Закладка основой оси конечностей позвоночных является примером посегментной спецификации растущей структуры. Зачаток конечности возникает из латеральной пластинки в виде выпячивания из мезенхимных клеток, заключенных в эктодермальную оболочку, который прогрессивно растет на боку эмбриона. Конечности позвоночных закладывают три основные проксимо-дистальные (PD) сегменты (верхняя часть рук/ног или стилопод, нижняя часть рук/ног или zeugopod, и кисти/стопы или autopod) в проксимо-дистальной последовательности. Недифференцированный регион на дистальном конце зачатка конечности содержит клетки, которые дифференцируются во всё боле и более дистальные сегменты покак не будут сгенерированы все структуры (rev. Tabin and Wolpert, 2007). Модель 'фронта дифференцировки' (Tabin and Wolpert, 2007) предполагает, что данный сегмент продуцируется корректно только, если преспецифицировано достаточное количество клеток, чтобы сформировать сегмент, оставляя недифференцированным дистальный регион и заложить ось конечности (Galloway et al., 2009).

На более поздней стадии зачатка конечности, каждый из PD сегментов экспрессирует специфические гомеобоксные гены; stylopod экспрессирует Meis1 и Meis2, zeugopod Hoxa11 , а autopod Hoxa13 (Mercader et al., 2009; Nelson et al., 1996; Yokouchi et al., 1991). Однако экспрессия этих так наз. PD маркеров является динамичной и последовательной во время ранних стадий. Первоначально, Meis1/2 экспрессируются по всему зачатку конечности, а затем подавляется в дистальном регионе, где происходит активация Hoxa11. Позднее активируется экспрессия Hoxa13 в небольшом задне-дистальном домене и затем распространяется вдоль AP и PD осей, перекрываясь некоторое время с экспрессией Hoxa11; наконец, Hoxa11 подавляется в дистальной части. Время и степень транскрипционной активации и репрессии в этом наборе генов делает возможной последующую степень дистализации конечности (Tabin and Wolpert, 2007), поэтому техника гибридизации in situ обычно используется для выяснения их экспрессии в разных экспериментах.

Способные к диффузии молекулы играют ключевую роль во время развития конечностей. Пул дистальных недифференцированных клеток, ответственный за генерацию конечности, поддерживается с помощью сигналов fibroblast growth factor (FGF) и Wnt, продуцируемых дистальной эпителиальной структурой, наз. apical ectodermal ridge (AER) (ten Berge et al., 2008). Своё участие сомиты и lateral plate mesoderm (LPM) до появления зачатка экспрессируют высокие уровни RALDH2, одного из энзимов, необходимых для синтеза retinoic acid (RA) из витамина А, приводя высокому уровню передачи сигналов RA внутри всего зачатка ранней конечности (Doll? et al., 2010; Mic et al., 2004). После индукции конечности, синтез RA прекращается в зачатке конечности и начинается деградация RA , за счет начала активации в его дистальном регионе деградирующего RA энзима CYP26B1 (Yashiro et al., 2004). Комбинация роста зачатка конечности и обратное распределение синтеза и деградации RA приводит к PD градиенту передачи сигналов RA (Mic et al., 2004; Yashiro et al., 2004). Хотя широко распространено мнение, что сигналы AER, особенно FGFs, обладают дистализирующим эффектом, в основном благодаря ингибированию проксимального влияния с фланга (flank) (Mariani et al., 2008; Mercader et al., 2000; Rosell?-Diez et al., 2011; Rosell?-Diez and Torres, 2011), значение градиента передачи сигналов RA остается спорным. Некоторые исследования на эмбрионах кур и мышей показывают, что RA с фланга оказывает проксимализующие эффекты на конечность, которым противостоит AER-FGFs (Cooper et al., 2011; Mariani et al., 2008; Mercader et al., 2000; Rosell?-Diez et al., 2011). Эти наблюдения подтверждают модель двух сигналов (Mercader et al., 2000), согласно которой спецификация PD зависит от противоположного действия проксимальных сигналов RA и дистальных сигналов FGF. Однако, кажущаяся нормальной экспрессия гена Meis и формирование PD паттерна задних конечностей у мышей, дефицитных по энзиму RDH10 (часть пути синтеза RA) противоречит мнению, что RA важным сигналом для формирование паттерна конечности (Cunningham et al., 2013). Дальнейшие исследования, однако показали, что мутантые мыши, использованные в этом исследовании (T-rex) несут гипоморфный аллель, которые делает возможным развитие эмбриона вплоть до дня эмбриогенеза (E) 13-E14 (Sandell et al., 2012; Sandell et al., 2007), тогда как Raldh2-нулевые эмбрионы (которые, как полагают, имеют больший дефицит RA) достигают только ст. E9 (Niederreither et al., 1999). Следовательно, T-rex мутанты фактически содержат функционаольные уровни RA и их законность для изучения роли RA в развитии конечностей спорна(see also Discussion).

