et al., 2006). Эта транскрипционная сеть очень динамична; она использует усиление перекрестно-регуляторных взаимодействий, необходимых для обеспечения созревания гепатоцитов (Kyrmizi et al., 2006).

Образование желчных протоков начинается приблизительно на ст. E14.5 во временной periportal структуре, наз. пластинке протоков (ductal plate). Этот процесс использует несколько сигнальных путей, среди которых передача сигналов TGFβ /activin влияет на дифференцировку холангиоцитов и гепатоцитов (Clotman et al., 2005;Lemaigre, 2009). В пластинке протоков гепатобласты активируют экспрессию транскрипционного фактора Sox9 и инактивируют фактор Hnf4α. Затем возникает асимметричная структура примитивных протоков (PDSs) из ductal пластинки; эти PDSs представляют собой слой перипортальных Sox9⁺клеток, покрытых базальной мембраной, богатой laminin и nidogen белками (Shiojiri and Sugiyama, 2004) , а слой паренхимных Hnf4α⁺/Sox9^- клеток лишен базальной мембраны. PDSs постепенно ремоделируются, чтобы сформировать внутрипеченочные желчные протоки за счёт приобретения радиальной симметрии, приобретая апикально-базальную полярность и формируя просвет. Активность транскрипционных факторов Sox9, Hnf6 и Hnf1β необходима для собственно развития желчных протоков, а передача сигналов Notch важна для ремоделирования желчных протоков и дифференцировки холангиоцитов (Lemaigre, 2009).

Гомеобоксный ген Prox1 является критическим регулятором клеточной дифференцировки и морфогенеза в разных тканях (Sosa-Pineda et al., 2000; Lavado et al., 2010; Wigle and Oliver, 1999;Westmoreland et al., 2012), и является одним из самых ранних маркеров развития печени у позвоночных (Burke and Oliver, 2002). Ранее мы продемонстрировали, что потеря активности Prox1 нарушает отделение гепатобластов от печеночного дивертикула. Это препятствует их миграции и вызывает арест раннего раз-вития печени (Sosa-Pineda et al., 2000). Prox1 также экспрессируется в гепатоцитах взрослой печени, при этом недавнее доказательство подтвердило теорию, что в этих клетках Prox1 негативно регулирует активность ERRα (Esrra - Mouse Genome Informatics) (Charest-Marcotte et al., 2010), Hnf4α (Song et al., 2006) b Nr5a2 (Qin et al., 2004), трех ядерных рецепторов, контролирующих разные печеночные метаболические функции. Недавно мы продемонстрировали, что функция Prox1 контролирует развитие клеток протока в сходном, происходящим из энтодерм органом, поджелудочной железы (Westmoreland et al., 2012).

В данном исследовании мы тестировали гипотезу, что активность Prox1 необходима для дифференцировки клеток, морфогенеза или обоих для печени плода. С помощью условного делетирования гена из гепатобластов, развивающихся после стадии, когда они высвобождены из печеночного дивертикула, мы установили, новую, самостоятельную роль Prox1 в распределении типов эпителиальных клеток во время генеза печени.

DISCUSSION

Early hepatic morphogenesis and cell specification are tightly coupled processes requiring Prox1 activity

Prox1 является важным компонентом регуляторной сети, контролирующей ранний печеночный морфогенез, вместе с Hhex, Tbx3, Hnf6, OC-2 (Onecut2 - Mouse Genome Informatics) и Gata6 (Lemaigre, 2009). L?dke et al. (L?dtke et al., 2009) постулировали, что в этой сети Tbx3 действует выше Prox1, поскольку подобно нашему сообщению о Prox1-нулевых мышах (Sosa-Pineda et al., 2000), предшественники печени из Tbx3-нулевых эмбрионов обнаруживают снижение пролиферации и эти клетки не отсоединяются от энтодермы кишечника (L?dtke et al., 2009;Suzuki et al., 2008). Также потеря функции Tbx3 не влияет на начало экспрессии Prox1 в печеночной энтодерме, но оказывается неспособной поддерживать его экспрессию в зачатке печени после ст. E9.5 (L?dtke et al., 2009). Наша находка, что делеция Prox1 в гепатобластах не влияет на экспрессию Tbx3 также подтверждает мнение, что этот ген расположен выше Prox1 в регуляторной сети, контролирующей ранний морфогенез печени.

