Многие животные модели, такие как куры, Xenopus, рыбки данио и мыши, для изучения молекулярных механизмов развития печени. Поскольку многие функции ключевых молекул в развитии печени законсервированы у этих видов. Однако некоторые функции важных молекул в развитии печени могут отличаться между человеком и др. видами. Хотя анализ используемых генетически модифицированных мышей успешен, но конечно невозможно осуществить генетические эксперименты, чтобы выявить молекулярные механизмы развития печени на человеке. Плюрипотентные стволовые клетки, такие как human embryonic stem cells (hESCs), как ожидается, смогут преодолеть некоторые из этих проблем по изучению эмбриогенеза человека, включая развитие печени, поскольку профили генной экспрессии этой модели сходны с таковыми при нормальном развитии печени (Agarwal et al., 2008; DeLaForest et al., 2011).

Во время развития печени гепатобласты дифференцируются в гепатоциты и холангиоциты. Предыдущее исследование показало, что высокая концентрация TGFβ может вызывать дифференцировку холангиоцитов из гепатобластов (Clotman et al., 2005). Для передачи сигналов TGFβ стимулируется TGFβ receptor 2 (TGFBR2) с помощью TGFβ1, TGFβ2 или TGFβ3 (Kitisin et al., 2007). TGFβ соединяется с внеклеточным доменом TGFBR2, вызывая конформационное изменение, приводящее к фосфорилированию и активации TGFBR1. TGFBR1 фосфорилирует SMAD2 или SMAD3, которые соединяются с SMAD4, и затем SMAD комплексы перемещаются в ядро и действуют как транскрипционные факторы, чтобы экспрессировать различного типа связанные с дифференцировкой гены (Kitisin et al., 2007). Хотя функция TGFBR2 в регенерации печени взрослых тщательно исследована (Oe et al., 2004), функция TGFBR2 в выборе судьбы гепатобластами не установлена.

CCAAT/enhancer binding protein (c/EBP) транскрипционные факторы играют определяющие роли в дифференцировке различных типов клеток, включая гепатоциты (Tomizawa et al., 1998;Yamasaki et al., 2006). Анализ c/EBPα (Cebpa) нокаутных мышей показал, что присутствуют многие аномальные псевдожелезистые структуры, которые совместно экспрессируют антигены, специфичные как для гепатоцитов, так и холангиоцитов, в печеночной паренхиме (Tomizawa et al., 1998). Эти данные показали, что c/EBPα играет важную роль в дифференцировке гепатоцитов. Известно также, что супрессия экспрессии c/EBPα в перипортальных гепатобластах стимулирует дифференцировку холангиоцитов (Yamasaki et al., 2006). Хотя функция c/EBPβ в развитии печени хорошо известна, взаимоотношения между передачей сигналов TGFβ и c/EBPα-обеспечиваемой регуляцией транскрипции в выборе судьбы гепатобластами известны плохо. c/EBPβ также известен как важный фактор для функции печени (Chen et al., 2000), хотя функция c/EBPβ в выборе клеточных судеб гепатоцитами известна плохо. c/EBPα и c/EBPβ соединяются с одним и тем же сайтом связывания ДНК. Однако, активность промотора специфичных для гепатоцитов генов, таких как те, что кодируют hepatocyte nuclear factor 6 (HNF6, также известен, как ONECUT1) и UGT2B1, позитивно регулируются с помощью c/EBPα, но не c/EBPβ (Hansen et al., 1998; Plumb-Rudewiez et al., 2004), подтверждая,что функции c/EBPα и c/EBPβ в выборе судьбы гепатобластами может быть разной.

В данном исследовании мы впервые исследовали функцию GFBR2 в выборе клеточных судеб гепатобластами, использовав hESC-производные гепатоцит-подобные клетки, которые обладали способностью самореплицироваться, дифференцироваться в гепатоцитарный и холангиоцитарный клоны и проникать в печень обработанных carbon tetrachloride (CCl4) иммунодефицитных мышей. Осуществлен анализ in vitro избыточности и недостаточности функции и анализ in vivo трансплантаций. Затем мы исследовали, как экспрессия TGFBR2 регулируется при выборе гепатобластами клеточных судеб. Наконец, мы исследовали, могут ли быть наши находки воспроизведены на delta-like 1 homolog (Dlk1)-позитивных гепатобластах, получаемых из печени E13.5 мышей. Получено первое доказательство, что c/EBP-обеспечивает регуляцию экспрессии TGFBR2 при выборе гепатобластами человека клеточной судьбы.

DISCUSSION

Причиной данного исследования стало лучшее понимание молекулярных механизмов выбора судьбы гепатобластами человека. Чтобы выяснить молекулярные механизмы развития печени, использовали условных нокаутных модельных мышей и системы культур клеток. Напр., DeLaForest et al. продемонстрировали роль HNF4α в дифференцировке гепатоцитов при использовании культуральной системы hESC (DeLaForest et al., 2011). Технология индукции дифференцировки гепатоцитов из hESCs была существенно улучшена (Takayama et al., 2012a). Поскольку возможно генерировать функциональные HBCs из hESCs, которые могут самореплицироваться и дифференцироваться в клоны гепатоцитов и холангиоцитов (supplementary material Fig. S1 and Fig. 1), то модель дифференцировки HBCs из hESCs д. предоставить мощный инструмент для анализа молекулярных механизмов развития печени человека.

