Кортиев орган является превосходной системой для изучения механизмов формирования паттерна клеток, обеспечиваемое высоко организованными массивами сенсорных клеток. Он содержит один ряд внутренних волосковых клеток, тря рядла наружных волосковых клеток и несколько классов специализированных поддерживающих клеток, включая колонные (pillar) и Deiters' клетки. Сигналы, ответственные за этот замысловатый и тонкодисперсный паттерн клеток, начинают распознаваться и включают путь передачи сигналов Notch. Notch1 рецептор экспрессируется в поддерживающих клетках, тогда как, Notch лиганды Jagged2 (Jag2), Delta1 и Delta3 экспрессируются в волосковых клетках после того, как они животных дифференцируются из просенсорных предшественников [1], [2], [3], [4]. Излишние внутренние и наружные волосковые клетки образуются за счет поддерживающих клеток в отсутствие Notch1, Jag2 или Delta1 [5], [6], [7], [8], [9]. Кроме того, мутации в членах семейств Hes и Hey , нижестоящих эффекторов Notch, также вызывают увеличение количества волосковых клеток за счет поддерживающих клеток, при этом мутации множественных членов семейства Hes/Hey вызывают всё более тяжелые фенотипические отклонения [10], [11]. Эти исследования подтвердили, что латеральное ингибирование, обеспечиваемое с помощью передачи сигналов Notch действует, чтобы регулировать и поддерживать правильную пропорцию волосковых и поддерживающих клеток в сенсорных органах внутреннего уха.
Notch лиганд, Jagged1 (Jag1) экспрессируется во всех сенсорных органах внутреннего уха перед началом дифференцировки волосковых клеток [2], [3]. В развивающейся улитке мышей Jag1 сначала экспрессируется широко, а затем исключается из просенсорного домена и ограничивается органом Kоlliker's на ст. E13.5 [12]. Когда просенсорные предшественники в улитке дифференцируются в волосковые и поддерживающие клетки, то Jag1 подавляется в Kоlliker's органе и экспрессируется с Notch1 в поддерживающих клетках [2], [3]. Хотя было выдвинуто несколько гипотез для механизма функционирования Jag1 в развивающейся улитке, точная роль этого гена всё ещё плохо изучена. Условное инактивирование Jag1 в развивающемся внутреннем ухе приводит к тяжелым нарушениям органа Корти [6], [13]. Сенсорные клетки полностью отсутствуют в базальном регионе Jag1 условно мутантной улитки, тогда как вместо одного два ряда внутренних волосковых клеток, но не наружные волосковые клетки, наблюдаются в апикальном регионе улитки [6], [13]. Jag1 мутантные гетерозиготы, полученные с помощью ENU показали более умеренные фенотипические отклонения; они были лишены некоторых клеток в третьем ряду наружных волосковых клеток и содержали эктопические внутренние волосковые клетки [14], [15].
Т.к. часть исследования была использована для определения могут ли применяться self-inactivating (SIN) лентивирусы для эффективного инсерционного мутагенеза у трансгенных мышей, поэтому мы использовали экспрессирующий тирозиназу лентивирусный вектор, чтобы инфицировать преимплантационных albino (FVB/N) эмбрионов мыши с помощью субзональных инъекций. Экспрессия тирозиназы восстанавливает albinism и делает видимым, зависимым от дозы, репортер в разных сайтах интеграции. Трансгенные founder (F0) мыши разводились, чтобы выявить семейства с одиночным сайтом интеграции лентивируса и затем мыши подвергались инбридингу и проверялись на наличие инсерционных мутаций. В одном семействе (OVE2267B), гомозиготные мыши обнаруживали выраженное поведение кружения, указывающее на дефекты внутреннего уха. Место интеграции лентивируса в этом семействе было картировано в гене
Sfswap .
Sfswap был первоначально идентифицирован у
Drosophila в качестве супрессора индуцированной транспозоном мутации
white-apricot [16].
Sfswap кодирует RS-домен содержащий (SR-Like) белок, являющийся предположительно сплайс-фактором. RS-домен содержащие белки, как известно, регулируют многие аспекты процессинга РНК, включая сплайсинг, элонгацию транскриптов, стабильность транскриптов, ядерный экспорт и расщепление миРНК, а также геномную стабильность (rev. [17]). У
Drosophila, Sfswap регулирует сплайсинг некоторых генов, включая самого
Sfswap [18], [19], [20].