Итак, хотя очевидно, что необходимы некоторы дальнейшие исследования, модель двух сигналов лучше всего соответствует накопленным экспериментальным данным и RA остается наилучшим кандидатом на роль сигнала формирования проксимального паттерна. Однако, хотя этот механизм безусловно контролирует ранний stylopod-zeugopod переход, его участие в дальнейшем PD переходе менее исследовано.

DISCUSSION

RA and limb development

Здесь мы сообщаем, что баланс передачи сигналов RA/FGF, помимо становления первого для зачатка конечности PD перехода от stylopod к zeugopod (Cooper et al., 2011; Rosell?-Diez et al., 2011), также регулирует второй переход от zeugopod к autopod. Однако, как упоминалось выше, роль RA в формировании PD паттерна конечности спона из-за характеристик мутантов мышей, дефицитных в отношении энзимов синтеза RA Raldh2 или Rdh10 (Cunningham et al., 2013; Zhao et al., 2009b). Эти исследования показали, что заднии конечности (но не передние) обнаруживают нормальное формирование паттерна (включая экспрессию Meis) в ситуациях, при которых передача сигналов RA не выявляется с помощью генетически закодированного RA репортера (RARE-lacZ), представляя дело так, что RA необязательна для формирования паттерна конечностей или экспрессии Meis. Raldh2 мутанты, однако, нуждались в воздействии, по крайней мере, кратковременном пульсовом RA, чтобы удержать эмбрионы от гибели перед стадией зачатков конечностей (Zhao et al., 2009b), поэтому их конечности образуются не без RA. В самом деле, предыдущие эксперименты по восстановлению, в которых применялась RA на разных стадиях и в разных дозах, подтверждает особую чувствительность проксимальных сегментов конечности и экспрессии гена Meis к доступности RA (Niederreither et al., 2002). Относительно анализа Rdh10, поскольку Rdh10-нулевые мутанты погибают приблизительно на ст. E10.5-E12.5, то модель, анализируемая Cunningham et al. (Cunningham et al., 2013) является гипоморфным мутантом, наз. T-Rex, летальная фаза которого приходится на ст. E13.5-E14.5 (Rhinn et al., 2011; Sandell et al., 2012), и , следовательно, T-Rex мутанты содержат значительные количества функциональной RA, которые не выявляются с помощью репортера. Имеет отношение к этому расхождению чувствительность метода определения RA, призванная откалибровать репортер (Cunningham et al., 2013), были проведены in vitro, воздействуя на целые эмбрионы RA, ситуация, отличная от in vivo доставки RA delivery. Итак, модель, ставящая под вопрос роль RA в формировании паттерна конечностей, фактически содержит низкие, но функциональные уровни RA, это препятсвует какому-либо четкому решению этого вопроса.

Простейшим объяснением этих кажущихся конфликтными результатов, что эндогенные гены формирования паттерна конечностей (напр. Meis) имеют более низкий порог активации in vivo RA, чем ген репортер. Подтвеждает эту идею то, что граница экспрессии RARE-LacZ в зачатках конечности оказывается более проксимальной (т.e. более близкой к источнику RA), чем гена Meis2 (Yashiro et al., 2004). Эта различная чувствительность должна дозволять RA-обеспечиваемое формирование PD паттерна конечности в отсуствие активации репортера и д. также объяснить противоречивые результаты реакции гена Meis на RA у мыши (Cunningham et al., 2013; Niederreither et al., 2002; Zhao et al., 2009b). В этом сценарии небольшие количества RA, присутствующие у мутантов Raldh2 и Rdh10 д. всё ещё делать возможной некотоую степень PD спецификации (такую как активация экспрессии Meis), указывая на механизм чрезвычайной устойчивости перед лицом крупных вариаций в доступности RA. Поскольку витамин A получается из внешней среды, то разумно предположить, что используется такой помехоустойчивый механизм.