В данном исследовании молекулярные механизмы выбора судеб гепатобластами выявляли, используя культуральные системы hESC. HBCs, культивируемые на человеческих LN111, экспрессируют маркеры гепатобластов (supplementary material Fig. S1) и обладают способностью дифференцироваться в гепатоцито-подобные клетки и холангиоцито-подобные клетки (Fig. 1). Поскольку предыдущее исследование показало, что низкая и высокая концентрации TGFβ необходимы для дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов, соотв. (Clotman et al., 2005), мы ожидали. что TGFBR2 может вносить вклад в выбор судьбы гепатобластами. Хотя TGFβ1, β2 и β3 все являются лигандами для TGFBR2, TGFβ3 не способствует дифференцировке в холангиоциты (Fig. 2). Это возможно из-за того, что TGFβ3 неспособен усиливать активность экспрессии SOX9, который является ключевым фактором в развитии желчных протоков in vivo и в дифференцировке холангиоцитов in vitro (Antoniou et al., 2009). Мы исследовали функцию TGFBR2 в выборе гепатобластами клеточной судьбы и установили, что избыточная экспрессия способствует дифференцировке холангиоцитов, тогда как нокдаун TGFBR2 способствует дифференцировке гепатоцитов (Fig. 3). Хотя экзогенный TGFβ лиганд не добавлялся в среду для дифференцировки, эндогенный TGFβ лиганд присутствует в Matrigel, который используется в нашем протоколе дифференцировки, может соединяться с TGFBR2. Также возможно, что клетки, детерминированные в желчный клон, экспрессируют TGFβ, т.к. в предыдущем исследовании было показано, что эпителиальные клетки желчных протоков экспрессируют TGFβ (Lewindon et al., 2002).

Чтобы исследовать молекулярные механизмы регуляции экспрессии TGFBR2 область промотора TGFBR2 была проанализирована (Fig. 4). Активность промотора TGFBR2 негативно регулировалась с помощью c/EBPα и позитивно регулировалась с помощью c/EBPβ. Избыточная экспрессия c/EBPα подавляет активность промотора TGFBR2, несмотря на тот факт, что c/EBPα белок не имеет домена репрессии (Yoshida et al., 2006). CTBP1 и CTBP2 (Vernochet et al., 2009) , как известно, являются ко-репрессорами c/EBPα, и в этом качестве выступают кандидатами на роль ко-репрессоров, рекрутируемых на сайты связывания c/EBP в промоторном регионе TGFBR2. Протеомный анализ c/EBPα д. предоставить возможность идентифицировать ко-репрессор c/EBPα. Поскольку большие количества почти гомогенных гепатобластов могут дифференцироваться из hESCs, что сравнимо с выделением гепатобластов из печени плодов, а технология дифференцировки гепатоцитов из hESCs может оказаться пригодной для протеомного анализа.

Мы установили, что трансдукция Ad-c/EBPα может способствовать дифференцировке гепатоцитов путем супрессии экспрессии TGFBR2 (Fig. 5). Наши находки могут предоставить детальное объяснение фенотипа нокаута c/EBPα мышей, т.е. дифференцировка гепатоцитов ингибирована, а дифференцировка холангицитов стимулируется у этих мышей (Yamasaki et al., 2006). Мы также установили, что трансдукция Ad-c/EBPβ может способствовать дифференцировке холангиоцитов за счет усиления экспрессии TGFBR2. Поскольку и c/EBPα и c/EBPβ могут соединяться с одним и тем же сайтом, то обоюдная конкуренция за место связывания, скорее всего, зависит от регуляции экспрессии c/EBPα или c/EBPβ. Следовательно, соотношение между экспрессией c/EBPα и c/EBPβ может предопределять клеточную судьбу гепатобластов путем регуляции уровня экспрессии TGFBR2. Мы подтвердили, что наши находки могут быть воспроизведены на гепатобластах от плодов мышей (Fig. 6). Поскольку предыдущее исследование показало, что добавление hepatocyte growth factor (HGF) к гепатобластам усиливает экспрессию c/EBPα (Suzuki et al., 2003), то соотношение между c/EBPα и c/EBPβ может быть детерминировано с помощью HGF во время дифференцировки гепатоцитов.

В данном исследовании мы установили, что TGFBR2 является мишенью для c/EBPs при выборе судьбы гепатобластами (supplementary material Fig. S9). c/EBPα способствует дифференцировке гепатоцитов путем подавления экспрессии TGFBR2, тогда как c/EBPβ способствует дифференцировке холангиоцитов путем усиления экспрессии TGFBR2. Это исследование указывает на возможый молекулярный механизм, лежащий в основе детерминации клонов из гепатобластов человека, контролируемой градиентом передачи сигналов TGFβ . Мы полагаем, что сходные процедуры, которые приспособлены к моделированию дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека (включая iPS клетки человека) могут быть использованы не только для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов человека, но и также для изучения причин врожденных аномалий печени и желчных протоков человека.