Посещений:
экватор хрусталика

Переключение с пролиферации на дифференцировку

The lens equator: A platform for molecular machinery that regulates the switch from cell proliferation to differentiation in the vertebrate lens
Toshiaki Mochizuki, Ichiro Masai
• Dev.Growth & Differ. Volume 56, Issue 5 June 2014 Pages 387–401

The vertebrate lens is a transparent, spheroidal tissue, located in the anterior region of the eye that focuses visual images on the retina. During development, surface ectoderm associated with the neural retina invaginates to form the lens vesicle. Cells in the posterior half of the lens vesicle differentiate into primary lens fiber cells, which form the lens fiber core, while cells in the anterior half maintain a proliferative state as a monolayer lens epithelium. After formation of the primary fiber core, lens epithelial cells start to differentiate into lens fiber cells at the interface between the lens epithelium and the primary lens fiber core, which is called the equator. Differentiating lens fiber cells elongate and cover the old lens fiber core, resulting in growth of the lens during development. Thus, lens fiber differentiation is spatially regulated and the equator functions as a platform that regulates the switch from cell proliferation to cell differentiation. Since the 1970s, the mechanism underlying lens fiber cell differentiation has been intensively studied, and several regulatory factors that regulate lens fiber cell differentiation have been identified. In this review, we focus on the lens equator, where these regulatory factors crosstalk and cooperate to regulate lens fiber differentiation. Normally, lens epithelial cells must pass through the equator to start lens fiber differentiation. However, there are reports that when the lens epithelium structure is collapsed, lens fiber cell differentiation occurs without passing the equator. We also discuss a possible mechanism that represses lens fiber cell differentiation in lens epithelium.


Рисунки к статье



Overview of lens structure and development


Хрусталик позвоночных это прозрачная сфероидальная глазная ткань, которая фокусирует зрительные картины на фоторецепторы сетчатки. Чтобы достичь прозрачности, 90-95% хрусталика состоит из клеток хрусталиковых волокон, в которых рассеиванию проникающего света препятствует деградация их органелл, включая ядро и аппарат Гольджи и митохондрии во время дифференцировки клеток хрусталиковых волокон. У позвоночных форма хрусталиков разнообразна. Напр., хрусталики млекопитающих обладают сплющенной сфероидной формой, тогда как водные животных, такие как рыбы имеют сферические хрусталики (Nicol 1989; Kuszak & Costello 2004; Land & Nilsson 2012). Форма хрусталиков приспособлена к среде обитания организма. Большинство млекопитающих живут на суше и используют роговицу, чтобы настраивать фокус, т.к. коэффициент отражения сильнее, чем таковой воздуха. Напротив, рыбы используют хрусталики, чтобы настраивать фокус, поскольку коэффициент отражения роговицы близок к таковому воды и роговица играет незначительную роль в формировании изображений в воде (Greiling & Clark 2008).
На ранней стадии хрусталики происходят из передней поверхностной эктодермы, располагающейся поверх нейральной сетчатки. В хрусталиках млекопитающих презумптивная хрусталиковая эктодерма утолщается в хрусталиковую плакоду, когда нейральная сетчатки выпячивается из переднего мозга и контактирует с Хрусталиковая плакода отсоединяется от поверхности передней эктодермы, инвагинирует в карман глазного бокала и образует хрусталиковый пузырёк (Fig. 1A). Клетки в задней половине хрусталикового пузырька, которые близки к нейральной сетчатке, удлиняются и заполняют полость хрусталикового пузырька и дифференцируются в клетки первичных хрусталиковых волокон, образуя сердцевину из хрусталиковых волокон. С др. стороны, клетки передней половины хрусталикового пузырька, которые располагаются под роговицей, сохраняют пролиферативное состояние и формируют монослой хрусталикового эпителия. После образования сердцевины из первичных хрусталиковых волокон экватор становится границей между хрусталиковым эпителием и сердцевиной из хрусталиковых волокон. На экваторе эпителиальные клетки хрусталика начинают дифференцироваться в клетки хрусталиковых волокон, которые наз. клетками вторичных волокон и покрывают старую сердцевину из хрусталиковых волокон. Развитие хрусталиков рыбок данио напоминает таковое у млекопитающих, за исключением того, что хрусталиковая плакода инвагинирует в виде клеточной массы без образования полости (Greiling & Clark 2009) (Fig. 1B). Т.о. дифференцировка хрусталиков сходна среди позвоночных.

Figure 1. Lens development in mammals and zebrafish. (A) Lens development in mammals. (Left) The lens placode detaches from surface ectoderm and forms the lens vesicle. (Middle) Cells in the posterior half of the lens vesicle elongate and differentiate into primary fiber cells, which form the lens fiber core. On the other hand, cells in the anterior half maintain a proliferative state and form mono-layered lens epithelium. (Right) Lens epithelial cells differentiate into lens fiber cells at the peripheral margin of the lens epithelium, which is called the equator. Newly differentiating lens fiber cells elongate to become secondary lens fibers and cover the old lens fiber core. (B) Lens development in zebrafish. In zebrafish, the lens placode invaginates as a cell mass. Primary fiber cells differentiate from the posterior side of the lens sphere and form the lens fiber core. Lens epithelium formation and secondary lens fiber differentiation proceed in the same way as in mammalian lens.