Наконец, хотя проксимолизация PD молекулярного кода у Cyp26b1 мутантов согласуется с моделью двух сигналов, тот факт, что дифференцировка хондроцитов затрагивается в трех сегментах конечности, приводит к формированию очень дисморфных конечностей (Yashiro et al., 2004), иногда интерпретируется как доказательство, что RA фактически является тератогеном для развития конечности и что CYP26B1 необходим для защиты конечностей отего действия (Zhao et al., 2009b). Однако, эффект на дифференцировку хондроцитов безусловно отличается от более позднего эффекта RA, который может быть не отделим от эффекта формирования паттерна за счет односременной элиминации RARγ; это демонстрируется с помощью того факта, что Cyp26b1;RARγ двойные утантные эмбрионы всё ещё обнаруживают проксимолизацию молекулярного кода PD, тогда как дифференцировка хондроцитов в основном восстанавливается (Pennimpede et al., 2010).

Meis genes control spatial distribution of Hoxa13 expression via RA degradation

Эктопическая экспрессия Meis в дистальной части зачатка конечности имеет важные последствия для развития конечности. Механизмы, с помощью которых гены Meis воздействуют на экспрессию PD генов в конечности, однако, нее были описаны. Полученные нами результаты показывают, что MEIS факторы затрагивают деградацию RA, контролируя экспрессию CYP26B1 в зачатке конечности (Fig. 2), и что деградация RA в свою очередь контролирует экспрессию Hoxa13 (Fig. 1). Фактически, репрессия Hoxa13 после эктопической экспрессии Meis2 может быть обращена с помощью воздействия in utero антагониста RA (Fig. 2). Тот факт, что не все дистальные клетки, подвергнутые действию RAA, восстанавливают экспрессию Hoxa13, скорее всего, это объясняется низкой использованной дозой RAA [5 mg/kg против 10 mg/kg в др. исследованиях (e.g. Wendling et al., 2000)]. не использовали более высокие дозы, поскольку по нашему мнению это снижает жизнеспособность эмбрионов, подтверждая, что соотв. промежуток доз (высок, чтобы противодействовать эктопической экспрессии Meis2a, но достаточно низок, чтобы обеспечить выживание эмбрионов) очень низок. Мы не можем однако исключить др. возможное объяснение незавершенности восстановления: что гены Meis влияют на экспрессию Hoxa13 за счет множественных параллельных путей, RA является только одним из них. Отметим тот факт, что эффект MEIS является клеточно автономным, несмотря на действие посредством способного к диффузии сигнала (RA), согласуется с исследованиями, показавшими, что деградация RA с помощью CYP26 энзимов оказывает более определяющую роль, чем диффузия RA на формирование паттерна ткани, скорее всего, из-за различий в кинетике этих двух процессов (Hernandez et al., 2007; Probst et al., 2011; White et al., 2007).

Наши результаты показали, что хотя домен экспрессии Meis1/2 никогда не перекрывается в доменом Hoxa13 (Mercader et al., 2009), регуляция Cyp26b1 с помощью генов Meis может вносить вклад в становление PD распределения RA, которое затем будет влиять на позиционирование Hoxa11-Hoxa13 перехода, даже если этот переход осуществляется, когда экспрессия Meis в этом регионе уже подавлена.

