The SAC at a glance

Достижение и поддержание собственно взаимодействий между хромосомами и микротрубочками веретена является всем и заканчивается корректным расхождением хромосом. Собственно, взаимодействия осуществляются с помощью включения плюс концов микротрубочек в сайты хромосом для прикрепления микротрубочек, известных как кинетохоры. Такие 'end-on' прикрепления делают возможной биориентацию хромосом, состояние, при котором две сестринские хроматиды хромосом прикрепляются к противоположным полюсам веретена, делая возможным их расхождение к противоположным сторонам во время клеточного деления. Неправильное прикрепление корректируется с помощью аппарата исправления ошибок, контролируемого с помощью Aurora B kinase. Aurora B фосфорилирует белки связывания микротрубочек на наружной кинетохоре, запуская изменения в динамике микротрубочек и ослабление сродства кинетохор к микротрубочкам [1]. Т.о., во время митозов взаимодействия кинетохора-микротрубочки часто создаются и разрушаются вплоть до конца, когда все хромосомы ориентированы к полюсам и прикрепления стабилизированы. На всём протяжении отсутствие стабильных прикреплений требует коммуникаций с аппаратом клеточного цикла, которому иначе не может быть дозволена инициация расхождения хромосом (анафаза) и клеточное деление. Мессенджером может быть SAC (известный также как митотический чекпойнт) (Figure 1).

Figure 1. The spindle assembly checkpoint (SAC) response. Unattached kinetochores activate the SAC response (bells), which culminates in assembly of the APC/C-inhibitory mitotic checkpoint complex (MCC). Total MCC levels (indicated by background colors) are determined by the rate of MCC production at kinetochores, which is initially high (red bells) but declines as kinetochores connect with increasing numbers of microtubules (yellow bells), until finally production is halted altogether (green bells). The SAC must nevertheless maintain MCC levels above an undefined threshold to ensure sufficient APC/C inhibition (STOP signals) and prevent anaphase onset and mitotic exit. Only when all kinetochores have met the conditions for correct chromosome segregation is the block on APC/C released (GO signal), allowing cells to proceed to anaphase.

Переход к анафазе запускается с помощью E3 убиквитин лигазы APC/C, которая запускает ингибиторы выходя из митоза (CYCLIN B) и расхождения сестринских хромосом (SECURIN) для деградации протеосом [2]. SAC осуществляет ограничение (one-track mind) ингибирования с помощью APC/C до тех пор, пока существуют неправильно прикрепленные хромосомы. Это указывает на то, что наиболее прямой путь возможен: это сборка непосредственного и диффундирующего ингибитора APC/C на кинетохорах, которые не связаны с микротрубочками веретена. Этот ингибитор назван mitotic checkpoint complex (MCC) (Figure 1).

Исходящий из кинетохоров SAC сигнал генерируется в суперкомплексе, названном KMN сеть, формируемом с помощью трех разных субкомплексов: KNL1-C, MIS12-C и NDC80-C. Эта сеть является исключительным интерфейсом кинетохор для контакта с микротрубочками и главной мишенью аппарата для исправления ошибок (Box 1). Т.о., место прикрепления на кинетохорах интимно соединено с аппаратом (machinery) SAC . Соединение это дорога с двухсторонним движением: многие компоненты SAC могут менять сродство к микротрубочкам сети KMN и улучшать исправление ошибок и активность SAC скоординирована в пространстве и во времени (Box 2).

Box 1. The KMN network: Velcro for microtubules

A fully attached human kinetochore is bound by approximately 20 microtubules. In the recently proposed 'lawn' model, hundreds of microtubule-binding protein complexes on a human kinetochore cooperate to maintain attachment [96]. The predominant microtubule-binding complex is known as the KMN network7 and 97. It is assembled from three subcomplexes: KNL1-C (KNL1 and Zwint-1), MIS12-C (NNF1, MIS12, DSN1, and NSL1/MIS14), and NDC80-C (HEC1, NUF2, SPC24, and SPC25) (see Figure 2 in main text). MIS12-C connects the inner kinetochore with KNL1-C and NDC80-C 7 and 97, which extend to the cytosol to directly contact microtubules. NDC80-C interacts with microtubule filaments through binding the interface between two tubulin subunits [98]. For this, it utilizes two globular CH domains present near the N termini of HEC1 and NUF2.

