Передние и задние конечности являются производными латеральной пластинки мезодермы (LPM), которые возникают в фиксированных позициях вдоль осей тела позвоночных. Формирование конечностей инициируется сигналами индукции конечностей от осевых тканей [1]. Презумптивные регионы, формирующие конечности, первоначально экспрессируют два T-box гена перед образованием видимых зачатков конечностей, Tbx5 в формирующихся передних конечностях и Tbx4 в задних конечностях [2]-[5]. Генетические исследования на мышах показали, что оба гена являются критическими для нормального роста конечностей путем активации Fgf10 в мезенхиме конечностей [6]-[8]. Fgf10 впоследствии индуцирует экспрессию Fgf8 в апикальном эктодермальном гребне (AER) и Fgf8, продуцируемый AER, в свою очередь, поддерживает экспрессию Fgf10 в мезенхиме, чтобы установить позитивную петлю обратной связи из передачи сигналов Fgf, поддерживающей рост конечностей. Мутации в гене TBX5 человека вызывают Holt-Oram Syndrome (HOS OMIM142900), нарушение, характеризующееся аномалиями верхних конечностей и сердца [9], [10], а мутации в TBX4 вызывают Small Patella Syndrome (SPS OMIM 147891), нарушение, характеризующееся дефектами колен, таза и пальцев ног [11]. Tbx5 является самым ранним маркером мезенхимы презумптивных передних конечностей и из-за активации этот фактор внутри определенного региона LPM в конечном счете диктует позицию, где возникнут передние конечности, идентификация факторов, контролирующих активацию этого домена экспрессии Tbx5, позволит выявить используемые механизмы, позволяющие закладывать конечности позвоночных и диктующие позицию передних конечностей у эмбрионов.

Tbx5 первоначально экспрессируется в регионе LPM, формирующем передние конечности ещё до появления зачатка, и он постепенно ограничивает регион передних конечностей по ходу развития. Tbx5 важен для формирования передних конечностей, и эта исключительная потребность ограничивается коротким периодом времени, когда происходит инициация зачатка конечностей [12]. Tbx4, является паралогом Tbx5, он способен восстанавливать формирование передних конечностей после условной делеции Tbx5 [13]. Более того, родоначальный Tbx4/5 ген представлен геном AmphiTbx4/5 у не имеющих конечностей головохордовых, amphioxus, может полностью компенсировать потерю Tbx5 у мыши [14]. Это указывает на то, что родоначальный белок от безногих организмов приобрел потенциал индукции конечности и подтверждает модель, согласно которой эволюция регуляторного элемента оказалось достаточной, чтобы активировать экспрессию Tbx5 в LPM, это стало критической ступенью в приобретении конечностей во время эволюции позвоночных.

Hox гены являются консервативными гомеодомен-содержащими транскрипционными факторами, расположенными в виде кластеров в геноме. Хромосомная организация генов в комплексы отражает паттерн их экспрессии вдоль ростро-каудальной оси тела, чтобы детерминировать позиционные характеристики [15], [16]. Т.к. относительные позиции конечностей, осевого позвоночника и доменов экспрессии Hox законсервированы среди позвоночных, несмотря на варьирующие количества каждого из типов позвонков (напр. шейных, торакальных, поясничных и крестцовых позвонков), Hox гены стали прекрасными кандидатами на роль детерминантов позиции конечностей [17], [18]. Несмотря на неоспоримую важность Hox генов в формировании паттерна развивающегося эмбриона, очень мало известно о их непосредственных мишенях и механизмах действия.