Time is also necessary for Hoxa13 expression

Отсутствуют исследования, показывающие преждевременную экспрессию Hoxa13 после физических, химических или генетических манипуляций на зачатках конечностей. Мы подтвердили эту устойчивость к преждевременной экспрессии, путем преждевременного воздействия условий дистальной передачи сигналов на ранний зачаток конечности и наблюдали, что Hoxa13 не может быть активирован прежевременно (Fig. 3). Это отсутствие реакции не связано с проблемами используемых воздействий, т.к. они были способны расширять или эктопически индуцировать экспрессию Hoxa13, как только оказывался существующим эндогенный домен (Fig. 3B,D). Примечательно, что когда были предоставлены дистальные сигналы, то эктопическая активация Hoxa13 имела место полностью проксимально, хотя ограничивалась задним регионом (Fig. 3D). Это ограничение эктопической активации задней частью может быть не связано с передачей сигналов SHH, т.к. SHH добавлялся экзогенно. Мы полагаем, что активация Hoxa13 может нуждаться в дополнительных факторах, присутствующих в задней мезенхиме или высвобождаемых задней эктодермой, это действительно было описано как сигнальный центр, испытывающий влияние со стороны экспрессии задней мезенхимы (Nissim et al., 2007).

Эти результаты показывают, что ранний зачаток конечности не компетентен активировать Hoxa13 (и, по-видимому, всю программу autopod), и что должно пройти время, чтробы клетки конечности стали компетентными. Более того, принимая во внимание, что Hoxa13 может позднее быть активирован актопически в проксимальном регионе, временная компетентность, по-видимому, действительно присутствует в целом зачатке конечности, но кинетика процесса пока неизвестна.

Chromatin opening, not signal integration, controls the timing of Hoxa13 activation

Наши данные подтвердили, что временной механизм не базируется на интеграции передачи сигналов FGF в ходе времени (Fig. 4), кое-что ранее было предположено из-за неспособности избытка FGF активировать Hoxa13 преждевременно (Fig. 3) (Vargesson et al., 2001). Важно, что это не означает, что передача сигналов FGF не необходима для экспрессии Hoxa13 во время нормального развития конечности. В самом деле, мы показали, что передача сигналов FGF необходима, чтобы удерживать передачу сигналов RA вдали от дистальной области, но её роль в основном пермиссивна, но не инструктивна: если передача сигналов RA искусственно блокирована из дистального региона, то временной механизм может действовать и в отсутствие передачи сигналов FGF (Fig. 4).

Альтернативный механизм, который мы исследовали, связан с состоянием хроматина. Было предположено, что регуляция экспрессии HoxD отличается существенно между зачатком конечности [две волны транскрипции, зависимые от взаимодействия Hox локусов с определенными топологическим доменами (Andrey et al., 2013; Montavon et al., 2011)] хвостовой почкой [строгая прогрессивная колинеарная активация, зависимая от прогрессивной элиминации репрессивных гистоновых меток (Soshnikova and Duboule, 2009)]. Имеется даже третий сценарий - базирующийся на экспериментах in vitro, воспроизводящих формирование ростро-каудального паттерна двигательных нейронов в спинном мозге - где элиминация репрессивных гистоновых меток, вместо того, чтобы быть прогрессивной, происходит быстро, domain-wide способом, даже если активация экспрессии Hox является прогрессивной (Mazzoni et al., 2013). Экспрессия HoxA в конечности (т.e. прогрессивная колинеарная активация, особенно от Hoxa10 до Hoxa13) обнаруживает многие сходства с сценарием, предложенным для хвостовой почки или в исследованиях спинного мозга, и мы поэтому тестировали, может ли преждевременное открытие хроматина запускать преждевременную активацию Hoxa13. Одна из гистоновых меток, которая коррелирует с активацией транскрипции Hox является ацетилированный histone 3 lysine 27 (H3K27ac) (Soshnikova and Duboule, 2009) и мы в самом деле обнаружили, то если баланс ацетилирование/деацетилирование гистона склоняется к направлении ацетилирования путем ингибирования активности HDAC в раннем зачатке конечности, то Hoxa13 активируется преждевременно (Fig. 5).Важно, что TSA, применяемый систематически не существенно изменяет нормальное развитие, за исключением незначительно увеличения количества сомитов у эмбрионов мыши в середине беременности (Nervi et al., 2001). В конечности, TSA не вызывает общего усиления экспрессии гена (Zhao et al., 2009a), и мы установили, что он ингибирует ряд маркеров дистальной части конечности, это подтверждает, что эффект на активацию Hoxa13 не связан с неспецифической активацией обычно репрессируемых генов. В зависимости от скелетного фенотипа, тот факт, что zeugopod, а не autopod затрагивается в первую очередь, несмотря на дистальное расположение источника TSA, подтверждает, что преждевременная акивация программы autopod приводит к снижению количества клеток с профилем экспрессии, характерным для zeugopod, пересекающих фрон дифференцировки, и это в конечном счете подвергает риску размер zeugopod. Примечательно, что предыдущее исследование, с использованием TSA на ранних зачатках конечности, не выявило эффекта на формирование паттерна PD (Towers et al., 2008), это очевидное разногласие с нашими результатами. Однако тщательная проверка результатов этого исследования показала, что слабо затронутые экземпляры обнаруживают преимущественное уменьшение zeugopod (Towers et al., 2008), это согласуется с нашими данными и интерпретацией.