An important role is reserved for an 80-amino acid N-terminal sequence of HEC1 known as the tail. It is suggested to promote end-on attachments by enhancing NDC80-C oligomerization or by directly contacting the microtubule lattice [97]. In addition, it is the key target of the error-correction machinery. Through multisite phosphorylation of the HEC1 tail, Aurora B is proposed to create electrostatic repulsion between tail and microtubule and hence lower the microtubule-binding affinity of kinetochores (see Figure 2 in main text) 1 and 7. In addition, a long coiled-coil region that follows the CH domain of Hec1 is disrupted by a loop that is involved in the recruitment of multiple factors that help in the formation of stable kinetochore-microtubule interactions, including the SKA complex in human cells and the Dam1 complex in yeast [99].

The third component, KNL1-C, also exhibits affinity for microtubules, via a basic patch near the N terminus of KNL1, but the importance of this for the stability of kinetochore-microtubule connections is less well defined 42 and 89. KNL1 does play a critical role as a scaffold for the assembly of error-correction and SAC signaling modules (see main text for details). Finally, via a C-terminal coiled-coil region, KNL1 interacts with Zwint-1, thereby recruiting the RZZ complex and Spindly - and thus dynein - to kinetochores 39, 43 and 82.

Box 2. Feedback regulation of error correction by the SAC

The error-correction and SAC machineries are coordinately activated on unattached kinetochores. Unsurprisingly, therefore, the two pathways feed back on each other. As outlined in the main text, Aurora B potentiates MPS1 activation in prophase, ensuring maximal SAC function at the onset of mitosis. Conversely, various SAC proteins modulate error correction by regulating either Aurora B or its targets. BUB1 ensures inner-centromere localization of Aurora B by phosphorylating histone H2A in centromeric nucleosomes to indirectly create a docking site for the Aurora B-associated protein Borealin [100]. BUBR1 harbors a KARD motif that constitutes a docking site for the phosphatase PP2A-B56 (see Figure 2 in main text) 101 and 102. BUBR1-associated PP2A-B56 helps to stabilize microtubule attachments by (partially) dephosphorylating Aurora B substrates within the KMN network 98 and 101. MPS1 promotes both the activity and the localization of Aurora B 103 and 104 and impacts on error correction indirectly via the localization of BUB1 and BUBR1 [52]. These examples illustrate the complexity of signaling feedback at kinetochores: MPS1 and BUB1 promote Aurora B actions at kinetochores while simultaneously - by localizing BUBR1/PP2A-B56 - counteracting those actions. It seems likely that such networks have evolved to install features like robustness, switchability, and/or multilevel regulation on the system. Detailed spatiotemporal analysis of signaling events coupled with mathematical modeling may be required to capture the intricacies of this network and predict its behavior under various conditions. Such an approach may help to incorporate added levels of complexity such as the impact of CDK1 and PLK1 on some of these signaling connections.

Сборка MCC контролируется киназой MPS1, которая ассоциирует с субкомплексом NDC80-C сети KMN (Figure 2) 3 and 4. Здесь он контролирует рекрутирование взаимосвязанных белков сети SAC, включая компоненты, первоначально идентифицированные в почкующихся дрожжах при генетическим скрининге: BUB1, BUB3, MAD1, MAD2 и Mad3/BUBR1 (используется номенклатура белков человека). MAD2, BUB3 и BUBR1 составляют финальный эффекторный путь (MCC) и его сборка критически зависит от BUB1 и MAD1, вместе с некоторыми дополнительными добавочными белками 5 and 6. С момента открытия этого пути более 20 лет тому назад, эта область быстро прогрессирует 5-9.