Исследования механизмов, лежащих в основе развития хрусталиков, ведутся давно. Hans Spemann показал, что хрусталики неспособны специфицироваться в поверхностную эктодерму, когда презумптивная область сетчатки удаляется из передней части нервной пластинки у эмбрионов лягушек (Spemann 1901). Он пришел к выводу, что индуктивный сигнал или сигналы от презумптивной сетчатки способствуют дифференцировке хрусталиков, и эта находка стала концепцией эмбриональной индукции в биологии развития. В 1980s, Grainger с коллегами проверили процесс индукции хрусталиков и предположили, что она осуществляется в виде 4 дискретных ступеней (Grainger 1992, 1996). На ст. средней гаструлы вся эктодерма в анимальной шапочке компетентна генерировать хрусталики. Однако на второй ступени эта компетентность ограничивается презумптивной хрусталиковой эктодермой под влиянием сигналов от передней части нервной пластинки на ст. нейрулы. На 3-й ступени хрусталиковая плакода специфицируется, когда презумптивная сетчатка располагается вблизи от презумптивной хрусталиковой эктодермы. Затем хрусталиковые клетки начинают дифференцироваться в клетки хрусталиковых волокон (Grainger et al. 1997). Недавно сообщалось, что компетентность к образованию хрусталика в головной эктодерме не только обеспечивается сигналами от передней части нервной пластинки, но и также ограничивается с помощью transforming growth factor-β (TGF-β) и канонической передачи сигналов Wnt от клеток нервного гребня (Grocott et al. 2010), указывая, что индукция хрусталиковой плакоды регулируется кооперативно позитивными и негативными сигналами.
После образования сердцевины из первичных хрусталиковых волокон, эпителиальные клетки хрусталика начинают дифференцироваться в клетки вторичных хрусталиковых волокон на экваторе. Дифференцирующиеся клетки хрусталиковых волокон становятся плоскими, и они выпускают апикальные и базальные отростки в двух направлениях к переднему и заднему полюсу сферы хрусталика, соотв. Апикальные и базальные отростки конвергируют на обоих полюсах, образуя шов (Fig. 2A). Интересно, что паттерн швов различен у позвоночных; хрусталики млекопитающих обнаруживают Y-образные швы, хрусталики рыбок данио и птиц обнаруживают точечные швы, а хрусталики некоторых рыб и амфибий обнаруживают линейные швы (Kuszak & Costello 2004) (Fig. 2B). Более того, Y-образные швы становятся боле сложными "звездчатыми" структурами в хрусталиках приматов во время развития (Kuszak et al. 2004). Эти различия могут вносить вклад в разнообразие форм хрусталиков, поскольку точечные и Y швы наблюдается на сферических и эллипсоидных хрусталиках, соотв. Более того, описана корреляция между архитектурой швов и качеством зрения (Kuszak et al. 1991). Механизмы, которые регулируют разнообразие рисунков швов хрусталика, интересны. Более того, клетки хрусталиковых волокон обладают двумя типами выпячиваний: краевые выпячивания и шарообразные (ball-and-socket) выпячивания, которые образуются вдоль короткой и длинной сторон волокна, соотв. (Fig. 2C). Оба типа выпячиваний вносят вклад во взаимно блокирующие соединения между клетками хрусталиковых волокон и, скорее всего, они функционируют как платформа для щелевых соединений (Blankenshipet al. 2007; Bassnett et al. 2011). Щелевые соединения усиливают связь клеток хрусталиковых волокон, стабилизируют морфологию хрусталиков и обеспечивают транспорт малых молекул из хрусталикового эпителия в клетки хрусталиковых волокон (Mathias et al. 2010). Помимо щелевых соединений предполагается существование пути диффузии макромолекул между клетками хрусталиковых волокон (Shestopalov & Bassnett 2000, 2003), который зависит от образования стратифицированного синцития. Это устанавливается по слиянию клеток, обеспечиваемого с помощью claudin-подобного белка, Lim2 (также известен как MIP20) (Shi et al. 2009). Механизмы, регулирующие такую сложную морфологию и функцию хрусталиковых волокон, также очень интересуют исследователей.



Figure 2. Lens fiber organization and structure. (A) The lens suture (red) is formed at the anterior and the posterior poles of the lens. (B) The suture pattern (red) is diverse: umbilical (point) sutures in birds and teleosts, including zebrafish (left), line sutures in amphibians and some fish species (middle), and Y-sutures in mammals (right). (C) Lens fiber cells possess two types of protrusions: edge protrusions and ball-and-socket processes, which are formed on the short and wide sides of lens fiber cells, respectively. Both types of protrusions interlock neighboring lens fiber cells and contain gap junctions.

Др. важным аспектом дифференцировки хрусталиковых волокон является деградация внутриклеточных органелл, включая ядро (Bassnett 2009). При дифференцировке клетках хрусталиковых волокон ядро (Bassnett & Mataic 1997), митохондрии (Bassnett & Beebe 1992) и аппарат Гольджи (Bassnett 1995) деградируют, чтобы сформировать прозрачную свободную от органелл зону (OFZ). Недавно сообщалось, что DNase II-like acid DNase (DLAD, DNase IIβ) способствует устранению ядра в хрусталике (Nishimoto et al. 2003). Однако ещё предстоит выяснить, как деградация ядра и др. органелл, скоординированная при образовании OFZ, может внести вклад в наше понимание возникновения катаракт.

Classical studies on lens fiber differentiation in the 1970s


В 1970s, используя хрусталики кур, Coulombre показал, что эпителиальные клетки хрусталиков удлиняются и дифференцируются в клетки хрусталиковых волокон, после того, как хрусталики были повернуты на 180° внутри глазного бокала, так что эпителий хрусталика, обращался к нейральной сетчатке (Coulombre & Coulombre 1963) (Fig. 3A). Сходные результаты были получены с использованием хрусталиков мышей (Yamamoto 1976). Эти результаты подтвердили, что весь регион эпителия хрусталика сохраняет компетентность дифференцироваться в клетки хрусталиковых волокон на более поздних ст. развития и что дифференцировка хрусталиковых волокон активируется даже без прохождения через экватор, когда хрусталиковый эпителий, обращен к стекловидному телу или нейральной сетчатке. Этот феномен очень интересен, поскольку подтверждает, что окружение отличается на передней и задней стороне хрусталика (Fig. 3B). Единственная возможность, что окружение сзади содержит материалы или дает приют механизмам, которые управляют дифференцировкой хрусталиковых волокон. Альтернативно переднее окружение может постоянно супрессировать дифференцировку хрусталиковых волокон. Любая возможность может объяснить, почему клетки хрусталиковых волокон начинают дифференцироваться на экваторе, которые располагается в промежутке между передним и задним регионами. В этом контексте экватор предоставляет платформу для молекулярного аппарата, который регулирует переключение с клеточной пролиферации на дифференцировку в хрусталиках позвоночных.

