Передача сигналов Receptor tyrosine kinase (RTK) является ключевым механизмом, с помощью которого внеклеточные стимулы контролируют развитие почек и многих др. органов, но специфическая in vivo функция внутриклеточного каскада, активирующего нижестоящие RTKs, остается плохо охарактеризованной. Почки развиваются в результате классических взаимных индуктивных тканевых взаимодействий между продуцирующей нефроны метанефрической мезенхимой (MM), и ветвящимся эпителием мочеточникового зачатка (UB), структуры, дающей позднее систему собирающих канальцев функционального органа [1]. Почечная дифференцировка начинается с формирования UB, который проникает в окружающую MM, и в последствии начинается его ветвление. Морфогенез UB в основном инструктируется с помощью MM, которая секретирует ростовые факторы, такие как glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) и члены семейства fibroblast growth factor (FGF). Их RTK рецепторы, а именно RET и FGF receptor 2, экспрессируются в эпителиальных клетках UB, регулируя развитие UB [2].

Базируясь на генетических и in vitro экспериментах, передача сигналов GDNF/RET необходима для раннего морфогенеза UB [3]-[5], тогда как потребность в передаче сигналов FGFR, по-видимому, возникает позднее во время нормального развития почек [6], или в ситуациях, когда передача сигналов RET отсутствует [7]. Хотя молекулярные основы ветвления UB активно исследовали, но относительно мало известно о клеточных каскадах и реакциях, регулирующих образование новых веточек in vivo. Соединение GDNF и FGF со своими рецепторами активирует несколько внутриклеточных путей, среди которых phosphoinositide 3-kinase (PI3K) /AKT, mitogen-activated protein kinase (MAPK) и phospholipase Cγ (PLCγ) функционируют во время дифференцировки почек [8]. Ингибирование пути PI3K в органных культурах почек подтверждает, что формирование первичных UB зависит от хемотактической подвижности клеток, вызываемой этим путем [9], тогда как сходные эксперименты с MEK ингибиторами подтвердили, что путь MAPK также необходим для образования UB [10], [11]. Попытки генетически подтвердить эти функции в основном не удались, хотя делеция протеин тирозиновой фосфатазы Pntpn11, которая позитивно регулирует MAPK, JAK/Stat и PI3K/Akt, подтверждает, что эти внутриклеточные каскады также осуществляют жизненно важные функции во время развития in vivo [12], [13]. Мутации в специфических RET сайтах связывания (docking), как известно, активируют определенные внутриклеточные пути, указывая, что индукция PLCγ посредством Y1015, также, как и одновременная активация путей PI3K и MAPK посредством Y1062 участвуют в дифференцировке почек [14]-[17].

Активная пролиферация клеток происходит на кончиках UB [18], которые являются основными местами генерации новых ответвлений, формируемых путем бифуркаций существующих зачатков [11]. Помимо пролиферации, которая, по-видимому, использует временное отслоение клеток от монослоя [19], активные движения клеток, необходимые для постоянного оборота клеточных адгезий, участвуют в морфогенезе UB [20], [21]. MAPK путь, хорошо известный регулятор клеточного цикла, функционирует посредством каскада RAS-RAF-MEK-ERK, но специфические потребности в нём во время разных фаз клеточного цикла высоко специфичны для типов клеток. Активация RAF киназ приводит скорее к линейной сигнальной трансдукции после фосфорилирования протеин киназ двойной специфичности MEK1 и -2, которые в свою очередь фосфорилируют ERK1 и -2 (пока их единственные известные субстраты) [22]. ERKs обладают широким разнообразием ядерных и цитозольных мишеней, включая cyclin D1 и фокальной адгезии (FA) каркасный белок paxillin, который также ассоциирует с MEK [23], [24]. Любое нарушение комплекса ERK/paxillin отсутствие ERK индуцированного фосфорилирования по serine 83 устраняет разрастание клеток и морфогенез ветвления [24], [25]. Интересно, что paxillin и др. FA белок, vinculin, также обнаружен в слипчивых соединениях adherens junctions (AJ), де они ассоциируют с β-catenin, чтобы модулировать адгезию в местах межклеточных контактов [26], [27]. Vinculin стабилизирует E-cadherin в AJs, где он усиливает механосенсорную реакцию E-cadherin [28], [29].