Figure 2. Spindle assembly checkpoint (SAC) signaling at the KMN network. (A) The outer kinetochore is decorated with KMN network complexes, which cooperate to establish microtubule interactions. (B) A single KMN network complex comprises the three subcomplexes MIS12-C, NDC80-C, and KNL1-C (lower part of panel). Individual components of the NDC80 and KNL1 complexes are indicated in the KMN network in the upper part of the panel. KNL1 contains an unstructured region (depicted as the squiggly middle region) that harbors the repeat motifs that bind BUB3-BUB1 complexes. The Zwint-1 component of KNL1-C recruits the Rod-Zw10-Zwilch (RZZ) complex, which recruits the dynein adaptor Spindly. (C) Assembly of SAC protein complexes onto a single KMN network [depicted as purple outlines of structures in (B)]. This assembly is aided by Aurora B kinase activity (region of activity indicated by red ellipse), which regulates MPS1 binding to NDC80-C and counteracts PP1 binding to KNL1. Aurora B additionally phosphorylates the HEC1 tail to decrease the microtubule-binding affinity of NDC80-C (Aurora B-dependent phosphosites mentioned in the text are represented by red dots). MPS1 phosphorylates, among others, KNL1 and BUB1 (phosphosites represented by yellow dots) to recruit the BUBs (BUB1/BUB3/BUBR1) and MAD1-MAD2, respectively. O-MAD2 is then converted to C-MAD2, which binds to CDC20 to expose a binding site for BUBR1, eventually resulting in mitotic checkpoint complex (MCC) production and APC/C inhibition. BUBR1 in turn recruits the phosphatase PP2A-B56, activity of which promotes stability of kinetochore-microtubule interactions by dephosphorylating Aurora B targets in the KMN network.

Inhibiting anaphase: a matter of MCC dynamics

Сборка MCC задерживает начало анафазы путем предупреждения CDC20 от активации APC/C (Figure 2). Недавние доказательства подтвердили, что MCC постоянно разбирается 10-13, возможно тем самым делая возможной быструю активацию APC/C, когда последняя хромосома получит соотв. прикрепление. Способность поддерживать задержку митоза, скорее всего, зависит от более высокой скорости сборки MCC по сравнению со скоростью разборки.

Для собственно функционирования SAC необходима стабильная ассоциация между MCC и APC/C [14]. Несмотря на сохраняющуюся неопределенность относительно точной роли каждой из субъединиц MCC ясно, что MAD2 и BUBR1 обязательны для ингибирования APC/C. BUBR1 и его ортологи, обладающие KEN боксом почти на их N концах, мотивом, который обычно распознается с помощью коактиваторов APC/C, таким как degron [2]. KEN бокс в BUBR1, однако, конкурирует с др. субстратами за связывание CDC20 и как таковой действует как pseudosubstrate ингибитор 15 and 16. Структурные исследования APC/C MCC показали, что MCC, скорее всего, мешает распознаванию субстрата с помощью CDC20 и вытесняет CDC20 прочь с субъединицы APC10, предупреждая образование сайта распознавания для убиквитинирования 17 and 18. MAD2 действует, чтобы стабилизировать MCC и правильно расположить BUBR1 KEN бокс [17]. Далее он конкурирует с APC/C за соединение с KILR мотивом на CDC20, который важен для активации APC/C 12 and 19. Такая прямая роль для MAD2 в ингибировании APC/C подкрепляется элегантным исследованием, показавшим, что искусственно слитый белок Mad2-Cdc20 способен арестовать клеточный цикл почкующихся дрожжей способом, независимым от какого-либо SAC белка, включая Mad3/BUBR1 [20].

Эксперименты по условному истощению белка в клетках человека показали, что BUBR1 важен для сохранения ареста митоза, накладываемого не прикрепленными кинетохорами, подтверждая тем самым прямую роль BUBR1 в ингибировании APC/C [21]. Неожиданно по контрасту с тем, что было предсказано на основании экспериментов, описанных выше, MAD2 оказался необязательным для поддержания SAC. Вместо этого MAD2, как полагают, способен стабилизировать ассоциацию между CDC20 и BUBR1, экспозируя сайт связывания BUBR1 на CDC20, после этого он становится необязательным [21]. Это согласуется с наблюдениями, что MAD2 нестабильно ассоциирует с MCC in vitro и что частичное протеолитическое удаление MAD2 с MCC-связанного APC/C не высвобождает ингибирование 21 and 22. Кроме того, MCC комплексы, изолированные из клеток, содержат substoichiometric количества MAD2 23 and 24.