Кроме того, блокада вычленения гепатобластов, увеличивает экспрессию генов, контролирующих развитие желчных протоков (т.e. Hnf6 и Hnf1b) и снижает экспрессию генов, необходимых для развития гепатоцитов (т.e. Hnf4a and Cebpa) , что было обнаружено в Tbx3-нулевой печени (L?dtke et al., 2009). Следовательно, неспособность Tbx3-нулевых гепатобластов к вычленению из энтодермы кишки подтверждается как следствие их неспособности инициировали дифференцировку гепатоцитов. Сходным образом, здесь мы показали, что Prox1-нулевые гепатобласты неспособны отсоединяться, а вместо этого развиваются в структуры протоков, в которых холангиоциты (Sox9⁺) были более многочисленными, чем гепатоциты (Hnf4 α⁺). Более того, когда Prox1 был делегирован в гепатобластах после их отделения, то клетки быстро откладывали белки базальной мембраны и формировали атипичные агрегаты в паренхиме и эти отклонения сопровождались повышенной экспрессией Hnf6 и Hnf1β и пониженной экспрессией Hnf4α и C/EBPα. Следовательно, наше исследование показало, что Prox1 является новым ключевым регулятором процессов, связанных со спецификацией печёночных клеток и печеночным морфогенезом.

Is cholangiocyte specification the default fate of hepatoblasts?

Истощенные по Prox1 гепатобласты образуют агрегаты скорее, чем плохо упакованные эпителиальные тяжи, которые быстро окружаются наглядной базальной мембраной. Пока мы не знаем, является ли это необычное отложение базальной мембраны вокруг этих мутантных гепатобластов прямым эффектом или вторичным по отношению к потере активности Prox1. Однако сигналы от нижестоящего TGFβ могут вносить вклад в эти фенотипические отклонения, поскольку увеличивается экспрессия Lamb1 в эксплантах печени плода, обработанных c помощью TGFβ .

Мы наблюдали, что некоторые эпителиальные агрегаты в паренхиме Prox1^ΔLIV печени содержат смесь холангиоцитов (т.e. Sox9⁺/Hnf4a^- клеток), гепатоцитов (т.e. Hnf4a⁺/Sox9^-клеток) и гибридных клеток (т.e. Hnf4a⁺/Sox9⁺ клеток). Паренхимные агрегаты, экспрессирующие маркеры холангиоцитов и гепатоцитов были также описаны в печени эмбрионов мышей, лишенных Cebpa, Hnf6, Oc-2 или Hhex (Hunter et al., 2007; Clotman et al., 2005;Yamasaki et al., 2006). Однако почти все клетки в эпителиальных агрегатах Prox1^ΔLIV печени экспрессируют Hnf6, и сходным образом, паренхимные агрегаты с двойным нокаутом Hnf6/Oc-2 печени экспрессируют Prox1 широко (supplementary material Fig. S7). Эти парадоксальные результаты подчеркивают сложность взаимодействий между разными транскрипционными факторами, контролирующими судьбу печеночных клеток. Напротив, экспрессия C/EBPα быстро исчезает в Prox1^ΔLIV печени после ст. E12.5, становясь почти незаметной в многочисленных паренхимных агрегатах на ст. E15.5 (supplementary material Fig. S3C). Эти результаты указывают, что активность Prox1 может быть необходима для поддержания экспрессии C/EBPα в предшественниках гепатоцитов.