Figure 3. Mechanism of differentiation from lens epithelium into lens fiber cells.

В 1970s, McAvoy исследовал пролиферацию в развивающемся хрусталике и установил, что клеточная пролиферация наблюдается только в хрусталиковом эпителии, но не в клетках хрусталиковых волокон (McAvoy 1978; Zwaan & Kenyon 1984). McAvoy классифицировал хрусталиковый эпителий в три самостоятельных региона, "передняя зона", "герминативная зона" и "переходная зона", вдоль переднезадней оси (McAvoy 1978) (Fig. 3C). Передняя зона представляет собой наиболее передний регион хрусталикового эпителия, где пролиферация клеток относительно низка. Герминативная зона располагается непосредственно впереди экватора. Клеточная пролиферация наиболее активна в этой зоне. Переходная зона располагается непосредственно позади экватора, где происходит дифференцировка клеток хрусталиковых волокон. Эти наблюдения подтверждают, что клеточная пролиферация не униформна в эпителии хрусталика, а пространственно регулируется. BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) инкорпорируется на высоком уровне в регионе впереди экватора в хрусталиках рыбок данио (Imai et al. 2010), подтверждая, что герминативная зона присуща всем позвоночным. Биологическое значение герминативной зоны ещё предстоит выяснить, хотя высокий уровень активации хода клеточного цикла может играть роль во вступлении хрусталиковых волокон в дифференцировку на экваторе.

Intrinsic factors that regulate lens fiber cell differentiation


Генетические исследования выявили несколько транскрипционных факторов, которые регулируют индукцию хрусталиковой плакоды, образование хрусталикового пузырька и дифференцировку клеток хрусталиковых волокон. Мы суммируем роль этих факторов в развитии хрусталиков. С доменом paired и homeobox доменом транскрипционный фактор, Pax6, является главным регулятором индукции и поддержания хрусталиковой плакоды (Hill et al. 1991; Glaser et al. 1992; Jordan et al. 1992; Matsuoet al. 1993; Halder et al. 1995; Altmann et al. 1997). Экспрессия Pax6 обнаруживается в поверхностной эктодерме головы и становится ограниченной хрусталиковой плакодой, когда образуется глазной бокал (Grindley et al. 1995; Kamachi et al. 1998). Позднее экспрессия Pax6 поддерживается только в эпителии хрусталика (Kamachi et al. 1998), подтверждая, что Pax6 поддерживает в недифференцированном состоянии эпителиальные клетки хрусталика и потенциал генерировать клетки хрусталиковых волокон. Избыточная экспрессия Pax6 в клетках хрусталиковых волокон аномально индуцирует экспрессию маркера эпителиальных клеток, α5/β1 integrin (Fig. 4), в клетках хрусталиковых волокон, что впоследствии вызывало образование катаракты (Duncan et al. 2000), подтверждая, что подавление Pax6 в клетках хрусталиковых волокон важно для дифференцировки хрусталиковых волокон.

Figure 4. Regulatory network of transcription factors in lens development.