Здесь мы изучали in vivo функцию пути MAPK вовремя ветвлении в почках путем делеции Mek1 [30] особенно в эпителии UB на Mek2-нулевом фоне [31]. Т.к. ранее было подтверждено с помощью химического ингибирования MAPK в культуре целых почек [10], [11], наши результаты показали бесповоротно, что потеря активности MAPK специфически в UB предупреждает образование новых веточек, хотя не меняет элонгации зачатка. Путь MAPK, по-видимому, вносит вклад в ветвление UB, выполняя двойную функцию; он регулирует переход фаз G1/Sв ходе клеточного цикла и адгезию эпителиальных клеток посредством фосфорилирования paxillin затрагивающего FA и динамику AJ.

Discussion

С помощью генетических исследований, сконцентрированных на функциях пути MAPK в развитии почек, мы показали, что лишь одного аллеля Mek1 или Mek2 достаточно для поддержания нормально ветвления в почках. Одновременная делеция обоих генов устраняет образование новых веточек и сложного 3D паттерна и показывает, что этот путь является необходимым медиатором передачи сигналов RTK. Функциональная потребность в MEKs при морфогенезе UB сходна с той, что описана в коже [32], но отлична от той, что наблюдается в плаценте, где двойная гетерозиготность приводит к эмбриональной летальности [48]. Сходным образом, Erk1; Erk2 доза генов и уровни белков являются критическими для жизнеспособности и нормальной пролиферации, как было установлено, с помощью двойных гетерозигот, из которых погибало во время беременности [49]. Такие отличия в функциональных потребностях активности MAPK подразумевают тканеспецифические роли для компонентов пути и указывают на их специфический вклад в развитие и гомеостаз.

Поскольку RET является важной RTK, регулирующей ветвление в почках, то точная её функция (напр., в пролиферации, миграции, ремоделировании внеклеточного матрикса, изменения формы клеток и адгезивных свойств) и её точный вклад остаются неясными [50]. Идентификация мишеней для GDNF/RET недавно выявила несколько интересных кандидатов по обеспечению этих функций [33], [34], но внутриклеточные каскады, регулирующие изменения в экспрессии, еще предстоит решить. Сходным образом с предыдущими исследованиями химического ингибирования [33], мы обнаружили, что экспрессия транскрипционных факторов Etv4 и -5 была нормальной всякий раз, когда присутствовали UBs и поэтому не было необходимости в активности MAPK. Это противоположно потребности в tyrosine phosphatase Shp2, которая, по-видимому, регулирует Etv4 и -5 [12]. Негативный регулятор для RTK, Spry1, который супрессирует активность MAPK, и хемокиновый рецептор Cxcr4, участвующий в миграции некоторых типов клеток [51], были единственными исследованными генами, чья экспрессия была снижена в dko UB эпителии. Наши результаты показали, что разные внутриклеточные каскады регулируют экспрессию специфических генов мишеней и позднее будут выявлены потенциальные генетические взаимодействия между передачей сигналов RET и путем MAPK.

Мы показали, что отсутствие активности MAPK нарушает пролиферацию клеток, редуцируя количество клеток в фазе G1/S, не затрагивая главным образом митоз, это согласуется с находками, что pERK1/2 окрашивание отсутствует в митотических, pHH3⁺ клетках. Уменьшение маркеров фазы G1/S, но не нормального количества клеток в M фазе подтверждает изменения в кинетике клеточного цикла, так что двойные мутантные UB клетки проводят более продолжительное время в M-фазе по сравнению с контрольными клетками. Такой феномен был продемонстрирован в пигментном эпителии сетчатки человека, где устойчивое ингибирование ERK1/2 временно задерживает ход клеточного цикла [37]. Тот факт, что мутантные почки меньше, чем почки контрольных мышей вместе с уменьшением количества клеток в фазе G1/S, подтверждает мнение, что активность MAPK, посредством регуляции уровней cyclin D1 в эпителии UB, необходима для осуществления перехода от G1- к S-фазе, как было показано ранее для некоторых типов клеток [52]. Поэтому дефекты перехода G1/S также влияют на митоз, который снижается на более поздних стадиях развития почек.