Ранее мы идентифицировали регуляторный элемент в Tbx5, существенный для ранней экспрессии в передних конечностях [19]. Этот элемент содержит сайт связывания Hox, необходимый для энхансерной активности, следовательно, Hox гены выступают в качестве непосредственных, позитивных регуляторов Tbx5. Однако поскольку способность активировать Tbx5 не ограничена строго Hox генами, экспрессируемыми только на уровне передних конечностей, то д. существовать механизм, с помощью которого устанавливается ростро-каудальный Hox код для ограничения активности передними конечностями Tbx5, который пока неизвестен. Здесь мы продемонстрировали, как члены группы Hox паралогов действует кооперативно по ограничению экспрессии Tbx5 в LPM, это в конечном итоге и детерминирует позиции передних конечностей, которые возникают по бокам эмбриона. Мы показали, что мутации одиночного сайта связывания Hox в регуляторном элементе Tbx5 передних конечностей вызывает расширенную экспрессию репортерного гена в каудальную часть LPM. Ограничение экспрессии Tbx5 ростральной частью путем репрессии в каудальной части LPM обеспечивается с помощью Hoxc8/9/10 генов, и эта репрессивная функция ограничивается Hox генами, которые экспрессируются в Tbx5-негативной каудальной части LPM. Далее мы картировали домены Hoxc9 белка, необходимые для обеспечения транскрипционной репрессии, которые отличают эти паралоги от др. Hox белков, экспрессируемых по всем бокам эмбрионов. Наши результаты демонстрируют, как локальный комбинаторный код Hox белков осуществляет транскрипционную активацию и репрессию вдоль ростро-каудальной оси эмбриона, ограничивая экспрессию Tbx5 передними конечностями и предопределяя в конечном итоге позицию передних конечностей.

Discussion

Используя регуляторный элемент Tbx5 в передних конечностей в качестве подхода, мы оказались способны различить противоположные транскрипционные активности разных групп белков паралогов Hox. Hoxc9, также как Hoxc8 и Hoxc10, которые обычно экспрессируются в LPM каудальнее передних конечностей, могут репрессировать Tbx5, чтобы ограничить его экспрессию регионом на уровне передних конечностей в LPM (Fig. 7). Одиночный сайт связывания Hox (Hbs2) в Tbx5, энхансер передних конечностей, необходим для ограничения путем репрессии, т.к. мутации в этом сайте вызывают расширение экспрессии в каудальном направлении. Hoxc9 может супрессировать экспрессию Tbx5 посредством этого сайта, и эта репрессивная активность ограничивается каудальными Hox белками. Ранее мы показали, что Hox4 и Hox5 паралоги позитивно регулируют экспрессию Tbx5 [19]. Мы выявили комбинаторную регуляцию Tbx5 с помощью сигналов от отличающихся паралогов Hox генов. Hox PG4 и PG5 гены экспрессируются в формирующей передние конечности части LPM, вызывая транскрипционную активацию комплекса, чтобы позитивно регулировать Tbx5, тогда как Hoxc9, также как Hoxc8 и Hoxc10 гены экспрессируются в LPM более каудальных уровней, образуя репрессивный комплекс, чтобы ограничивать экспрессию Tbx5. Итак, наши результаты показывают, что ограничение экспрессии Tbx5 передними конечностями достигается посредством кооптирования двух характеристик Hox генов, их колинеарного паттерна экспрессии вдоль ростро-каудальной оси тела и функциональной специфичности Hox белков из разных групп паралогов.

Figure 7. Model for the combinatorial regulation of forelimb-restricted Tbx5expression by distinct paralogous Hox gene inputs.

A. Hox genes expressed in the rostral forelimb-forming LPM induce Tbx5 expression (yellow arrows). In the caudal flank there is a latent capacity to activate Tbx5 expression (grey arrows) that is normally masked by the presence of caudally expressed Hox genes (Hoxc8, Hoxc9 и Hoxc10) that repress expression of Tbx5 (green arrows). Thus, a combination of Hox colinear expression и the specific activator or repressor activities of distinct Hox protein paralogs dictate positioning of forelimb-forming region. Caudally expressed Hox genes, such as Hoxc9, bound on Hbs2, control the transcriptional repression of Tbx5. This site is occupied both in forelimb-forming region (Hox PG4/5) и in caudal LPM (Hoxc9). However, only Hoxc9 forms a repressive complex by recruiting co-repressor(s). HD, homeodomain; SM, specificity module; N, N-terminus.