Как примирить эти находки? Дипломатический ответ в том, что как MAD2, так и BUBR1 являются важными компонентами MCC во время нормальной активности SAC. Важно подчеркнуть, что упомянутое выше исследование на клетках человека показало необязательность MAD2 для поддержания SAC, а белок p31comet был истощен [21]. Белок p31comet участвует в разборке MCC, возможно путем экстрагирования MAD2 из комплекса [24] и помощи обороту CDC20 [11]. Его истощение позволило авт. четко выяснить роль MAD2 и BUBR1 в функции MCC. Очевидно, что роль MAD2's заключается в стабилизировании MCC, а ингибирование CDC20's KILR мотива становится менее значимым благодаря гиперстабильности MCC из-за истощения p31comet. Напротив, в экспериментах с почкующимися дрожжами, слияние Mad2 с Cdc20 может создавать гипер-ингибированный Cdc20, которые более не нужен для вклада Mad3's , чтобы ограничивать его далее.

Assembling the MCC at kinetochores: localized MAD2 activation

Как неприкрепленная кинетохора вызывает сборку MCC? Большая часть ответа касается способности MAD2 различать активную и неактивную конформацию, обозначаемые как closed (C-MAD2) и open (O-MAD2), соотв. 25 and 26. Превращения MAD2 спонтанные, но медленные и поэтому нуждаются в ускорении [25]. Это обеспечивается с помощью MAD1, белка, который связан с переходом MAD2 на неприкрепленную кинетохору. Две молекулы MAD1 образуют стабильный комплекс с двумя молекулами C-MAD2 в течение всего клеточного цикла [27] и этот тетрамер рекрутируется специфически на кинетохоры, свободные от прикрепления микротрубочек (Figure 2). В т.наз. модели матрицы предполагается, что благодаря их способности гомодимеризоваться, MAD1-связанные C-MAD2 молекулы рекрутируют растворимые O-MAD2 и ускоряют их переход к закрытой конформации. Эти вновь сформированные C-MAD2 молекулы впоследствии высвобождаются, чтобы взаимодействовать с CDC20 и инициировать сборку MCC [28]. Интересно, что в то время как скорость реакции рекрутирования MAD2 на кинетохоры быстрая, время реакции ингибирования APC/C , по-видимому, медленное (Box 3) 29-31. Понимание этого расхождения, скорее всего, предоставит ценную информацию о кинетике MAD2-зависимой сборки MCC. Конечно, недавнее исследование показало, что роль MAD1 не просто в локализации и активации растворимых молекул MAD2 32-34, но дополнительные функции ещё предстоит установить.

Box 3. Not so fast: the SAC response paradox

To ensure that APC/C will not initiate ubiquitination of its metaphase substrates directly at mitosis onset, the SAC response at kinetochores needs to be switched on rapidly. This is achieved at least in part by kick-starting MPS1-Aurora B feedback, which achieves rapid and localized activation of the SAC responses 63, 64 and 104. Similar feedback-activation mechanisms may operate during mitosis: controlled detachment of microtubules from one of the sisters of a bioriented chromosome caused detectable accumulation of MAD2 at that kinetochore within 30 s [30]. Paradoxically, however, the time to inhibition of APC/C was significantly longer (?5 min) 30 and 31. The lag between kinetochore response and APC/C inhibition may not be problematic in prometaphase, when at any given moment multiple kinetochores are signaling. It does, however, create problems if, at metaphase, a kinetochore detaches while degradation of APC/C substrates has already advanced significantly [30]. A similar risk can be envisioned in the earliest phases of mitosis, when delayed inhibition of APC/C may lead to less robust protection against premature sister separation and mitotic exit during the remainder of mitosis. A solution to this conundrum was suggested by recent findings that an interphasic pool of MCCs, assembled at nuclear pores, inhibits APC/C sufficiently until the kinetochore-derived MCC pool takes over [105]. Premitotic MCC assembly adheres, at least to a large extent, to the same rules as assembly of kinetochore-generated MCC. It depends on MPS1 and MAD1/2, which are localized to nuclear pores by virtue of interacting with the large scaffold Tpr 24, 106, 107 and 108. Interaction with Tpr additionally protects the SAC proteins from proteasomal degradation [109]. Interestingly, some factors important for MCC function (BUBR1, BUB3, and O-MAD2) are not found at the nuclear envelope, while p31comet, an inhibitor of MCC, is found there [24]. Examining interphase MCC assembly may thus provide answe rs to important questions such as where does MCC assembly occur and how many MCCs are needed for sufficient APC/C inhibition?

