Посещений:
ЗАЧАТКИ КОНЕЧНОСТЕЙ

GATA6 критический регулятор Shh

GATA6 Is a Crucial Regulator of Shh in the Limb Bud
• Elena Kozhemyakina, • Andreia Ionescu, • Andrew B. Lassar
PLoS Genet 10(1): e1004072. doi:10.1371/journal.pgen.1004072

In the limb bud, patterning along the anterior-posterior (A-P) axis is controlled by Sonic Hedgehog (Shh), a signaling molecule secreted by the "Zone of Polarizing Activity", an organizer tissue located in the posterior margin of the limb bud. We have found that the transcription factors GATA4 and GATA6, which are key regulators of cell identity, are expressed in an anterior to posterior gradient in the early limb bud, raising the possibility that GATA transcription factors may play an additional role in patterning this tissue. While both GATA4 and GATA6 are expressed in an A-P gradient in the forelimb buds, the hindlimb buds principally express GATA6 in an A-P gradient. Thus, to specifically examine the role of GATA6 in limb patterning we generated Prx1-Cre; GATA6fl/fl mice, which conditionally delete GATA6 from their developing limb buds. We found that these animals display ectopic expression of both Shh and its transcriptional targets specifically in the anterior mesenchyme of the hindlimb buds. Loss of GATA6 in the developing limbs results in the formation of preaxial polydactyly in the hindlimbs. Conversely, forced expression of GATA6 throughout the limb bud represses expression of Shh and results in hypomorphic limbs. We have found that GATA6 can bind to chromatin (isolated from limb buds) encoding either Shh or Gli1 regulatory elements that drive expression of these genes in this tissue, and demonstrated that GATA6 works synergistically with FOG co-factors to repress expression of luciferase reporters driven by these sequences. Most significantly, we have found that conditional loss of Shh in limb buds lacking GATA6 prevents development of hindlimb polydactyly in these compound mutant embryos, indicating that GATA6 expression in the anterior region of the limb bud blocks hindlimb polydactyly by repressing ectopic expression of Shh.