Sry-related high-mobility group (HMG) box-содержащие транскрипционные факторы, Sox1, Sox2 и Sox3, экспрессируются ы развивающемся хрусталике. У эмбрионов кур и мышей Sox2 и Sox3 первоначально экспрессируются в хрусталиковой плакоде и подавляются на более поздних стадиях, тогда как Sox1 первоначально экспрессируется в хрусталиковой плакоде и сохраняется в клетках хрусталиковых волокон (Collignon et al. 1996; Kamachi et al. 1998). Sox1 нокаутные мыши обнаруживают микрофталмию с катарактой хрусталика (Nishiguchi et al. 1998). Sox1 мутантные клетки хрусталиковых волокон аномально экспрессируют маркеры хрусталикового эпителия, Pax6 и α5 integrin (Donner et al. 2007) и не экспрессируют маркера клеток хрусталиковых волокон γ -crystallin (Nishiguchi et al. 1998) (Fig. 4). Они также неспособны удлиняться, указывая тем самым, что Sox1 необходим для дифференцировки клеток хрусталикового эпителия в клетки хрусталиковых волокон.
Гомолог Drosophila sine oculus у позвоночных Six3, экспрессируется в хрусталиковой плакоде и позднее ограничивается хрусталиковым эпителием, включая переходную зону у мышей и рыбок данио (Oliver et al. 1995; Kobayashi et al. 1998). Нокдаун Pax6 снижает экспрессию Six3 в хрусталиковой плакоде (Ashery-Padan et al. 2000). Избыточная экспрессия Six3 частично устраняет дефекты хрусталика при гаплонедостаточности Pax6, а Pax6 и Six3 взаимно активируют свою экспрессию (Goudreau et al. 2002) (Fig. 4). Данные подтверждают, что Six3 способствует Pax6-обусловленной дифференцировке хрусталика.
Транскрипционный фактор forkhead/winged helix, Foxe3 (Xlens1), экспрессируется в хрусталиковой плакоде и позднее ограничивается хрусталиковым эпителием (Kenyon et al. 1999; Blixt et al. 2000; Brownell et al. 2000; Shi et al. 2006). Pax6 индуцирует экспрессию Foxe3 (Blixtet al. 2000; Brownell et al. 2000) (Fig. 4). У мутантных Foxe3 мышей, которые первоначально были выявлены как Dysgenetic lens (dyl), более того, экспрессия маркера дифференцировки волокон, Prox1, распространяется кпереди у мутантов Foxe3 (Fig. 4), хотя экспрессия в хрусталиковом эпителии адгезивной молекулы, E-cadherin (cdh1), не затрагивается (Blixt et al. 2000), это указывает, что Foxe3 поддерживает эпителий хрусталика и репрессирует дифференцировку хрусталиковых волокон, располагаясь ниже Pax6.
Mab21l1, у позвоночных гомолог C. elegans mab-21 (Baird et al. 1991), первоначально экспрессируется в хрусталиковой плакоде, а позднее ограничивается эпителием хрусталика (Yamada et al. 2003). У нокаутных Mab21l1 мышей хрусталиковая плакода не инвагинирует полностью, приводя к дефектам образования хрусталиково пузырька. Экспрессия маркера эпителия хрусталика, Foxe3, снижается у Mab21l1 нокаутных мышей (Fig. 4), хотя экспрессия Pax6 не изменена, это подтверждает, что Mab21l1 функционирует ниже Pax6 и выше Foxe3, чтобы сформировать хрусталиковый пузырёк.
AP-2 транскрипционный фактор, AP-2α первоначально экспрессируется в хрусталиковой плакоде, а позднее ограничивается хрусталиковым эпителием (Ohtaka-Maruyama et al. 1998). Нокдаун AP-2α дает фенотип "хрусталика с ножкой", при котором отделение хрусталикового пузырька от поверхностно эктодермы неполное (West-Mays et al. 1999), это подтверждает роль AP-2α в морфогенезе хрусталика. У мутантов AP-2α в эпителии хрусталика экспрессия Pax6, Foxe3 и Pitx3 не затрагивается, но экспрессия E-cadherin снижается (Pontoriero et al. 2008). Эктопическая экспрессия AP-2α в клетках хрусталиковых волокон аномально индуцирует экспрессию E-cadherin в клетках хрусталиковых волокон и снижает маркер клеток хрусталиковых волокон Aquaporin 0 (также известен как MIP26) (West-Mays et al. 2002) (Fig. 4). Подтверждается, что AP-2α регулирует морфогенез хрусталика, возможно посредством функционирования E-cadherin.
Msx2 экспрессируется в хрусталиковой плакоде и позднее по всему хрусталику. Msx2 нулевые мыши обнаруживают микрофталмию, сопровождаемую подавлением маркера эпителия хрусталика, Foxe3, и активацией маркеров клеток хрусталиковых волокон, Prox1 и crystallin (Fig. 4), хотя экспрессия Pax6 и AP-2α не затрагивается (Zhao et al. 2012). Эти данные подтверждают, что Msx2 необходим для собственно экспрессии транскрипционных факторов, участвующих в развитии хрусталика.
Bicoid-типа гомоеобоксных транскрипционный фактор, Pitx3, экспрессируется в хрусталиковом пузырьке и позднее ограничивается эпителием хрусталика (Shi et al. 2005; Ho et al. 2009). Pitx3 мутантные мыши известны как Aphakia, дают катаракты, фенотип хрусталика на ножке и дефекты дифференцировки первичных хрусталиковых волокон (Varnum & Stevens 1968; Zwaan 1975; Grimm et al. 1998). У Pitx3 нокаутных мышей маркеры эпителиальных клеток хрусталика, platelet-derived growth factor (PDGF) рецептор α и Foxe3, снижены (Fig. 4), но экспрессия E-cadherin не изменена (Ho et al. 2009). Напротив, маркер дифференцировки клеток хрусталиковых волокон, Prox1, и два cdk ингибитора p27Kip1 и p57Kip2, экспрессируются по всему хрусталику (Ho et al. 2009) (Fig. 4), подтверждая, что Pitx3 необходим для поддержания целостности эпителия хрусталика.
Prox1, гомолог у позвоночных Drosophila prospero, первоначально экспрессируется в хрусталиковом пузырьке, а позднее ограничивается клетками, проходящими через экватор и в клетках с ранней дифференцировкой в хрусталиковые волокна. Субклеточное расположение белка Prox1 уникально. Он появляется в цитоплазме эпителия хрусталика и в ядрах клеток, дифференцирующихся в хрусталиковые волокна (Duncan et al. 2002). Prox1 нулевые мыши обнаруживают дефекты в элонгации клеток первичных хрусталиковых волокон и снижают экспрессию cdk ингибиторов, p27Kip1 и p57Kip2 (Wigle et al. 1999) (Fig. 4). Эти данные подтверждают, что Prox1 необходим для индукции дифференцировки клеток хрусталиковых волокон.
bZIP транскрипционный фактор, MafA (также известен как L-maf), первоначально экспрессируется в хрусталиковой плакоде и позднее ограничивается клетками хрусталиковых волокон у мышей и лягушек (Ogino & Yasuda 1998; Ishibashi & Yasuda 2001; Takeuchi et al. 2009). С др. стороны, MafB первоначально экспрессируется в хрусталиковой плакоде и затем ограничивается эпителием хрусталика (Takeuchi et al. 2009). Эктопическое внесение MafA и MafB, как было установлено, вызывает эктопический маркер хрусталиковых волокон, кристаллины, у эмбрионов кур и Xenopus (Ogino & Yasuda 1998; Ishibashi & Yasuda 2001). Однако, ни MafA, ни MafB нокаутные мыши не обнаруживают дефектов развития хрусталиков (Takeuchi et al. 2009). Более того, MafA и MafB двойные нокаутные мыши также не обнаруживают дефектов в хрусталиках (Takeuchi et al. 2009). Др. Maf белок, c-Maf, экспрессируется в хрусталиковой плакоде и ограничивается клетками хрусталиковых волокон (Takeuchi et al. 2009). Экспрессия мРНК c-Maf значительно более обильна, чем экспрессия MafA и MafB, а нокаутные c-Maf мыши обнаруживают нарушения дифференцировки хрусталиковых волокон и экспрессии генов кристаллинов (Fig. 4), хотя экспрессия Pax6, Sox и Prox1 не затрагивается (Kawauchi et al. 1999; Kim et al. 1999; Ring et al. 2000). Эти результаты подтверждают, что c-Maf регулирует окончательную дифференцировку клеток хрусталиковых волокон, возможно ниже Prox1.
Хотя взаимоотношения этих транскрипционных факторов ещё не полностью установлены, их комбинаторная сеть играет роль в становлении и поддержании хрусталикового эпителия и области клеток хрусталиковых волокон (Fig. 4).