Как MAD1-C-MAD2 тетрамер рекрутируется на кинетохору только теперь оказывается в центре внимания. У почкующихся дрожжей Mad1 непосредственно соединяется с Bub1 зависимым от фосфорилирования Bub1 способом с помощью Mps1 [35] (Figure 2). Активность киназы Bub1 не существенна для её связывания и взаимодействия Mad1-Bub1, она обеспечивается с помощью C-терминального домена Mad1 и плохо определенного региона между мотивом GLEBS в Bub1 и её киназным доменом [35]. Хотя потребность в Bub1 локализации Mad1, по-видимому, законсервирована, детали отличаются у разных видов. У Caenorhabditis elegans, напр., BUB-1 соединяется с MAD-1 посредством своего киназного домена скорее, чем предшествующей последовательности [36] и это взаимодействие не требует MPS1, т.к. C. elegans лишена MPS1-подобного гена в своем геноме [6]. В клетках человека, BUB1 четко воздействует на связывание MAD1 с кинетохорой, но это не прямолинейное соединение, которое наблюдается у почкующихся дрожжей. Выраженная деплеция BUB1 не может предупредить существенную загрузку MAD1 на кинетохоры 37 and 38. Участие др. игроков предполагается, особенно тримерного комплекса, известного как Rod-Zw10-Zwilch (RZZ) [39] , и NDC80-C 40 and 41. На сегодня нет доказательств, что любой из этих игроков стабильно взаимодействует с MAD1 в клетках человека, предполагается, что они или кооперируют для доставки MAD1 или что рецептор MAD1 в клетках человека остается не идентифицированным.

Recruiting the MCC assembly factors: the KNL1 connection

Если SAC чувствителен к состоянию кинетохор, связанных с микротрубочками, то логично предположить, что белковые комплексы, которые связывают микротрубочки являются теми же самыми, как и те, что рекрутируют факторы, необходимые для сборки и регуляции MCC. Растут доказательства, что это и в самом деле так. Наиболее интригующий пример это каркас KNL1 (также известен как CASC5 или Blinkin) [42]. KNL1, как полагают, это крупный неструктуированный белок за исключением C-терминального тандема из RWD доменов, участвующих в его доставке на кинетохоры, и coiled-coil региона, обеспечивающего взаимодействие с Zwint-1, который соединен с RZZ на наружной кинетохоре (Figure 2) 42-44. Неструктуированная N-терминальная половина KNL1 декорирована рядом крупных повторяющихся мотивов (обозначаемых как MELT мотивы), которые обнаруживают значительное эволюционное расхождение. Хотя большинство гомологов KNL1 у эукариот содержит множественные повторы, их последовательности и количество могут сильно варьировать [6]. Стержень повторов у большинства видом представлен (вариантами) MELT-подобной последовательности. Этот стержень фланкирован мотивами, которые сильно отличаются у разных видов, но совместимы с повторами у каждого из видов [6].

Мотивы MELT являются ступицами для передачи сигналов SAC 45-50. Будучи фосфорилированными с помощью MPS1, они образуют места расположения фосфорилированных белков для BUB3 (Figure 2) [51]. BUB3 вносятся вместе с BUB1 или BUBR1 [52] и тем самым связывают KNL1 с этими двумя BUB паралогами. Этот простой путь рекрутирования объясняет связывание BUB1 с кинетохорами, но механизм рекрутирования BUBR1 более сложен потому, что BUBR1 требует BUB1 для правильной локализации, тогда как реципрокной зависимости не существует 37, 53 and 54. Вообще-то BuGZ, недавно идентифицированный белок цинковые пальчики, взаимодействует с BUB3 посредством BUB1/R1-подобного GLEBS мотива, т.е. участвует в этом, но нужны дальнейшие исследования для прояснения его рол в загрузке BUB белков 55 and 56.