При моделировании эпителия и морфогенезе, во время которых клетки перемещаются относительно др. др., контакты между клетками и матриксом и между клетками постоянно собираются и разбираются. Мы наблюдали, что UB эпителий без активности MAPK имеет достоверно повышенный E-cadherin в целом и в особенности распространяется в базально-боковое расположение по сравнению с контролем, указывая на проблемы с динамикой AJ. Быстрый оборот базирующихся на E-cadherin гомофильных AJs использует их эндоцитоз и рециклинг обратно на плазматическую мембрану [53], а дефекты этого процесса д. приводить к устойчивой локализации на клеточной поверхности E-cadherin. Вовремя эндоцитоза, интернализация E-cadherin инициируется с помощью фосфорилирования тирозина в E-cadherin, это вызывает его диссоциацию от p120 [54]. Нормальное распределение p120 и родственных белков (p0071 и ARVCF) в dko UBs подтверждает нормальный эндоцитоз E-cadherin, т.к. увеличивается локализация белков семейства p120 на клеточной поверхности, что ожидается, когда затрагивается эндоцитоз. Однако нормальное проявление p120 не обязательно исключает изменения в эндоцитозе или рециклинге E-cadherin.

Растут доказательства, указывающие активное общение между разными сайтами адгезии и это может, по крайней мере, частично обусловливаться локализацией определенных белков, подобных vinculin и paxillin, в фокальных адгезиях и AJs [26], [55]. Paxillin является непосредственной мишенью для фосфорилирования с помощью ERK-белков, а отсутствие pERK-индуцированного фосфорилирования по серину 83 в paxillin приводит к фундаментальным дефектам в распространении клеток и морфогенеза ветвления [24], [25]. Мы установили соответственно, что ингибирование активности MAPK в линии клеток, происходящей из мочеточникового зачатка [42] снижает общие уровни pPaxillin, но также наблюдается одновременный сдвиг из локализации его в клетках в межклеточные контакты, где параллельно увеличиваются уровни vinculin и E-cadherin. Кроме того, преимущественно клетки, происходящие из двойных мутантных UBs, обнаруживали нарушение свой способности формировать монослои, сохраняя плотно упакованные и обнаруживающие более сильные FAs, чем контрольные клетки, всё это указывает на то, что такая регуляция функционально важна. И paxillin и vinculin соединяются с β-catenin в AJs, где, по крайней мере, vinculin обнаруживает потенциал стабилизировать E-cadherin, а в определенных типах клеток, усиливать механоощущения [27]-[29]. Всё это вместе с наблюдением, что отсутствие активности MAPK in vivo и in vitro усиливает локализацию на клеточной поверхности E-cadherin и с недавним доказательством общения между FA и AJ, подтверждает, что MEK1/2-активированные ERK1/2 регулируют клеточную адгезию с помощью фосфорилирования paxillin по Ser83, это облегчает нормальную динамику и состав FA. Молекулярный механизм, с помощью которого отсутствие фосфорилирования paxillin приводит к увеличению локализации на плазматической мембране его самого и vinculin остаётся предметом будущих исследований, но не рецепторные тирозин киназы Src и focal adhesion kinase (FAK), также, как и малая GTPase Rac1, как было установлено, обеспечивают снование между FAs и AJs в др. типах клеток и поэтому являются прекрасными кандидатами [55], [56].

Повышенный E-cadherin в dko UB эпителии интуитивно подтверждает более сильную межклеточную адгезию, но ЭМ выявила крупные щели в боковых мембранах соседних клеток. Однако мест, а контактов, которые сохраняются в dko эпителии, выглядят электрон непроницаемыми, подтверждая, что они могут обеспечивать сильные контакты. Следовательно, возможно, что щели в боковых частях мембраны в действительности увеличивают адгезию в локальных сайтах, где контакты сохраняются и затем более сильные контакты вызывают разрывы мембраны рядом с адгезией, когда клетки стремятся двигаться одна относительно др. Подтверждает это то, что vinculin в AJs способствует высокой базирующейся на E-cadherin силе адгезии [57].

Наши находки демонстрируют важность Mek1/Mek2 в активации пути MAPK во время ветвления UB, которое в основном блокируется в dko почках. Исходя из полученных результатов, мы подтверждаем, что активность MAPK регулирует обусловленное cyclin D1 прогрессирование клеточного цикла с G1 к S фазе и нормальную клеточную адгезию посредством фосфорилирования paxillin в FAs. Отсутствие активности MAPK умножает FA белки vinculin и остатки от pPaxillin на клеточной поверхности, где они участвуют в стабилизации E-cadherin в AJs возможно, чтобы усиливать межклеточную адгезию. Итак, гетерогенная локализация pERK1/2 в UB эпителии, где определенные клетки обнаруживают высокую активность ERK, а др. не обнаруживают активности совсем, это может указывать, что активность MAPK настраивает клетки на высокую подвижность и тем самым вместе с управляемой пролиферацией способствует образованию новых веточек.