Extrinsic factors that regulate lens fiber cell differentiation


Как упоминалось выше, Coulombre (Coulombre & Coulombre 1963) и Yamamoto (Yamamoto 1976) показали, что хрусталиковый эпителий инициирует дифференцировку клеток хрусталиковых волокон, когда хрусталик поворачивают на 180°, так что эпителий хрусталика обращается к стекловидному телу или нейральной сетчатке. Эти находки показали, что имеется некий материал, который способствует дифференцировке хрусталиковых волокон на задней стороне хрусталика. В 1980s, используя культуру клеток эпителия хрусталика, Beebe с сотр. установили, что эпителиальные клетки хрусталика подвергаются дифференцировке в хрусталиковые волокна, когда они культивируются со стекловидным телом (vitreous humor) (Beebe et al. 1980). Они подтвердили, что стекловидное тело содержит субстанцию, наз. "lentropin", которая индуцирует дифференцировку клеток хрусталиковых волокон, которая позднее была идентифицирована как insulin-like growth factor-1 (IGF-1) (Beebe et al. 1987). Piatigorsky с сотр. независимо установили, что insulin индуцирует дифференцировку клеток хрусталикового эпителия в культуре (Piatigorsky 1973; Piatigorsky et al. 1973). Эти наблюдения подтвердили существование внеклеточных факторов, способствующих дифференцировке клеток хрусталиковых волокон.
Совместное культивирование эксплантов хрусталиков крыс с сетчаткой или со средой, использованной для культивирования эксплантов сетчатки, способствовало дифференцировке клеток хрусталиковых волокон, подтверждая, что секретируемые молекулы, испускаемые сетчаткой, ответственны за дифференцировку клеток хрусталиковых волокон (McAvoy 1980; McAvoy & Fernon 1984). Та же самая группа идентифицировала fibroblast growth factor (FGF) в качестве кандидата (Chamberlain & McAvoy 1987, 1989). Вестерн блот анализ выявил, что FGF1 и FGF2 присутствуют в клетках хрусталиковых волокон телят и в стекловидном теле (Schulz et al. 1993) (Fig. 5A). FGF3, первоначально наз. Int2, экспрессируется в ранней развивающейся сетчатке (Wilkinsonet al. 1989). FGF8 экспрессируется в ранней развивающейся сетчатке и позднее ограничивается внутренним ядерным слоем в сетчатке кур (Vogel-Hopker et al. 2000). FGF9 экспрессируется в сетчатке мышей и пигментном эпителии (Colvin et al. 1996). FGF12 экспрессируется в клетках ретинальных ганглиев сетчатки мышей (Hartung et al. 1997). FGF5 экспрессируется в фоторецепторах, клетках ретинальных ганглиев и ретинальном пигментном эпителии в сетчатке взрослых макак (Kitaoka et al. 1994). FGF рецепторы также экспрессируются в хрусталиках. FGFR1 и сплайс-вариант FGFR2, FGFR2 IIIB, экспрессируются в эпителии хрусталика мыши (Fig. 5A). Их экспрессия формирует градиент от низкого уровня к высокому вдоль переднезадней оси, и наивысшая экспрессия наблюдается вблизи экватора хрусталика грызунов (Orr-Urtreger et al. 1993; de Iongh et al. 1996, 1997). Др. сплайс-вариант FGFR2, FGFR2 IIIc, экспрессируется в хрусталиковом эпителии мыши (Orr-Urtreger et al. 1993; de Ionghet al. 1997) (Fig. 5B). FGFR3 экспрессируется в клетках хрусталиковых волокон (Peters et al. 1993) (Fig. 5B). FGFR4 экспрессируется в герминативной и переходной зонах хрусталиков кур (Marcelleet al. 1994) (Fig. 5B). Эти данные подтверждают, что хрусталиковый эпителий экспрессирует все рецепторы для FGF, которые могут связывать множественные FGF лиганды, экспрессируются глазными тканями.