Hox binding site specificity

Наши результаты показали, что 5 из 6 сайтов, связывающих Hox (а именно, Hbs1 и Hbs3-6) в регуляторном элементе Tbx5 передних конечностей, необходимы для позитивной регуляции экспрессии Tbx5 и только единственный сайт (Hbs2) необходим для его репрессии в каудальной части LPM (Fig. 1). Одним из возможных механизмов для объяснения, как такие противоположные транскрипционные эффекты обеспечиваются, так что разные Hox белки обладают разными преференциями по связыванию с этими сайтами. Напр., Hox белки, действующие как активаторы, такие как Hox PG4 и PG5, обладают более значительным сродством к Hbs1 и 3-6, тогда как репрессивные Hox белки, такие как Hoxc8/9/10, преимущественно соединяются с Hbs2. В данном исследовании мы показали, что как Hoxc5 так и Hoxc9 белки могут соединяться с репрессивным Hbs2 сайтом (Fig. 5), указывая, что репрессивная активность Hbs2 не обеспечивается за счет предпочтительного связывания репрессивных Hox белков.

Согласно альтернативной модели транскрипционная активность Hox комплекса, связанного с Hbs2 детерминируется с помощью ко-факторов. Последовательность Hbs2 идентична последовательностям Hbs1 и Hbs3, поэтому мы сравнивали последовательности, окружающие эти сайты связывания Hox. Одно из исключительных свойств Hbs2 было идентифицировано, используя Mat Inspector (http://www.genomatix.de), присутствие последовательности в 6 пн. названных сайтами комплексов Pbx1-Meis1, расположенными в 3' Hbs2 (6bp3'). Pbx является ко-фактором Hox, который может ослаблять Hox-обеспечиваемую транскрипцию генов путем рекрутирования гистоновых деацетилаз (HDACs) [27]. Следовательно, возможный механизм транскрипционной репрессии посредством Hbs2 связан с рекрутированием HDACs на Hbs2/6bp3' с помощью Pbx. Чтобы исследовать эту модель, мы вызывали мутации этой последовательности в 6 пн, оставляя Hbs2 интактным. Эта мутация не вызывала экспансии экспрессии репортного гена в отличие от мутации в Hbs2 или мутаций в Hbs2 и 6bp3' (Fig. 1), подтверждая, что репрессия не зависит от 6bp3'. Т.о., наши результаты не подтверждают роли Pbx в детерминации транскрипционной активности белков Hox, связанных с регуляторным элементом Tbx5 в передних конечностях.

Specificity of Hox function

Специфичность белков Hox из разных групп паралогов д. тонко регулироваться. Одним из механизмов, с помощью которого это достигается, это разная ДНК-связывающая специфичность, напр., гомеодомены Hoxc5 и Hoxc9 имеют разные предпочтения последовательностей к белкам связываемых микромассивов [25]. Мы установили, однако, что и Hoxc5 и Hoxc9 могут соединяться с Hbs2 (Fig. 5), это указывает, что специфичность не предопределяется разной способностью связывания ДНК у Hox белков. Кроме того, мы также продемонстрировали, что Hoxc9N5C химерный белок, содержащий N-терминальный репрессивный домен от Hoxc9, слитый с гомеодомен-содержащим C-концом от Hoxc5, может репрессировать Tbx5. Т.о., транскрипционная репрессия, специфичная для Hoxc9 не обусловливается с помощью ДНК-связывающей специфичности, а скорее достигается с помощью активности по транскрипционной репрессии, ограниченной Hoxc9, которая обусловливается двумя доменами; специфичностью модуля, включая Pbx-связывающий гексапептид и гомеодоменовое N-терминальное плечо и регион N-терминальный по отношению к модулю специфичности (Fig. 7).

Механизм, с помощью которого эти домены обеспечивают репрессивную активность, еще предстоит выяснить. Одной из возможных моделей является взаимодействие с др. транскрипционными регуляторными доменами белка. Гексапептид AbdA репрессирует экспрессию dpp путем ингибирования С-терминального домена активации, богатого glutamine (Q) [28]. Мутации в гексапептиде превращают AbdA из репрессора в активатор, не затрагивая выбор сайта связывания ДНК. Хотя Hoxc9 лишен этого Q-богатого домена, гексапептид Hoxc9 может блокировать активность не идентифицированного домена активатора. Др. возможность заключается в том, что длина линкерного региона между гексапептидом и гомеодоменом предопределяет транскрипционную активность. Некоторые изоформы Antp отличаются размером линкера. Синтетический Antp белок с длинным линкером ведет себя как активатор, тогда как конструкция с коротким линкером действует как репрессор, подтверждая важность размера линкера [29]. Т.к. Hoxc9 имеет более короткую линкерную последовательность, чем Hoxc5, это может способствовать его функции как репрессора.