Рисунки к статье

В зачатке конечности формирование паттерна вдоль переднезадней (A-P) оси (т.e., от большого пальца к мизинцу) контролируется с помощью "Зоны Поляризующей активности" (ZPA), ткани-организатора, расположенной на заднем краю зачатка конечности. Sonic Hedgehog (Shh) - это сигнальная молекула, продуцируемая ZPA и важная для корректного роста и формирования паттерна конечностей позвоночных [1], [2]. Делеция Shh из генома мыши приводит к тяжелому фенотипическому отклонению с потерей всех пальцев на передних и задних конечностях за исключением самого переднего пальца [3]. Shh, продуцируемый ZPA, поддерживает экспрессию членов семейства Fibroblast Growth Factor (FGF) в Apical Ectodermal Ridge (AER), в эпителиальном сигнальном центре, идущем вдоль дистального кончика зачатка конечности (for rev. [4]). Это вызывается за счёт индукции экспрессии Grem1 в мезенхиме зачатка конечности, который в свою очередь противодействует передаче сигналов BMP, репрессора экспрессии FGF в AER (rev. [4], [5]). Пространственный градиент Shh, с наивысшим уровнем Shh в заднем регионе мезенхимы зачатка конечности и самый низкий в наиболее переднем регионе, абсолютно необходим для правильного формирования паттерна конечностей вдоль переднезадней оси.
У позвоночных передача сигналов Hedgehog трансдуцируется с помощью транскрипционных факторов Gli1, Gli2 и Gli3 (rev. [6]). В отсутствие передачи сигналов Hedgehog, Gli3-полной длины (FL) (который является слабым активатором транскрипции) эффективно преобразуется с помощью ubiquitin-зависимого протеолиза, давая мощный транскрипционный репрессор наз. Gli3R [7]. Кроме того, в отсутствие передачи сигналов hedgehog, Gli2-FL обнаруживает также короткий период полужизни, также обусловленный ubiquitin-зависимым протеолизом [8], [9]. Когда hedgehog лиганды соединяются с трансмембранными белками Patched1/2 (Ptc1/2), это приводит к транслокации трансмембранного белка smoothened в основание первичной реснички [10]. Локализация smoothened в первичной ресничке блокирует продукцию Gli3R, и приводит в результате к стабилизации и Gli3FL и Gli2FL [11]. В отсутствие продукции Gli3R Gli3FL и Gli2FL вызывают экспрессию чувствительных к hedgehog генов, которые включают Gli1.
Высокий сзади и низкий спереди градиент Shh в зачатке конечности создает пространственный градиент Gli3R, этом самые низкие уровни Gli3R оказываются в задней части зачатка конечности (где передача сигналов Shh наивысшая) и к самым высоким уровням Gli3R в передней части зачатка конечности (где передача сигналов Shh низкая; rev. [5]). Создание этого градиента Gli3R в конечности является критическим для спецификации собственно количества и паттерна пальцев. Gli3-/- мыши обнаруживают полидактилию (т.e., избыток пальцев;[12], [13]), т.к. мыши созданы, чтобы экспрессировать только мутантную форму Gli3FL, которая не может быть преобразована, чтобы давать Gli3R (Gli3P1-4/P1-4 мыши; [14]).Как у Gli3-/-, так и Gli3P1-4/P1-4 мышей экспрессия Shh и Grem1 аберрантно индуцируется в переднем регионе зачатка конечности, приводя к передней экспансии экспрессии FGF4 в AER [12], [13], [14]. Т.о., продукция Gli3R в переднем регионе зачатка конечности необходима, чтобы блокировать аберрантную экспрессию Shh и Grem1 в передней мезенхиме зачатков конечностей и ассоциированную с этим экспансию экспрессии FGF4 в AER. Следствием эктопической экспрессии Shh в передней мезенхиме зачатков конечностей, и последующая передняя экспансия экспрессии FGF4 в AER является полидактилия [12], [13], [14].
Преаксиальная полидактилия (тип полидактилии с избыточными пальцами, образующимися в переднем регионе конечности) является часто возникающей аномалией, при которой асимметрия конечностей нарушается из-за формирования эктопической ZPA в передней части зачатка конечности. Преаксиальная полидактилия у мышей и людей имеет ряд генетических причин, при этом наиболее распространенными являются мутации дальнодействующего, специфичного для конечностей гена энхансера Shh, вызывающие эктопическую экспрессию Shh в передней мезенхиме зачатка конечности [15], [16], [17], [18]. Кроме того, пониженные уровни транскрипционных факторов или Twist1 или Alx4, оба из которых экспрессируются в передней мезенхиме зачатка конечности, где они репрессируют эктопическую экспрессию Shh [19], [20], [21], [22], могут вызывать преаксиальную полидактилию. Повышенные уровни транскрипционного фактора Hand2, который, как известно, способствует экспрессии Shh в мезенхиме задней части зачатка конечности, может также вызывать полидактилию [23], [24].
В данном исследовании мы отметили, что GATA4 и GATA6 экспрессируются в виде переднезаднего градиента в зачатках передних конечностей (т.e., высокие уровни впереди и низкие сзади), что зачатки задних конечностей принципиально экспрессируют GATA6 в виде A-P градиента. Эти паттерны экспрессии открывают возможность, что GATA4 и GATA6 могут играть критическую роль в становлении переднезаднего морфогенетического поля внутри развивающегося зачатка конечности. В подтверждение этого мнения мы установили, что условная делеция GATA6 в зачатках конечностей мыши приводит к эктопической экспрессии Shh и его генов мишеней специфически в передней мезенхиме зачатков задних конечностей, вызывая преаксиальную полидактилию задних конечностей. Напротив, избыточная экспрессия трансгена GATA6 зачатках передних и задних конечностей репрессировала экспрессию Shh и его генов мишеней, вызывая дефекты формирования А-Р паттерна и гипоморфные конечности. Мы идентифицировали консервативные сайты связывания GATA6 в регуляторных регионах генов Gli1 и Shh, которые взаимодействуют с GATA6 в тканях зачатков конечностей, что подтверждено с помощью IP хроматина. Более того, мы установили, что GATA6 может репрессировать экспрессию репортерных генов, управляемых с помощью этих последовательностей. Мы установили, что условная потеря Shh в зачатках конечностей, лишенных GATA6 предупреждает образование полидактилии задних конечностей у этих компаундных мутантных эмбрионов, указывая, что экспрессия GATA6 в переднем регионе зачатка конечности блокирует полидактилию задних конечностей, репрессируя эктопическую экспрессию Shh. установлено, что GATA6 является ещё одним критическим транскрипционным регулятором передачи сигналов Shh в зачатках конечностей.