Предыдущие исследования регуляции экспрессии Hox с помощью состояния хроматина были сфокусированы на молекулярной чувствительности к метилированию/деметилироанию гистонов - основыных членов Polycomb repressive complex 2 (PRC2) и jumonji-домен содержащих деметилаз - скорее, чем на HDACs (Lan et al., 2007; Schorderet et al., 2013; Williamson et al., 2012). Однако, метилироание и ацетилирование гистонов, как было установлено, взаимозависимо и действует как один путь в некоторых тканях (Kleer et al., 2003; van der Vlag and Otte, 1999), это оправдывает наш подход. Фактически, элиминация PRC2 члена Ezh2 из раннего зачатка конечности затрагивает экспрессию Hoxa13 (помимо др. эффектов) способом, который может быть интерпретирован, как преждевременная передняя экспансия домена (Wyngaarden et al., 2011).

Интересен нерешенный вопрос, как запускается временной механизм? Исследования модельных культур формирования ростро-каудального паттерна спинного мозга показало, что последовательное действие паттерн-формирующих сигналов RA, FGF и Wnts ответственно за прогрессивную активацию экспрессии Hox генов в контексте скачкообразного рельефа гистоновых репрессивных меток (Mazzoni et al., 2013). Далее было предположено, что сигналы, отвественные за активацию паралогов Hox10-Hox13 должзны быть FGFs и growth differentiation factor 11 (GDF11) (Mazzoni et al., 2013), и в самом деле GDF11, как было установлено, эктопически активирует Hoxd11 и Hoxd13 в зачатке конечности, но не Hoxa11 или Hoxa13 (Gamer et al., 2001), снова тем самым подчеркивая различное поведение генов HoxA и HoxD в конечности. В этом отношении заслуживает внимания то, что Hoxa13 единственный Hox ген, который всегда и исключительно экспрессируется в предшественниках autopod (Lu et al., 2008), и поэтому, как полагают, подвергается иной регуляции, чем более широко экспрессирующиеся HoxD гены. Остается возможным, однако, что тот же самый сигнал, постулируемый для запуска переключения между теломерной и центромерной интерактивными конформациями для HoxD локусов, а именно FGFs из AER (Andrey et al., 2013), запускает также активацию HoxA временного механизма, гарантируя связь обоих процессов и , следовательно, надежность развития конечности. Если это так, то необходимо отметить, что только инициальное пульсовое воздействие FGF достаточно для запуска первого PD подразделения, и должно быть обязательным для временного механизма действия, поскольку наши результаты показывают, что после Meis-Hoxa11 перехода, непрерывана передача сигналов FGF боле не нужна, т.к. инструктивные сигналы поддерживают процесс (Fig. 4).