Помимо MELT-подобных мотивов KNL1 обладает парой мотивов, взаимодействующих in vitro c BUB1 b BUBR1 57 and 58. Эти 'KI' мотивы располагаются вблизи наиболее N-терминального MELT и обнаруживаются только в KNL1 гомологах у некоторых подклассов позвоночных 6 and 43. KI мотивы взаимодействуют с выпуклой поверхностью TPR доменов в BUB1 (KI-1) и BUBR1 (KI-2) 57 and 58, но эти взаимодействия не обязательны для правильного расхождения хромосом 48, 50 and 58. Роль KI мотивов не очевидна, однако находится в контексте с субоптимальной функцией KNL1. N-терминальный фрагмент KNL1, соответствующий первому MELT мотиву и KI мотивам, рекрутирует низкие уровни BUB1 и поддерживает передачу сигналов SAC KI-зависимым способом 48 and 49. Более того, помещение KI мотивов в др. в лишенные KI MELT повторы усиливает их способность рекрутировать BUB1 и активировать SAC [48]. Интересно, что в то время как N-терминальный MELT модуль достаточен для передачи сигналов SAC в клетках, эффективность биориентации хромосом пропорциональна количеству MELT мотивов и тем самым количеству BUB1, которые способен рекрутировать KNL1 ( Box 2) 48 and 50. Причина такого различия неизвестна, но вообще-то необходимость в коррекции ошибок снижается по мере того, как всё больше кинетохор присоединяют всё большие микротрубочек, тогда как SAC необходим максимальной силы до тех пор, пока не будет достигнут отбой. Было бы интересно исследовать, затрагиваются ли коррекция ошибок и SAC, когда слишком много BUB1 располагается на кинетохорах; напр., при добавлении дополнительных MELT повторов к белку KNL1.

Recruiting the engine that moves the SAC: MPS1 and the NDC80 complex

Как указывалось выше, MPS1 является основным регулятором SAC. С помощью фосфорилирования MELTs в KNL1, он гарантирует BUB1 и, с помощью proxy, BUBR1 и MAD1 присоединение к кинетохоре (Figure 2). Влияние MPS1 на SAC даже ещё сильнее, поскольку он также участвует в связывании с кинетохорой RZZ и CDC20, в конформационной активации MAD2 и в поддержании стабильности MCC [9].

MPS1 накапливается на кинетохорах в начале митозов и постепенно активируется с помощью аутофосфорилирования 59 and 60. После этой инициальной активации MPS1 обнаруживает быструю кинетику с периодом полу-жизни на кинетохорах в пределах секунд 61 and 62. Ассоциация MPS1 с кинетохорой зависит от комплекса NDC80 3 and 4 и регулируется с помощью Aurora B (Figure 2) 4, 63 and 64. Хотя активность Aurora B не абсолютно необходима для локализации MPS1 и активации SAC, она критически воздействует на эффективность соединения MPS1 с кинетохорой в ранних митозах и на степень, с которой SAC устанавливается первоначально [63]. Очевидным кандидатом на роль мишени для регуляции MPS1 с помощью Aurora B является хвост HEC1, фосфорилирование которого критически участвует в дестабилизации взаимодействий кинетохор с микротрубочками 1 and 7. Многие исследования, однако сообщают об отсутствии участия хвостового региона HEC1 как в локализации MPS1, так и активации SAC 4, 65- 67, хотя это недавно было подвергнуто сомнению [68]. Скорее всего, связывание MPS1 с кинетохорами использует связывающий микротрубочки calponin homology (CH) домен в HEC1 [4]. Как Aurora B осуществляет это? Локализация MPS1 обеспечивается с помощью N-терминального двухсоставного модуля, состоящего из TPR домена, которому предшествует в 62 аминокислоты N-terminal extension (NTE). NTE является преимущественным сигналом локализации, но его способность локализовать ингибирована, когда Aurora B неактивна. Делеция TPR домена вызывает локализацию MPS1, которая нечувствительна к инактивации Aurora B, подтверждая, что Aurora B повышает ингибирующие ограничения, накладываемые на NTE доменом TPR [4]. Ингибирует ли TPR непосредственно NTE и как Aurora B делает возможной функцию NTE, а также каков вклад др. киназ, подобных mitogen-activated protein kinase (MAPK) или checkpoint kinase 2 (CHK2) в локализацию MPS1, остается неясным 69 and 70. Поскольку искусственное прикрепление MPS1 обходит необходимость в Aurora B в регуляции SAC 63, 71 and 72, то информация о механизме, с помощью которого Aurora B регулирует локализацию MPS1 является важной, т.к. он д. описывать, как основная киназа по коррекции ошибок взаимодействует с основным регулятором SAC.