Figure 5. Extrinsic factors in lens fiber differentiation.
Воздействие FGF на эпителий хрусталика вызывает клеточную пролиферацию в низких дозах и дифференцировку клеток хрусталиковых волокон при высоких дозах, подтверждая, что FGF регулирует множественные ступени дифференцировки хрусталиковых волокон зависимым от дозы способом (Chamberlain & McAvoy 1989). McAvoy подтвердили возможность, что градиент дозы FGF формируется от стекловидного тела и регулирует ступенчато-образно дифференцировку хрусталиковых волокон. Однако, FGFR1 мутантные клетки нормально образуют хрусталики, даже если были трансплантированы Pitx3 мутантным мышам, у которых развитие хрусталиков сильно задерживается (Zhao et al. 2006), подтверждая, что FGFR1 необязателен для развития хрусталика. Нокдаун FGFR2 слегка нарушает выход из клеточного цикла клеток эпителия хрусталика и увеличивает клеточную гибель как в эпителии хрусталика, так и клетках хрусталиковых волокон, давая хрусталики малого размера (Garcia et al. 2005). Нокдаун FGFR3 также не влияет на развитие хрусталиков у мыши (Deng et al. 1996). Интересно, что специфичный для хрусталиков тройной нокдаун FGFR1, 2 и 3 у мыши серьезно ингибирует дифференцировку первичных хрусталиковых волокон в задней половине хрусталикового пузырька, приводя к микрофталмии (Zhao et al. 2008). Эти данные подтверждают, что FGF необходимы для дифференцировки клеток хрусталиковых волокон. Equarin новая секретируемая молекула, которая связывает FGFs it и облегчает зависимую от FGF дифференцировку хрусталиковых волокон (Song et al. 2010). Поскольку equarin экспрессируется на высоком уровне на экваторе хрусталика, то возможно, что equarin активирует передачу сигналов FGF на экваторе. Эти данные подтверждают, что передача сигналов FGF обеспечивает переключение с пролиферации эпителиальных клеток на дифференцировку клеток хрусталиковых волокон (Fig. 5G).
Bone morphogenetic protein (BMP) является др. кандидатом, который регулирует дифференцировку клеток хрусталиковых волокон, который располагается по соседству с герминативной зоной хрусталика мыши (Zhao et al. 2002) (Fig. 5C). BMP type I рецептор, BMPRIa (ALK3) и type II рецептор, BMPRII, экспрессируются в хрусталиковом эпителии, но оба понижены в клетках хрусталиковых волокон (de Iongh et al. 2004) (Fig. 5C). Воздействие антагониста BMP, Noggin, и эктопическая экспрессия доминантно негативного BMPRIb (ALK6) ингибирует дифференцировку клеток хрусталиковых волокон (Faber et al. 2002), подтверждая, что передача сигналов BMP позитивно регулирует дифференцировку хрусталиковых волокон. У кур, BMP способствует FGF-зависимой дифференцировке клеток хрусталиковых волокон в культуре (Boswell et al. 2008), и индуцирует экспрессию FGF-позитивного регулятора, equarin (Jarrin et al. 2012). Эти наблюдения подтверждают, что BMP кооперирует с FGF, чтобы способствовать дифференцировке клеток хрусталиковых волокон (Fig. 5G).
У мыши все белки семейства TGF-β TGF-β 1, 2 и 3, экспрессируются в клетках хрусталиковых волокон, но не в хрусталиковом эпителии (Pelton et al. 1991). Однако, TGF-β 2 мРНК экспрессируется в хрусталиковом эпителии мыши и цилиарном теле (Millan et al. 1991). TGF-β 2 был обнаружен в aqueous и vitreous жидкостях человека (Connor et al. 1989; Jampel et al. 1990) (Fig. 5D). TGF-β type I рецептор, ALK5, и type II рецептор, Tβ RII, экспрессируются в эпителии хрусталика и ранних дифференцирующихся клетках хрусталиковых волокон (de Iongh et al. 2001a) (Fig. 5D). Эти наблюдения подтверждают роль передачи сигналов TGF-β в дифференцировке хрусталиковых волокон. Воздействие TGF-β на экспланты эпителия хрусталика крыс способствует FGF-обеспечиваемой дифференцировке хрусталиковых волокон, хотя TGF-β в отдельности оказывает незначительный эффект (Liu et al. 1994). Интерсно, что воздействие TGF-β на целые хрусталики крыс дает непрозрачные бляшки в эпителии хрусталика, это согласуется с аномально агрегированными клетками, экспрессирующими мезенхимный маркер, α -smooth muscle actin α -SMA), внеклеточный матричный белок, laminin и Type I collagen (Hales et al. 1995). Это указывает на то, что TGF-β трансформирует эпителиальные клетки хрусталика в клетки миофибробластов. Трансгенные мыши с избыточной экспрессией TGF-β 1 в клетках хрусталиковых волокон также обнаруживают сходные непрозрачные бляшки, в которых экспрессия хрусталиковых эпителиальных маркеров, таких как Pax6 редуцирована, но индуцируется экспрессия α -SMA и маркеров клеток хрусталиковых волокон, α , β , γ -crystallins и Aquaporin 0 (MIP26), подтверждая, что TGF-β способствует дифференцировке эпителиальных хрусталиковых клеток в клетки хрусталиковых волокон (Lovicu et al. 2004). Избыточная экспрессия доминантно негативных TGF-β рецепторов ингибирует дифференцировку хрусталиковых волокон (de Iongh et al. 2001b). Эти данные подтверждают, что TGF-β способствует дифференцировке клеток хрусталиковых волокон, возможно при содействии FGF (Fig. 5G).
Передача сигналов Wnt представлена тремя путями, известный как канонический, Wnt, не канонический Wnt/Planer cell polarity (PCP) и передача сигналов Wnt/Ca2+ (Niehrs 2012). Канонический путь передачи сигналов Wnt регулирует пролиферацию клеток, тогда как неканонический Wnt/PCP путь пространственно координирует клеточную миграцию и клеточный морфогенез, приводя к формированию паттерна ткани. Wnt сигнальные молекулы: лиганды Wnt5a, 5b, 7a, 7b, 8a и 8b, рецепторы Frizzled 1-4 и медиаторы Dishevelled (Dev) 2 и 3, экспрессируются в эпителии хрусталика, включая переходную зону (Stump et al. 2003) (Fig. 5E). Нокдаун корецепторов для канонической передачи сигналов Wnt, Lrp6, нарушает структуру эпителия хрусталика, приводя к выталкиванию хрусталиковых волокон в пространство между эпителием хрусталика и роговицей (Stump et al. 2003). Нокдаун канонического Wnt эффектора, β -catenin, редуцирует экспрессию маркеров эпителия хрусталика, Pax6 и E-cadherin, и препятствует ходу клеточного цикла в эпителии хрусталика, подтверждая, что передача сигналов Wnt необходима для формирования и функции эпителия хрусталика. Более того, дифференцировка клеток хрусталиковых волокон также была аномальной в отношении апикально-базальной полярности и совместной локализации cadherin и actin (Cainet al. 2008). Избыточная экспрессия постоянно активного β -catenin или нокдаун негативного регулятора Wnt, adenomatous polyposis coli (APC) вызывают противоположные фенотипы: увеличение экспрессии маркеров эпителия хрусталика, Pax6 и E-cadherin, и уменьшение экспрессии маркеров клеток хрусталиковых волокон, c-Maf и β -crystallin, в заднем регионе хрусталика, приводя к экспансии хрусталикового эпителия через экватор (Martinez et al. 2009). Эти данные in vivo подтверждают, что каноническая передача сигналов Wnt необходима для поддержания эпителия хрусталика (Fig. 5G). Однако исследования in vivo с использованием эксплантов эпителия хрусталика показали, что Wnt3a в отдельности способствует ходу клеточного цикла; однако, когда экспланты были предварительно обработаны FGF, Wnt3a также способствовал дифференцировке хрусталиковых волокон (Lyu & Joo 2004). Эти данные подтверждают, что Wnt регулирует пролиферацию хрусталикового эпителия и дифференцировку хрусталиковых волокон зависимым от контекста способом. Сообщалось, что удлинение и морфогенез хрусталиковых волокон нуждаются в Wnt/PCP пути (Chen et al. 2008), который кооперирует с передачей сигналов FGF (Dawes et al. 2013, 2014).
Передача сигналов Notch регулирует баланс между пролиферацией и дифференцировкой посредством механизма латеральной ингибиции (Bray 2006; Louvi & Artavanis-Tsakonas 2006). Notch2 экспрессируется в хрусталиковом эпителии (Fig. 5F), а нокдаун Notch2 увеличивает фракцию клеток хрусталиковых волокон (Saravanamuthu et al. 2012). Нокдаун Notch эффектора, CSL (CBF1/Su(H)/LAG-1), который первоначально был назван Rbp-j у млекопитающих, способствует преждевременной дифференцировке хрусталиковых волокон, тогда как постоянная активация Notch способствует пролиферации клеток в эпителии хрусталика (Jia et al. 2007; Rowan et al. 2008). Notch лиганд, Jagged1, экспрессируется в ранних дифференцирующихся клетках хрусталиковых волокон, включая переходную зону (Fig. 5F). Нокдаун Jagged1 у гетерозиготных мышей усиливает экспрессию cdk ингибитора, p57Kip2, в герминативной зоне, способствуя преждевременной дифференцировке клеток хрусталиковых волокон (Le et al. 2009). Эти данные подтверждают, что путь передачи сигналов Jagged1-Notch2 регулирует собственно баланс между клеточной пролиферацией и клеточной дифференцировкой вокруг экватора (Fig. 5G). Хотя взаимоотношение между передачей сигналов Jagged1-Notch2 и др. факторами, такими как FGF и Wnt ещё предстоит выяснить, интересно, что пути передачи сигналов Wnt и Notch последовательно координируют пролиферацию и дифференцировку в цилиарной маргнальной зоне сетчатки (Yamaguchi et al. 2005), которая пространственно ассоциирует с экватором хрусталика (Imai et al. 2010). Рис 5G суммирует молекулярную сеть внешних факторов.