In vitro подтверждено, что
Sfswap участвует в процессинге РНК у млекопитающих, а также способствует полному сплайсингу транскриптов [21], [22], [23]. Пока неясно, регулирует ли Sfswap др. аспекты процессинга РНК, однако некоторые доказательства у
Drosophila подтверждают, что Sfswap может влиять на стабильность транскриптов [18], [24]. Наши
Sfswap мутантные мыши теряют слух, обнаруживают поведение кружения и дефекты улитки, удивительно сходные с теми, что наблюдаются у
Jag1 гипоморфных мутантов - они обнаруживают пониженные количества наружных волосковых клеток и ассоциированных с ними поддерживающих клеток и повышенные количества внутренних волосковых клеток. Компаундные мутанты
Sfswap и Jag1 обнаруживают более выраженные фенотипические отклонения и имеют укороченные полукружные каналы, это указывает на генетическое взаимодействие. Более того, мы показали, что уровни экспрессии ряда генов, участвующих в передаче сигналов Notch во внутреннем ухе, такие как Hey1, Neurl1, Numb и MamlD1, также затронут у мутантов
Sfswap. Полученные результаты подтверждают, что
Sfswap необходим для собственно развития и формирования паттерна сенсорных структур внутреннего уха и обнаруживает генетическое взаимодействие с Jagged1, которое может обусловливать снижение активности некоторых генов, участвующих в передаче сигналов Notch.
Discussion
Используя базирующийся на лентивирусах мутагенез, мы идентифицировали педполагаемый сплайсинг фактор Sfswap в качестве важного гена для развития внутреннего уха. SfswapTg/Tg мутанты обнаруживают поведение кружения и дисфункцию баланса, связанное с вестибулярными дефектами, а также обнаруживают умеренную (20-25 dB) потерю слуха. Мутанты обнаруживают частичную потерю третьего ряда наружных волосковых клеток и обнаруживают эктопические внутренние волосковые клетки, при этом отсутствуют некоторые pillar клетки. Все органы в вестибулярной системе меньше, чем в контроле, особенно маточка и мешочек, которые менее 50% по сравнению с органами дикого типа. Наши данные согласуются с тем, что Sfswap регулирует аспекты передачи сигналов Jagged1. Во-первых, фенотип улитки SfswapTg/Tg мышей удивительно сходен с наблюдаемым у Jag1гетерозигот по точечной мутации [14],[15].Во-вторых, SfswapTg/Tg мыши обнаруживают дефекты формирования паттерна остоцистов, сходные с таковыми у мутантов Jag1 [32]. Наконец, мы показали, что наш Sfswap мутантный аллель усиливает фенотипические отклонения Jag1 гетерозиготных мышей.
SfswapTg/Tg мутанты обнаруживают пониженные уровни ранних сенсорных маркеров Bmp4, Lfng и Hey1 и значительно меньше сенсорные органы. Jag1 условные мут анты обнаруживают сильно уменьшенные вестибулярные структуры [13]. Jag1 мутанты также обнаруживают изменения в экспрессии сенсорных маркеров, таких как Bmp4, Sox2, Lfng и Hey1 на ст. E10.25 [32]. Вестибулярные структуры также уменьшены у Bmp4 условных или гипоморфных мутантов [34], особенно в горизонтальном боковом канале. Мы подтвердили уменьшение экспрессии Bmp4 у наших мутантов, обусловленные дефектами передачи сигналов Jag1 и приводят к более мелким вестибулярным структурам и уменьшению eminentia cruciata переднего гребня, которое мы наблюдаем у SfswapTg/Tg мутантов.
Уникальная комбинация потери наружных волосковых клеток и образование эктопических внутренних волосковых клеток в улитке SfswapTg/Tg мутантов ранее наблюдалось только у гетерозиготных нокаутов по точковым мутациям Jag1 [14], [15]. Кстати, отсутствует определенное молекулярное объяснение для этого молекулярного фенотипа. Kiernan с колл. [14] предполагали, что Jag1 может выполнять две роли, ранняя из которых у Jag1 помогает специфицировать сенсорные органы, а поздняя помогает предопределять волосковые клетки и поддерживать качественные особенности клеток посредством латерального ингибирования. Мы не обнаружили достоверных изменений в размере просенсорного домена улитки у SfswapTg/Tg мутантов, хотя если и имеются небольшие изменения в просенсорном домене, из трудно заметить, используя маркеры и доступную технику. Эктопческие ряды внутренних волосковых клеток могут наблюдаться у Jag1 гетерозигот и в апикальных регионах у Jag1 условных гомозигот [6], [13]. У мутантов SfswapTg/Tg также наблюдали добавочные ряды внутренних волосковых клеток в апикальном регионе улитки. Поскольку Jag1 экспрессируется на границе большого эпителиального гребня и просенсорном домене, где формируются первые внутренние волосковые клетки, то возможно, что частичная потеря передачи сигналов Jag1-Notch приводит к неподходящему образованию добавочных внутренних волосковых клеток у Jag1 и SfswapTg/Tg мутантов.