Одним из существенных отличий между Prox1^ΔLIV эмбрионами и эмбрионами, лишенными Cebpa, Hnf6, Oc-2 или Hhex (Hunter et al., 2007; Clotman et al., 2005; Yamasaki et al., 2006) является то, что паренхимные структуры, обнаруживающие признаки настоящих желчных протоков (т.e. экспрессируют маркеры холангиоцитов, но не маркеры гепатоцитов, обнаруживают апикально-базальную полярность и имеют просветы) развиваются только в печени эмбрионов Prox1^ΔLIV. Интересно, что эти эктопические желчные структуры были особенно многочисленные в регионе ворот (hilar) и вблизи портальных вен, это указывает на то, что специфические локальные сигналы возможно играют роль в их образовании. Мы полагаем, что околопортальный градиент TGFβ, предполагаемый Clotman et al. (Clotman et al., 2005) вносит вклад в формирование эктопических желчных протоков в печени Prox1^ΔLIV, поскольку этот сигнальный путь является известным индуктором развития желчных путей (Lemaigre, 2009; Si-Tayeb et al., 2010). Следовательно, присутствие как гибридных холангиоцит-гепатоцит агрегатов и настоящих желчных структур в паренхиме Prox1-дефицитной печени может указывать, что хотя спецификация холангиоцитов является самопроизвольным (default) выбором печеночных предшественников, полная активация программы желчных протоков нуждается в специфических индуктивных сигналах. Итак наше исследование демонстрирует, что активность Prox1 необходима для спецификации клеточно1й судьбы гепатоцитов из печеночных предшественников.

Premature, abnormal intrahepatic bile duct morphogenesis occurs upon Prox1 inactivation

Печень Prox1^ΔLIV обладает избытком клеток, экспрессирующих Sox9 вокруг веточек портальной вены, начиная со ст. E12.5. Два главных результата нашего исследования подтверждают, что эти альтерации являются следствием усиления детерминации клеток холангиоцитов: (1) устранение Prox1 не усиливает пролиферацию клеток ductal пластинки или PDS и (2) делеция Prox1 в печеночных клетках после E13.5 (т.e. , скорее всего, после выбора клеточной судьбы холангиоцитов) не приводит к гиперплазии желчных протоков. Однако остаётся неясным, почему желчные протоки формируются преждевременно в Prox1^ΔLIV печени.

Внутрипеченочный морфогенез желчных протоков является последовательным процессом, использующим образование одиночного слоя из Sox9⁺/Hnf4α- холангиоцитов (ductal пластинка), асимметричных околопортальных структур, экспрессирующих Sox9 на портальной стороне и Hnf4α на паренхимной стороне (PDSs), и симметричных тубулярных структур (Sox9⁺) , обнаруживающих апикально-базальную полярность и просветы (желчные протоки) (Antoniou et al., 2009). Интересно, что тубулярный1 морфогенез не следует тому же самому паттерну в печени с истощением Prox1. В частности, кластеры Sox9⁺ клеток, но не однослойная ductal пластинка были отмечены в околопортальных областях мутантной печени на ст. E12.5. Эти клеточные агрегаты, содержащие смесь клеток, экспрессирующих Sox9, Hnf4α или оба, были окружены базальной мембраной. На ст. E15.5, когда большинство желчных структур в печени дикого типа состоит из ductal пластинок и PDSs (Antoniou et al., 2009), почти все холангиоциты в околопортальных областях печени с истощением Prox1 формируют крупные тубулярные структуры, напоминающие зрелые желчные протоки. Присутствие базальной мембраны, по-видимому, помогает успешности желчной морфогенетической программы, включая формирование просвета и приобретение апикально-базальной полярности в ранних околопортальнрых эпителиальных агрегатах, лишенных функции Prox1, поскольку печеночные предшественники, поддерживаемые в культуре на laminin-111-содержащем геле, дают структуры протоков, выстланные поляризованными желчными клетками (Tanimizu et al., 2007). Более того, недавнее исследование (Tanimizu et al., 2012) показало, что морфогенез желчных протоков нуждается в сигналах, обеспечиваемых c помощью α1- и α5-содержащих ламининов.