Suppression of lens fiber differentiation in the lens epithelium: Implication from research on cataract surgery


Классические эксперименты, проделанные Coulombre и Yamamoto (Coulombre & Coulombre 1963; Yamamoto 1976) подтвердили вероятность, что заднее окружение содержит материалы, которые управляют дифференцировкой клеток хрусталиковых волокон. Альтернативно, переднее окружение может содержать материалы, которые постоянно супрессируют дифференцировку в клетки хрусталиковых волокон. В последней модели клетки эпителия хрусталиков предупреждаются от вступления в дифференцировку в хрусталиковые волокна и экватор может освобождать эпителиальные клетки хрусталика от этого ингибирования. Сообщалось, что эктопическая дифференцировка хрусталиковых волокон происходит, когда структура эпителия хрусталика нарушена. Вторичные катаракты также известны как помутнение задней капсулы (posterior capsular opacifications (PCOs)), иллюстрируют этот процесс (Wormstone 2002). PCOs являются наиболее частыми осложнениями хирургии катаракт. Хирургия катаракт обычно извлекает клетки хрусталика из капсулы хрусталика и имплантирует внутрь глаза хрусталики для восстановления зрения. Очевидно, что хирургия катаракт приводит к реакции заживления раны в хрусталике. Хрусталиковые эпителиальные клетки, оставшиеся в капсуле хрусталика пролиферируют, мигрируют как при эпителиально-мезенхимном переходе (EMT), чтобы стать фибробластичными клетками и в некоторых случаях подвергаются регенерации хрусталиковых волокон, приводя к образованию Elschnig's pearl и Sommerring's ring (Saika 2004). Эти процессы вносят основной вклад в PCO (Fig. 6).

Figure 6.Posterior capsular opacification.