Digital or analog: the graded response of the kinetochore SAC signal

Эксперименты по удалению с помощью лазера показали, что одиночная не прикрепленная кинетохора ответственна за задержку анафазы на несколько часов [73]. Это позволило предположить, что SAC digital, реакцией всё-или-ничего. Если это верно, то или одиночная неприкрепленная кинетохора буде продуцировать достаточно MCC, чтобы ингибировать все относящиеся к APC/C комплексы или происходящий от кинетохоры сигнал амплифицируется до насыщающих уровней в цитоплазме. Последнее, по-видимому, вряд ли возможно, учитывая недавнюю информацию, что количество формируемого MCC и сила, с которой ингибируется активность клеточного APC/C коррелируют с числом не прикрепленных кинетохор 30 and 74. Кроме того, очевидно, что количество MAD2, рекрутируемого на каждую кинетохору, зависит от того сколь много микротрубочек соединено с кинетохорой [74]. Это ставит два вопроса: сколько MCC необходимо для достижения достаточного ингибирования APC/C и сколь много микротрубочек д. связываться с кинетохорой, прежде чем продукция понизится ниже порога?

Элегантное количественное исследование на Schizosaccharomyces pombe открыло др. неожиданную сторону SAC: оно,по-видимому, довольно хрупкое, исходя из тонкой регуляции относительных количеств Cdc20 гомолога Slp1 в отношении компонентов MCC [75]. В клетках человека, также относительно небольшое снижение MAD2 существенно осложняет реакцию SAC 74, 76 and 77. Неясно, почему такая хрупкость допускается, принимая во внимание тяжелые последствия анеуплоидизации как в одноклеточных, таки многоклеточных организмах [78]. Вообще-то это связано с с выгодой, что такая система обеспечивается в отношении эволюционной адаптации и/или способности быстро запускать активность APC/C, как только все хромосомы оказываются ориентированы к разным полуюсам.

Stopping the assembly line: how microtubules block kinetochore-dependent MCC production

Закрепленные кинетохоры лишены MAD1 и MAD2 и обнаруживают значительно меньше уровни MPS1, нем не закрепленные. Удаление этих белков является критическим для погашения сигналов SAC, т.к. искусственное поддержание одного из них на прикрепленных кинетохорах вызывает существенную активацию SAC 33, 62 and 79. Более того, химическая повторная доставка MAD1 на биориентированные кинетохоры после активации APC/C в метафазе достаточна, чтобы реактивировать передачу сигналов SAC 34 and 80. Важный вклад в удаление оси MPS1-MAD1-MAD2 вносится микротубулярным моторным комплексом dynein, который переносит SAC белки, включая MAD1 и MAD2 по направлению к полюсам на микротрубочках, отлавливаемых кинетохорами (Figure 3) [81]. Этот процесс известен как 'stripping', не может однако, быть преимущественным способом блокирования продукции MCC в местах прикрепления микротрубочек. Истощение кинетохорного адаптора dynein Spindly не предупреждает удаление SAC белков с мест прикрепления или замалчивание SAC 82 и 83, и кинетохорный dynein не столь широко законсервирован у видов эукариот [6]. Др., более древние механизмы замалчивания, следовательно, скорее всего, существуют. Необходимо отметить, что механизм замалчивания, участвующий в инактивации киназной активности BUBR1 на заловленных микротрубочках, как полагают, осуществляется с помощью kinesin CENP-E 84 and 85. Поскольку CENP-E не существенен для SAC человека и не законсервирован широко ([86] и наши не опубликованные данные), и поскольку в действительности все эукариотические гомологи BUBR1 лишены киназной активности [87], то мы не рассматриваем этот механизм как претендующий на роль гашения кинетохорного SAC сигнала.