Т.к. маловероятно, что Hox белок сам по себе непосредственно репрессирует транскрипцию Tbx5, мы подтвердили модель, что Hoxc9 супрессирует экспрессию Tbx5 путем взаимодействия с ко-репрессорами (Fig. 7). Одним из кандидатов является HDAC, которая может соединяться с Hox белками непосредственно [30], однако, с помощью EMSA мы оказались неспосбна определить HDAC/Hoxc9 комплекс на Hbs2. Др. потенциальными помощниками могут быть белки Smad. В гальтерах Drosophila, a Mad/Med/Shn комплекс работает в комбинации с Ubx, чтобы репрессировать экспрессию Sal [31]. Имеется потенциальный сайт связывания Smad проксимальнее от Hbs2, однако, мы вызывали мутации в этом сайте и не наблюдали расширения экспрессии, а скорее обнаруживали ограничение экспрессии дистальной частью зачатка конечности, это указывает на то, что сайт связывания Smad может оказывать позитивный импульс на экспрессию Tbx5. Др. кандидатом на роль репрессора выступают engrailed (En) и sloppy paired (Slp) поскольку у Drosophila, они образуют комплекс с Hox, Exd и Hth, чтобы репрессировать транскрипцию [32]-[34]. Ни один из двух мышиных En генов, Engrailed1 и Engrailed2, не экспрессируется в LPM на ст. до образования почки конечности [35], [36]. Гомолог Slp млекопитающих, fork head box G1 (FoxG1) /brain factor 1 (BF-1) также не экспрессируется в LPM [37]. Следовательно, какие из предполагаемых ко-репрессоров обеспечивают уникальную репрессивную активность Hoxc9 ещё предстоит определить.

Мы показали, что Hoxc8 и Hoxc10 обладают способностью репрессировать транскрипцию, подобной с Hoxc9 (Fig. S1). Чтобы проникнуть в сущность механизмов их функционирования, мы сравнивали аминокислотные последовательности Hoxc8, Hoxc9 и Hoxc10 (данные не приведены). Однако мы не смогли обнаружить каких-либо явных законсервированных доменов век гомеодоменов. Возможно, что они используют разные механизмы, чтобы репрессировать экспрессию Tbx5 или они обладают общей сходной 3D структурой доменов, несмотря на их различия в аминокислотных последовательностях.

Patterning of LPM

Наш анализ регуляторного элемента Tbx5 передних конечностей выявил связь между формированием паттерна вдоль ростро-каудальной оси эмбриона генов Hox и программой, которая контролирует позиционирование территории образования передних конечностей. Ясно, что корреляция между экспрессией Hox и закладкой территории передних конечностей в LPM была предположена ранее [17], [18], [38]. Воздействие Fgf на фланговые области между конечностями по соседству с нормальными крыльями индуцирует крыло-подобные добавочные конечности, экспрессирующие Tbx5 [5], [39]. До возникновения эктопических крыльев эндогенная экспрессия Hoxc9 редуцирована [38], это согласуется с подавлением Hoxc9 как репрессора Tbx5 (и последующей программы развития передних конечностей), это существенно для возникновения зачатка эктопического крыла из этого региона. У лишенных конечностей питонов экспрессия Hoxc8 расширена в ростральную сторону к передней границе туловища [18]. Hoxc8 экспрессируется исключительно в Tbx5-негативной каудальной части LPM на ст. до возникновения зачатка конечности у кур и мышей (Fig. 2) и он может подобно Hoxc9, репрессировать Tbx5 (Fig. S1). Следовательно, наши результаты объясняют механизмы, ведущие к потере передних конечностей у змей путем репрессии Tbx5 вследствие расширения экспрессии Hoxc8 на всё туловище.