Transforming growth factor-β играет центральную роль в фиброзного типа PCO. TGF-β two выявляется в aqueous и vitreous humors (Connor et al. 1989; Jampel et al. 1990) (Fig. 5D). Воздействие TGF-β на эпителий хрусталика приводит к коллапсу эпителиальной структуры, индуцируя экспрессию мезенхимного маркера, α -SMA и поведение клеток как при EMT, характерное для фиброзных PCO (Liu et al. 1994; Hales et al. 1995, 1997). Сообщалось, что ядерная транслокация Smad3 и Smad4 происходит в клетках хрусталикового эпителия во время репарации ран после повреждения (Saika et al. 2001, 2002), и что Smad3 обусловливает TGF-β -обеспечиваемый, EMT-подобные фенотипы в хрусталиковом эпителии поле повреждения (Saika et al. 2004b). Более того, воздействие антагонистов Smad2/3 таких как Smad7, BMP7, Id2 и Id3, супрессирует повреждением вызываемый EMT в эпителии хрусталика (Saika et al. 2004a, 2006). Эти данные подтверждают, что повреждения эпителия хрусталика или передней капсулы вызывают фиброзные PCO-подобные дефекты путем активации TGF-β в переходной зоне TGF-β активрует E3-ubiqutin лигазу, anaphase promoting complex (APC/C), которые в свою очередь деградируют фактор, ингибирующий дифференцировку клеток хрусталиковых волокон, SnoN, посредством активации ubiquitin протеосомной системы (Wuet al. 2007). В самом деле протеосомный ингибитор, lactacystin, ингибирует TGF-β -зависимый EMT в хрусталике (Hosler et al. 2006). Мы также сообщили, что дифференцировка клеток хрусталиковых волокон ингибируется у мутантных psmd6 рыбок данио, у которых ubiquitin-протеосомная активность снижена. Ингибирование APC/C также вызывает сходные дефекты в дифференцировке клеток хрусталиковых волокон у рыбок данио (Imai et al. 2010). Эти данные подтверждают, что пространственная регуляция передачи сигналов TGF-β является компонентом молекулярного переключения от пролиферации к дифференцировке на экваторе хрусталика. Экспрессия SnoN в эпителии хрусталика (Wu et al. 2007) подтверждает некий механизм, который постоянно супрессирует передачу сигналов TGF-β в эпителии хрусталика.
Platelet-derived growth factor receptor α (PDGFα) экспрессируется в хрусталиковом эпителии. Его лиганд, PDGF-A, экспрессируется в радужке, цилиарном теле и роговице, тогда как PDGF-B экспрессируется в радужке, цилиарном теле и сосудистых клетках, окружающих хрусталик (Reneker & Overbeek 1996). Эктопическая экспрессия PDGF-A активирует пролиферацию эпителиальных клеток хрусталика путем усиления экспрессии регуляторов клеточного цикла, cyclin A и cyclin D2, приводя к образованию многих слоёв, напоминающих дефекты хрусталиков при PCO. Интересно, что маркер клеток хрусталиковых волокон, β -crystallin, экспрессируется также во множественных слоях эпителия хрусталика (Reneker & Overbeek 1996). Это наблюдение подкрепляет возможность того, что нарушения эпителия хрусталика вызывает эктопическую дифференцировку клеток хрусталиковых волокон.
Белки семейства интегринов обеспечивают взаимодействие между клетками и внеклеточным матриксом (ECM). Они подразделяются на α and β подтипы, и действуют в виде гетеродимеров с α и β подтипами. Комбинация α и β подтипов определяет специфичность взаимодействия между интегриновыми комплексами и ECM. Некоторые интегриновые белки экспрессируются в хрусталике (Walker & Menko 2009). β1 интегрин экспрессируется в хрусталике, а условный нокдаун β1 интегрина у мыши дезорганизует эпителий хрусталика, при этом усиливается экспрессия α -SMA и индуцируется эктопическая экспрессия маркеров клеток хрусталиковых волокон, Prox1, c-Maf, β -crystallin (Simirskii et al. 2007). β1 интегрин необходим для структурной целостности эпителия хрусталика, это, скорее всего, предупреждает дифференцировку клеток хрусталиковых волокон. α5/ β1 интегриновый комплексуется с fibronectin. TGF-β2 вызывает перераспределение α5 интегрина из фокальных адгезий в распределение в виде диффузного паттерна (Marcantonio & Reddan 2004), подтверждая связь между TGF-β2-обусловленным PCO и дисфункцией α5/ β1 интегрина. Интегриновые комплексы α3/ β1 и α6/ β1 взаимодействуют с laminin. Ни нокдаун одиночных α3 или α6 интегринов не вызывает дефектов в развитии хрусталика, но двойной нокдаун α3 и α6 интегрина нарушает эпителий хрусталика, подтверждая, что laminin-зависимая адгезия клеток необходима для образования хрусталикового эпителия (De Arcangelis et al. 1999; Wederell & de Iongh 2006).
Клеточная адгезивная молекула, E-cadherin (cdh1) экспрессируется исключительно в эпителии хрусталика, тогда как N-cadherin (cdh2) экспрессируется по всему хрусталику (Takeichi 1988; Xuet al. 2002; Pontoriero et al. 2009). N-cadherin-обусловленная адгезия является функциональной только в клетках хрусталиковых волокон (Leonard et al. 2011). Нокдаун E-cadherin приводит к дезорганизации хрусталикового эпителия, сопровождаемой усилением экспрессии α -SMA (Pontorieroet al. 2009). Эти данные подтверждают, что подавление E-cadherin вызывает EMT-подобные дефекты. Все случаи E-cadherin, PDGF и integrin демонстрируют важность структурной целостности хрусталикового эпителия путем супрессии EMT и дифференцировки хрусталиковых волокон. На будущее важно выяснить, вызывает ли нарушение хрусталикового эпителия дифференцировку клеток хрусталиковых волокон путем активации передачи сигналов TGF-β

Future directions of the lens research


Здесь мы рассмотрели внутренние и внешние факторы, предоставляющие информацию о механизмах, которые управляют клеточной пролиферацией и клеточной дифференцировкой на экваторе. Хотя молекулярные механизмы остаются не выясненными, следующим важным направлением является, как регулируется скорость роста хрусталика. Скорость роста хрусталиков зависит от того, как много эпителиальных клеток хрусталика проходит через экватор и вступает в дифференцировку в клетки хрусталиковых волокон в данный период. Т.к. хрусталики фокусируют зрительные картины на фоторецепторы сетчатки, размер хрусталика д. быть сравним с размером глазного бокала. Сообщалось, что в сферических хрусталиках рыб фокальная длина хрусталика (от центра хрусталика до поверхности сетчатки) составляет 2.55 радиуса хрусталика, "Matthiessen's ratio" (Nicol 1989). Т.о., должен существовать некий механизм, который уравновешивает скорость роста хрусталика и сетчатки у рыб. Сообщалось, что glucagon-экспрессирующие ретинальные нейроны, наз. Bullwhip клетками рыхло расположены во внутреннем слое нейральной сетчатки и испускают очень тонкие отростки к ретинальной CMZ. Электрическая активность сетчатки, связанная с фокусом аккомодации, модулирует уровень glucagon, секретируемого Bullwhip клетками, супрессируя впоследствии пролиферацию ретинальных CMZ клеток (Fischer et al. 2005, 2008). Однако всё ещё неясно, модулируется ли рост эпителиальных клеток хрусталика в ответ на defocus или hyper focus в сетчатке. Если это так, то каков механизм? Понимание молекулярного аппарата на экваторе хрусталика позволит нам изучить вопрос более глубоко.
Упомянутые выше отличия в морфологии хрусталика. Различия в рисунке швов могут коррелировать с тем, как хрусталик становится элипсоидным. Однако неизвестно, как достигаются различия в форме хрусталиков. Рыбы четырехглазки, Anableps, это активные рыбы, плавающие непосредственно под поверхностью воды. Глаза подразделяются водным мениском; при этом верхняя половина воздушная, а нижняя половина водная. Две горизонтальные створки радужки пересекают глаз на уровне воды, образуя две отдельные апертуры зрачков. Дорсальная часть сетчатки получает изображения от нижнего водного поля, а вентральная часть сетчатки от воздушного поля. С эволюционной точки зрения рыбы четырехглазки интересны, поскольку они имеют овальные хрусталики с более острым изгибом в водной визуальной оси и более уплощенным изгибом в воздушной визуальной оси (Nicol 1989; Land 2012). Интересно бы проверить, как модифицируется скорость дифференцировки клеток хрусталиковых волокон, чтобы достичь овальной формы. Как только мы поймем механизм, координирующий пролиферацию клеток эпителия хрусталика и дифференцировку клеток хрусталиковых волокон у модельных животных, таких как рыбки данио и мыши, мы окажемся способными ответить на интересующий вопрос.