Хотя наши данные подтверждают генетическое взаимодействие между Sfswap и Jag1, мы пока не имеем доказательств прямого их взаимодействия. Возможно, что сплайсинг мРНК Jag1 или её стабильность регулируются с помощью Sfswap. Однако мы не обнаружили достоверных отличий в уровнях или в паттерне сплайсинга транскриптов Jag1, и мы не выявили достоверных отличий в экспрессии белка Jag1 в улите с помощью иммунофлуоресценции. Поскольку фенотипические отклонения в улитке мутантов Jag1 могут варьировать в соответствии с типом мутации (точковая мутация в противовес нулевой) и генетическим фоном, на котором поддерживаются мутации [13], [14], [15], [33], становится ясным, что формирование паттерна волосковых клеток в улитке чрезвычайно чувствительно к уровням Jag1. Возможно, что SfswapTg/Tg мыши вызывают небольшие изменения в экспрессии Jag1 ниже границ детекции, которые однако достаточны для воздействия на формирование паттерна улитки. Альтернативно, возможно, что Sfswap регулирует сплайсинг или стабильность модификаторов локуса Jag1. Мы осуществили поиск разных генов пути Notch в отношении возможных изменений экспрессии в мутантной Sfswap улитке. Некоторые гены обнаруживали достоверные изменения при RT-PCR, включая мышиный гомолог Neurl1A, Notch транскрипционный ко-активатор MamlD1 и Numb (Figure 7D). Neurl1A является E3 ubiquitin лигазой, которая, как было установлено, регулирует оборот и эндоцитоз Jag1 in vitro [35]. возможно, что небольшие изменения в активности Neurl1A могут оказаться достаточными, чтобы нарушить формирование паттерна волосковых клеток. Сходным образом, Numb, как было установлено, регулирует передачу сигналов Notch с помощью эндоцитоза и ubiquitinization внутриклеточного домена Notch [36], [37]. Интересно, что Numb широко экспрессируется во время развития улитки у крыс, а избыточная экспрессия может модулировать уровни Atoh1, подтверждая возможную роль в развитии волсковых клеток [38]. Mastermind белки являются транскрипционными ко-активаторами, которые важны для передачи сигналов Notch [39]. Возможно, что снижение MamlD1 может влиять на передачу сигналов Jagged1-Notch путем снижения канонической и не канонической передачи сигналов Notch [40], [41]. Возможно, что одновременное уменьшение двух и более этих белков будет приводить к фенотипам, наблюдаемым у мутантов Sfswap.
Sfswap был открыт у Drosophila в качестве супрессора мутаций white-apricot [16]. White-apricot мутанты имеют инсерцию транспозона, которая нарушает white транскрипт за счет сплайс-включения и это нарушение частично супрессируется мутацией Sfswap путем избирательного исключения транспозона [42], [43], [44]. Помимо этой системы, не было идентифицировано доказательств функционирования in vivo или воздействия на др. мишени Sfswap у Drosophila. У мышей исследования in vitro идентифицировали Fibronectin и CD45 в качестве предполагаемых сплайс-мишеней для Sfswap [21], хотя in vivo мишени пока не подтверждены. У человека локус несиндромальной аутосомно доминантной глухоты DFNA41, содержащий, по крайней мере, 100 генов, включая и SFSWAP [45]. Патологическая мутация в этом регионе пока не идентифицирована, что делает SFSWAP потенциальным кандидатом на будущее секвенирование гена.
Многие гены подвергаются сложному паттерну сплайсинга во внутреннем ухе. Сюда относятся некоторые гены, участвующие в транспорте ионов, включая Atp2b [46], Kcnq4 [47], [48], Cav1.3 [49], BK каналы [50], [51], [52] и P2X2 [53]. Сплайс-изоформы этих каналов, как полагают, участвуют в электрических отличиях в tonotopy, electromotility наружных волосковых клеток и в различиях между сенсорными и несенсорными клетками. Альтернативный сплайсинг, как было установлено, затрагивает целенаправленную доставку белков [49], [54], [55], электрические свойства каналов [56], [57], [58], [59], жизнеспособность клеток [60], [61] и организацию стереоцилий [62] во внутреннем ухе. Имеется также несколько примеров мутаций в различающихся изоформах после альтернативного сплайсинга, которые вызывают разные патологии в ухе. Напр., потеря одной из изоформ PCDH15 приводит к дефектам стереоцилий, тогда как мутации в двух др. изоформах этого гена не оказывают эффекта на волосковые клетки [62]. Сходным образом, мутации в harmonin обычно ассоциированные с Usher Syndrome 1C, тогда как мутации в альтернативном экзоне приводят к несиндромальной глухоте в локусе DFNB18 с нормальным зрением [63]. Несмотря на важность альтернативного сплайсинга во внутреннем ухе, только один фактор сплайсинга идентифицирован, который функционирует во внутреннем ухе [61]. Srrm4 является SR-подобным белком, который недавно был идентифицирован мутантным у Bronx waltzer (bv) мышей. Мутация в этом локусе приводит к дегенерации внутренних волосковых клеток после ст. E17.5 [64]. Анализ генной онтологии экзонов, регулируемых с помощью Srrm4 подтвердил, что этот фактор регулирует сплайсинг генов, участвующих в синаптической трансмиссии и секреторном пути. Теперь мы идентифицировали второй SR-подобный белок, Sfswap, который отличен и вызывает высоко специфичные эффекты в формировании паттерна внутреннего уха. Предоставлены первые доказательства, что предполагаемый сплайсинг-фактор необходим для обеспечения размера сенсорных органов в ухе и для собственно формирования паттерна механосенсорных волосковых клеток в органе Корти.