Discussion


GATA6 plays a crucial role in repressing ectopic expression of Shh in the anterior mesenchyme of the hindlimb bud


Мы установили, что GATA4 и GATA6 преимущественно экспрессируются в переднем регионе мезенхимы развивающихся зачатков конечностей. В то время как оба фактора GATA экспрессируются в виде A-P градиента в зачатках передних конечностей (т.e., высокий спереди/низкий сзади), зачатки задних конечностей преимущественно экспрессируют GATA6 в виде A-P градиента. Условная потеря GATA6 в зачатках конечностей приводит к эктопической экспрессии генов мишеней для Shh и Gli3 таких как Gli1, Ptc1 и Grem1, специфически в передней мезенхиме зачатков задних конечностей. Кроме того, потеря GATA6 в развивающихся конечностях приводит к образованию преаксиальной полидактилии задних конечностей. Напротив, комбинированная потеря Shh и GATA6 в зачатках конечностей блокирует как эктопическую экспрессию Gli1 в передней мезенхиме зачатков задних конечностей, так и последующее образование полидактилии задних конечностей, индуцируемой потерей GATA6. Эти находки показывают, что GATA6 играет критическую роль в репрессии эктопической экспрессии Shh в передней мезенхиме зачатков задних конечностей (shown schematically in Figure 7).

< img src="http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1004072.g007/originalimage"> Figure 7. A model for GATA6 action in the anterior region of developing hindlimb buds. GATA6 is expressed in the anterior portion of the developing mouse hindlimb bud (displayed in top figures), and specifically represses polydactyly (PD) in the hindlimb by directly blocking anterior expression of Shh (most likely in a FOG-dependent fashion), and thus represses ectopic expression of both direct Shh transcriptional targets (Gli1 and Grem1) in anterior limb bud mesenchyme and indirect targets (FGF4/8) in the anterior AER. In hindlimb buds engineered to lack GATA6 (displayed in bottom figures), ectopic expression of Shh in the anterior mesenchyme induces expression of both Gli2/3 FL and Gli1, which activate expression of the BMP antagonist Grem1, which in turn derepresses expression of FGF4/8 in the anterior region of the apical ectodermal ridge. Thus, as a consequence of deletion of GATA6 in Prx1-Cre; GATA6fl/fl animals, the hindlimbs of these animals display preaxial polydactyly. Expressed genes are indicated by black font; knocked-out or repressed genes are indicated by grey font. doi:10.1371/journal.pgen.1004072.g007
У мышей, единственный палец, не нуждающийся в передаче сигналов Shh (палец 1), имеет две фаланги, тогда как те, что нуждаются в Shh для своего образования (пальцы 2-5) имеют три фаланги [12]. Мы наблюдали, что доза Shh влияет на количество фаланг, присутствующих в дополнительных пальцах в задних конечностях, лишенных GATA6; в то время как ~93% добавочных пальцев в задних конечностях на ст. P0 у Prx1-Cre; GATA6fl/fl; Shh+/+ мышей имели три фаланги (остальные две фаланги), только ~70% добавочных пальцев в задних конечностях на ст. P0 у Prx1-Cre; GATA6fl/fl; Shh+/-мышей имели три фаланги. Эти результаты подтверждают, что доза эктопического Shh контролирует не только образование, но и также качественные особенности добавочных пальцев, которые образуются в задних конечностях, лишенных GATA6.
В то время как потеря GATA6 в развивающихся конечностях индуцирует эктопическую экспрессию Shh и транскрипционных мишеней для hedgehog уникальную для задних конечностей, принудительная экспрессия GATA6 по всей мезенхиме зачатка конечности репрессирует экспрессию Shh и его мишеней в зачатках передних и задних конечностей. Из-за одновременной экспрессии GATA факторы часто обнаруживают перекрывание функций in vivo (rev. [51]), это, по-видимому, объясняет, что GATA4 и GATA6, преимущественно экспрессируется в передней мезенхиме зачатков передних конечностей (Figure 1A), могут чрезмерно блокировать переднюю эктопическую экспрессию Shh в этой структуре.