Предыдущее исследование продемонстрировало присутствие и функцию Hox9 генов в формировании переднезаднего паттерна передних конечностей [40]. Полная потеря группы паралогов Hox9 приводит к потере экспрессии Hand2 в задней части передних конечностей и к последующей редукции экспрессии Shh, в то же время отсутствует эффект на экспрессию Tbx5 . Неспособность обнаружить какую-либо каудальную экспансию Tbx5 у этих мутантов может быть объяснено просто перекрыванием функции с Hoxc8 и Hoxc10. В том же самом исследовании установлено, что Hoxc9 экспрессируется в зачатке передних конечностей на ст. E9.5, но не обнаруживается на ст. E10.5. Экспрессия Tbx5 сначала инициируется в регионе, формирующем передние конечности, на ст.E8.5. Мы поэтому исследовали экспрессию Hoxc9 на ст. E8.5-E9.5 (данные не показаны), однако, мы не обнаружили экспрессии Hoxc9 в регионе, дающем передние конечности, в противоположность строгому окрашиванию каудальных тканей. Мы пришли к выводу, что Hoxc9 не присутствует в регионе образования передних конечностей на стадиях, когда впервые инициируется экспрессия Tbx5. Более поздняя экспрессия Hoxc9 недостаточна, чтобы вызывать обнаружимую репрессию домена Tbx5, уже активированного с помощью Hox4/5 генов паралогов.

В то время как мы показали, что Hoxc8, Hoxc9 и Hoxc10 могут репрессировать экспрессию Tbx5, наше исследование не исключило возможность, что др. экспрессируется каудально Hox паралоги выполняют перекрывающуюся функцию репрессии Tbx5. Мыши, нулевые по Hoxc кластеру, не обнаруживают дефектов в скелете конечностей [41], однако, экспрессии Tbx5 у этих мутантов не была описана, и мы предположили, что эктопическая экспансия Tbx5 в каудальную часть LPM может не вызывать каких-либо скелетных дефектов. Необходим дальнейший анализ для выявления потребности в ограниченных каудальной частью Hox паралогов, таких как Hox8, Hox9 и Hox10 для репрессии Tbx5 в каудальной части LPM.

Кроме того, поскольку наши результаты чётко демонстрируют важность специфических Hox сигналов, чтобы генерировать ограниченную экспрессию Tbx5 в LPM, сходный код Hox белков присутствует в аксиальных тканях (нервной трубке и сомитах), которые не экспрессируют Tbx5. Активность регуляторного элемента Tbx5 передних конечностей ограничена LPM и это LPM ограничение поддерживается после мутаций в Hbs2, которые приводят к каудальной экспансии экспрессии. Единственное возможное объяснение для LPM ограничения - это присутствие неизвестных репрессоров в аксиальной ткани или альтернативно дополнительных факторов, активных исключительно в LPM, необходимых для экспрессии Tbx5. Odd-skipped related (Osr) гены являются кандидатами, т.к. они экспрессируются в LPM, но отсутствуют в аксиальных тканях, таких как нервная трубка и сомиты [42]. Мы вызывали мутации в предполагаемом сайте связывания Osr в регуляторном элементе Tbx5 передних конечностей, чтобы проверить, теряется ли активность репортера. Активность элемента оставалась неизменной, это подтверждает, что Osr гены не нужны для экспрессии Tbx5 в LPM (Fig. S3).

Conclusions

Our analysis of the Tbx5 forelimb regulatory element has revealed a mechanism by which Hox genes regulate embryonic patterning и how recruitment of regulatory elements allow for the acquisition of novel structures и independent modulation of their morphology. Mechanisms that control PG-specific Hox functions have been described in Drosophila [26], [43]-[48]. Vertebrates, however, have a minimum of 2-4 Hox genes from the same PG и functional redundancy between Hox proteins from the same PG makes it difficult to examine their specific functions experimentally. Here we used a direct target of Hox activity, a regulatory element of Tbx5, to analyse the mechanism of Hox functional specificity и distinguished DNA binding specificity и transcriptional activity. Interestingly, the Tbx5 forelimb regulatory element contains both activating sites, так и a repressive site in a relatively short fragment of 361 bp. Active complexes are not spatially restricted и can be formed by a range of Hox PG proteins present throughout the rostral-caudal LPM. Instead, restriction of Tbx5 expression is achieved by superimposing a dominant repressive (Hoxc8, c9 и c10) complex that ultimately determines the caudal boundary of Tbx5 expression. Thus, the regulation of Tbx5 expression in the LPM represents an excellent system to understand the interactions between neighbouring Hox binding sites и how the consequent output is integrated.