A dual mechanism model of limb PD patterning

Представленные результаты вместе с предыдущими доказательствами (Cooper et al., 2011; Rosell?-Diez et al., 2011), демонстрируют сосуществование двух параллельных механизмов во время формирования PD паттерна конечности: один базируется на сигнальном окружении, а второй базируется на регуляции хроматина (Fig. 6). Зачаток конечности индуцируется как вторичная ось, которая наследует сигнальную среду от LPM, которая обогащена RA (Doll? et al., 2010). Следовательно, когда зачаток конечности начинает расти, Meis гены экспрессируются и специфицируется stylopod (Fig. 6A). В дальнейшем передача сигналов FGF накапливается дистально и RA разбавляется в этом регионе из-за его роста в сторону от фланга, экспрессирующего Raldh2, пока соотношение RA/FGF не снизится ниже первого порога, провоцирующего дистальную активацию Hoxa11 и подавление Meis1/2 (Mercader et al., 2009) (Fig. 6A,B). Дистальные клетки на этой стадии поэтому предназначены стать zeugopod, но их финальная судьба будет закреплена как только они пересекут фронт дифференцировки (Tabin and Wolpert, 2007). Одновременно элиминация активности MEIS из клеток дистальной части конечности позволяет CYP26B1 начать деградацию RA в этих клетках, снижая еще больше уровни RA до достижения пермиссивного порога для активации Hoxa13 (Fig. 6C). Принимая во внимание, что TSA может запускать прежевременную активацию Hoxa13 (Fig. 5), но этого не может RAA (Fig. 3), из этого следует, что пермиссивные сигнальные условия достигаются в дистальном регионе, прежде чем будет запущен базирующийся на хроматине механизм экспрессии Hoxa13 (Fig. 6C). Карта лежащего в основе сигнального порога, следовательно, выявляется только, когда достигается временное принуждение и оба механизма конвергируют, чтобы активировать Hoxa13 (Fig. 6D). Как только начинается экспрессия Hoxa13 форма его домена экспрессии, следовательно, отражает карту сигнала RA в зачатке конечности. Инициальная задняя склонность домена Hoxa13 (Mercader et al., 2009; Nelson et al., 1996;Yokouchi et al., 1991) может быть обусловлена, по крайней мере, двумя не исключающими др. др. возможностями: (1) тот факт, что SHH, высвобождается из заднего региона, усиливает CYP26B1-обусловленную очистку от RA (Probst et al., 2011); и (2) преходящая репрессия Hoxa13 с помощью PRC2 в переднем регионе зачатка конечности, т.к. элиминация Ezh2 из зачатка конечности приводит к экспанссии кпереди раннего домена экспрессии Hoxa13 (Wyngaarden et al., 2011). Наконец, Hoxa13-обеспечиваемя репрессия Hoxa11, затем устанавливает эксклюзивнцю экспрессию Hoxa13 в предшественниках autopod (Fig. 6D).

Zeugopod expansion requires delayed Hoxa13 activation

В предположенной dual модели, задержка активации Hoxa13 важна, поскольку она предоставляет время, необходимое для накопления достаточного количества предшественников zeugopod за пределами фронта дифференцировки, чтобы гарантировать собственно образование zeugopod. Если эта задержка коротка, то модель предсказывает, что основным повреждаемым сегментом будет zeugopod, как фактически и происходит при обработке TSA (Fig. 5), это составляет основу для интерпретации интеркалярных дефектов конечностей у людей.

Предлагаемая модель объясняет и интегрирует основные наблюдения как классических эмбриологических исследований, так и недавних генетических подходов, цель пока неуловимая. Кроме того, открытие эпигенетической регуляции в качестве детерминанта определенной во времени активации Hoxa13 и её интеграции с передачей сигналов, выявляет новый механизм, с помощью которого регуляция хроматином кодирует временную задержку, важную для формирования пространственного паттерна во время эмбрионального развития. Этот механизм может быть важным во время регионализации др. растущих эмбрионаьрных примордиев и объясняет происхождение определенных врожденных дефектов.

Diffusible signals and epigenetic timing cooperate in late proximo-distal limb patterning Alberto Rosell?-D?ez, Carlos G. Arques, Irene Delgado, Giovanna Giovinazzo and Miguel Torres Development. 2014 Apr;141(7):1534-43.

Diffusible signals and epigenetic timing cooperate in late proximo-distal limb patterning
Alberto Rosell?-D?ez, Carlos G. Arques, Irene Delgado, Giovanna Giovinazzo and Miguel Torres
Development. 2014 Apr;141(7):1534-43.