GATA6 works together with FOG co-factors to directly repress the expression of the Shh limb bud enhancer and the Gli1 promoter


Как GATA6 репрессирует экспрессию Shh и hedgehog-индуцибельных генов в передней мезенхиме зачатка конечности? Мы установили, что GATA6 соединяется с хроматином, кодирующим Gli1 промотор (чувствительный к сигналам Shh) или с энхансером Shh, специфичным для зачатков конечностей (который управляет специфичной для зачатков конечностей экспрессией гена Shh), в зачатках конечностей трансгенных эмбрионов мышей, экспрессирующих экзогенный GATA6. Одновременная трансфекция репортеров luciferase, репрессирующих экспрессию GATA6, управляется с помощью любой из этих последовательностей. Интересно, что GATA6-обусловленная репрессия NIH3T3 клеток нуждается в одновременной трансфекции транскрипционного ко-фактора FOG2, это, по-видимому, отражает низкие уровни эндогенной экспрессии FOG в этой линии клеток. В самом деле FOG ко-факторы, которые, как известно, соединяются с транскрипционными ко-репрессорами NuRD и CtBP (rev. [45]), могут быть сходными скорость лимитирующими для экзогенных GATA6, чтобы репрессировать экспрессию Shh, Grem1 и Gli1 в зачатке конечности, т.к. мы установили, что эти предполагаемые мишени для GATA6 всё ещё экспрессируются на низких, но обнаружимых уровнях в зачатках конечностей, запрограммированных экспрессировать высокие количества экзогенных GATA6 (Figures 3A and 3B). Очевидно, что поскольку GATA6 может соединяться с законсервированной проксимальной последовательностью промотора Gli1 (как это продемонстрировано с помощью EMSA и ChIP зачатках конечностей) и репрессировать экспрессию luciferase репортера, управляемого с помощью этой регуляторной последовательности, то потеря GATA6 в отсутствие Shh не достаточна, чтобы возобновить экспрессию Gli1 в переднем регионе зачатков задних конечностей. Эта находка согласуется с предыдущей работой, показавшей, что экспрессия Gli1 нуждается в функции Gli2/3 FL активатора (see for instance [52], [53]), и подтверждает, что экспрессия Gli1 в переднем домене зачатков задних конечностей может быть репрессирована с помощью перекрывающихся механизмов (т.e., Gli3R и GATA6 действующих параллельно). Кроме того, поскольку Gli1 не нужен, чтобы вызывать фенотип полидактилии в зачатках задних конечностей, лишенных GATA6 (т.e., у Prx1-Cre; GATA6f/f; Gli1-/- мышей), это свидетельствует против важной роли для Shh-увеличения экспрессии Gli1 в вызывании этого фенотипа.
Интересно, что мутации в предполагаемом сайте связывания GATA (GGATA (second A to G mutation)), расположенном в энхансере Shh зачатка конечности (т.e., в ZRS гомологичном регионе), были идентифицированы в семействе, имеющем аутосомную доминантную преаксиальную полидактилию (Belgian 2; [16]). Однако по нашему мнению этот предполагаемый сайт связывания GATA не обладает достоверным взаимодействием с in vitro транслируемым GATA6 при EMSA анализе (Figure S4G), это согласуется со способом связывания in vitro, показывающим, что GATA6 преимущественно соединяется с (A/C/T) GATAв противовес GGATA [54]. Вызывают ли мутации в сайте связывания GATA6 в энхансере ZRS мыши или человека полидактилию, пока не установлено, это не исключает роли в регуляции GATA энхансера ZRS. Кроме того, возможно, что GATA6 блокирует эктопическую экспрессию не только непосредственно Shh, но и также др. гены мишени для Shh в зачатке конечности (в дополнение к Gli1), параллельно с Gli3R. В этом отношении было бы интересно определить соединяется ли GATA6 сходным образом с и репрессирует активность регуляторных регионов, управляющих экспрессией Grem1 в зачатках конечностей [55]. Наконец, наше исследование не исключает возможность, что GATA6 выполняет и дополнительные роли в формировании паттерна конечностей, независимо от репрессии экспрессии Shh и его нижестоящих мишеней.