Возможно, что вновь детерминированные холангиоциты в печени Prox1^ΔLIV лучше реагируют на локальные TGFβ , поскольку они лишены ингибиторов этого пути. Следовательно, увеличение чувствительности к TGFβ в комбинации с др. сигнальными путями (напр. Notch) могут запускать морфогенез желчных путей преждевременно в печени Prox1^ΔLIV. В свою очередь, усиленное образование желчных протоков, по-видимому, ведет к избыточному отложению белков внеклеточного матрикса и к экспансии мезенхимных клеток, поскольку в поврежденной печени образование структур протоков сопровождается отложением коллагенов и экспансией фибробластных клеток (Desmet et al., 1995). Наконец, повышенная продукция TGFβ лигандов, по-видимому, вносит вклад в эти альтерации, поскольку этот цитокин является известным индуктором фиброза во взрослой печени (Bataller and Brenner, 2005).

Итак, мыши Prox1^ΔLIV представляют собой новую животную модель нарушений формирования внутрипеченочных желчных протоков в результате избыточной детерминации клеток желчных предшественников (Raynaud et al., 2011; Strazzabosco and Fabris, 2012).

Prox1 is a novel regulator of the hepatocyte phenotype

Потеря функции Prox1 тяжело затрагивает экспрессию многочисленных метаболических генов в гепатоцитах, нарушает морфогенез и архитектуру гепатоцитов. Гибель мышей Prox1^ΔLIV непосредственно после рождения подтверждает гипотезу, что активность Prox1 важна для собственно развития гепатоцитов.

Одной из лавных находок данного исследования стало то, что паренхимные гепатобласты нуждаются в Prox1, чтобы инициировать собственно экспрессию генов гепатоцитов. Отсутствие активности Prox1 может нарушать непосредственно транскрипцию гепатоцитов, как подтверждает недавнее исследование (Charest-Marcotte et al., 2010), показавшее, что Prox1 соединяется с промоторным регионом различных генов гепатоцитов в печени взрослых. Интересно, что некоторые из предполагаемых генов мишеней для Prox1 в гепатоцитах (Apoc3, Ces3, Cyp3a11, ApoH, Apoc2 и Klf15) обнаруживают пониженную экспрессию в печени Prox1^ΔLIV, начиная со ст. E12.5.

Хотя в целом гепатоцитарные транскрипты были в основном снижены в печени Prox1^ΔLIV, мы идентифицировали горстку метаболических транскриптов гепатоцитов (напр. Apoa4, Cyp7a1 и Ldhb), количество которых увеличивалось, когда функция Prox1 отсутствовала. Два из этих транскриптов (Cyp7a1 и Ldhb) являются известными мишенями для печеночных ядерных рецепторов (NRs): Cyp7a1 был мишенью для Nr5a2 и Hnf4α, тогда как Ldhb является потенциальной мишень для ERRα. Интересно, что межбелковые взаимодействия между Prox1 и каждым из этих NRs, были описаны в клетках HepG2 или экстрактах печени взрослых (Charest-Marcotte et al., 2010; Qin et al., 2004; Song et al., 2006), при этом Prox1 действовал как корепрессор транскрипции в возникающем в результате комплексе. Этот негативный эффект Prox1 на функцию NR может объяснить, почему повышается экспрессия Cyp7a1 и Ldhb после устранения Prox1. Безусловно, дефектная регуляция активности Nr5a2 и Hnf4α может оказывать более широкое воздействие на транскрипцию гепатоцитов, поскольку эти NRs является важными стержневыми компонентами сети печеночной транскрипционных факторов (Kyrmizi et al., 2006).

Итак, мы продемонстрировали, что Prox1 является новым, критическим регулятором клеточной дифференцировки и морфогенеза во время формирования печени. Кроме того, мы установили, что активность Prox1 необходима для становления правильной метаболической транскрипции в печеночных гепатоцитах. Поэтому мы полагаем, что Prox1 является новым компонентом регуляторной сети транскрипции в гепатоцитах. Наши находки важны для улучшения in vitro программирования дифференцировки стволовых клеток в гепатоциты для клеточной терапии при болезнях печени.