Figure 3. Spindle assembly checkpoint (SAC) silencing at kinetochores. Many SAC components are completely or partially displaced from the kinetochore when microtubules bind to the KMN network. Removal is accomplished by dynein-dependent 'stripping' of Rod-Zw10-Zwilch (RZZ) complex-MAD1 and Spindly and by dephosphorylation of key phosphosites by PP1 (and possibly PP2A-B56) phosphatase. Microtubule binding to NDC80-C and to a basic patch near the N terminus of KNL1 may also more directly contribute to SAC silencing.

Интимная связь между сетью KMN аппаратом SAC составляет основу для понимания того, как продукция MCCs локально подавляется, когда кинетохоры захватывают микротрубочки. Зависимость связывания с кинетохорами MPS1 на том же самом белковом домене в HEC1, который также контактирует с микротрубочками позволят высказать предположение о взаимном исключении между MPS1 и микротрубочками в соединении с NDC80-C. In vitro реконструкция этих взаимодействий д. позволить протестировать эту гипотезу непосредственно.

N-терминальный регион в KNL1 обладает базовым участком, который вносит вклад во взаимодействия с микротрубочками [88] (Box 1), но который может также непосредственно участвовать в замалчивании SAC (Figure 3). Мутации в этом участке у C. elegans не предупреждают образование несущих нагрузку прикреплений, но задерживают замалчивание SAC [89]. Механистическое понимание этого отсутствует, но интересно отметить, что сайт расположения для PP1 фосфатазы находится по соседству с базовым участком ( Figure 3) [42]. Поскольку предупреждение связывания PP1 с KNL1 в клетках человека дестабилизирует соединение микротрубочек с кинетохорами [90], оно задерживает замалчивание SAC у S. pombe и Saccharomyces cerevisiae 91-94. Гомолог PP1 почкующихся дрожжей Glc7 дефосфорилирует MELTs в Spc105/KNL1, тем самым предоставляется механистическая основа для замалчивания SAC [47]. Хотя мутантный человеческий KNL1, дефицитный по связыванию PP1 повышает локализацию BUB1 и BUBR1 [50], остается формально продемонстрировать, что связанная с помощью KNL1 фосфатаза PP1 важна для замалчивания SAC в клетках человека. Необходимо подтверждение способов, с помощью которых роль кинетохорной PP1 в стабилизации прикрепления микротрубочек может быть подтверждена экспериментально вне связи с её ролью в замалчивание SAC. Несмотря на это наблюдается, что взаимодействие между базовым участком KNL1 и прикрепляющимися микротрубочками усиливает связывание, активацию и/или близость к субстрату для PP1. Напротив связывание микротрубочек с базовым участком может более непосредственно влиять на аппарат SAC. Напр., интригующая возможность, не доказуемая какими-либо опубликованными наблюдениями, заключается в том, что сила, оказываемая на KNL1 может менять сродство повторяющихся мотивов к белкам BUB.

Concluding remarks

As recently reviewed in [8], SAC research has just entered its third decade. The first two provided an amazing number of insights, from identification of all components of the SAC machinery to mechanistic insights into their localization, activation, and mode of action. However, to paraphrase Albert Einstein, 'the more we learn, the more we realize what we don't yet know'. Various intriguing questions have been scattered throughout this review, but some additional ones are worth mentioning. Does all APC/C need to be inhibited or is it sufficient to inhibit specific pools, such as the one localized to chromosomes [95]? How are the many localized feedback mechanisms regulated in space and time and how is the network wired to achieve speed and robustness? Is there a role for biorientation in SAC silencing? How is the MCC disassembled and is that disassembly actively coupled to attachment/biorientation of the final chromosome? Answers to these and other questions will require systematic mapping of relevant modifications, biochemical reconstitution of complexes and their regulation, sophisticated single-cell analyses, and biosensors of, for instance, MCC assembly and kinase activities. Judging by the speed of new discoveries over the past years, the SAC is bound to reveal some of its remaining mysteries soon.

Joined at the hip: kinetochores, microtubules, and spindle assembly checkpoint signaling Carlos Sacristan, Geert J.P.L. Kops Trends in Cell Biol. Volume 25, Issue 1, January 2015, Pages 21–28

Joined at the hip: kinetochores, microtubules, and spindle assembly checkpoint signaling
Carlos Sacristan, Geert J.P.L. Kops
Trends in Cell Biol. Volume 25, Issue 1, January 2015, Pages 21–28