Genetic control of cell differentiation during embryogenesis

Разнообразие типов клеток и органов многоклеточных организмов возникает в результате дифференцировки производных от одиночной тотипотентной клетки, оплодотворенного яйца. Т.к. все клетки развивающегося организма содержат один и тот же геном, то процесс дифференцировки нуждается, чтобы геномы клеток обеспечили разные судьбы в зависимости от транскрипционно активных и неактивных регионов. Эта изменчивость в организации ядра использует модификации хроматина, вызывающие активацию или молчание генов, и контролируется с помощью дифференциально экспрессируемых онтогенетических регуляторов, таких как транскрипционные факторы, которые организованы в gene regulatory networks (GRN). Помимо качественных отличий (т.e., специфичной для типа клеток экспрессии), существуют количественные отличия, такие как уровни экспрессии регуляторов, играющие важную роль в процессах дифференцировки. Это, напр., отражается в том факте, что многие важные транскрипционные факторы обнаруживают фенотипы гапло-недостаточности. Напр., нормальное развитие сердца нуждается в обоих функциональных аллелях кардиальных транскрипционных факторов, кодируемых генами Nkx2-5 (NK2 homeobox 5), Gata4 (GATA binding protein 4) и Tbx5 (T-box 5). Если один из них не функционален или отсутствует, то возникают врожденные нарушения развития сердца [1-3]. Следовательно, развитие жизнеспособного организма не только зависит от аккуратного временного и пространственного контроля активации генов, но и также в некоторых критических онтогенетических регуляторах, в соотв. уровнях экспрессии и активности генов.

Долгое время расшифровка функции индивидуальных важных транскрипционных факторов и хроматин организующих белков привлекали главное внимание биологов развития в попытке понять контроль эмбриональных процессов. Несмотря на определенные успехи, попытки всестороннего понимания механизмов геномного контроля, действующих в индивидуальных клетках и клеточных клонах во время эмбрионального развития всё ещё безуспешны.

ncRNAs as modulators of gene activity

Систематический анализ транскриптома с помощью глубокого секвенирования клеточных линий человека показал, что почти 75% генома человека транскрибируются в первичные транскрипты, но менее 3% генома отвечает за белок кодирующие транскрипты [4]. Т.о., огромное большинство генома млекопитающих кодирует РНК, не кодирующие белки (ncRNAs). Аналогично функциональному разнообразию белков, транскрипты ncRNA чрезвычайно гетерогенны в отношении размера и функции. Некоторые хорошо исследованные классы ncRNAs, включая рРНК, малые ядрышковые РНК (snoRNAs) и tRNAs, как было установлено, играют важные роли в трансляции или сплайсинге мРНК. Более того, короткие молекулы РНК в 21-28 нуклеотидов, такие как miRNAs, siRNAs и PIWI-interacting RNAs (piRNAs), участвуют в транскрипционном или пост-транскрипционном замалчивании РНК и тем самым в тонкой настройке активности генов мишеней на уровне транскрипции. Наконец, многочисленные виды циркулярных РНК (circRNAs) [5], которые экспрессируются зависимым от ткани и стадии развития образом [6] были недавно открыты и, по-видимому, также участвуют в контроле регуляторных сетей. Некоторые из этих circRNAs могут действовать как губки для miRNAs [6].

Re-emergence of a neglected ncRNA species: the long noncoding RNAs

Выдающиеся успехи в технологи секвенирования сделали возможной детекцию транскриптов низкой концентрации при анализе транскриптома генома посредством массивного параллельного секвенирования, это позволило классифицировать ncRNAs в соответствии с уже известными, но не принятыми во внимание. Эти т. наз. long noncoding RNAs (lncRNAs) по определению являются более длинными, чем в 200 нуклеотидов и обладают ограниченным или не обладают потенциалом кодирования белка. Однако, многие lncRNAs ассоциируют с рибосомами и, следовательно, могут обладать потенциалом кодировать короткие пептиды, но до какой степени это действительно происходит, еще предстоит определить [7,8]. Кроме того, некоторые lncRNAs могут обладать двойной ролью, действуя как полной длины транскрипты и как предшественники малых РНК [9]. В целом, lncRNAs обнаруживают тенденцию экспрессироваться на более низком уровне, чем мРНК [4]. Стабильность lncRNAs, как было установлено, лишь слегка снижена по сравнению с мРНК, указывая тем самым, что более имеется более низкий уровень транскрипции [10].

LncRNA гены существуют в разных геномных контекстах. Подобно генам мРНК они могут иметь свои собственные промоторы и регуляторные элементы, удаленные от каких-либо известных локусов генов мРНК. Однако, многие lncRNAs перекрываются с транскриптами мРНК в смысловой и антисмысловой ориентации, или транскрибируются с интронов. Большой субнабор lncRNAs транскрибируется дивергентно (с анти смыслом) из генов, кодирующих мРНК [11], обладая общим промотором и регуляторными элементами с последним, или расположены выше соседнего гена, кодирующего мРНК и транскрибируются в смысловой ориентации с промотора соседа. LncRNAs могут также происходить из энхансеров (eRNAs) как длинные, не подвергшиеся сплайсингу или сплайсированные транскрипты [12,13]. Ряд транскриптов lncRNA экспрессируется у человека и мыши порядка десятков тысяч, если суммировать все онтогенетические и взрослые типы клеток. Однако, хотя количество исследований и баз данных, посвященных lncRNAs увеличивается, хорошо аннотированные базы данных для разных видов, которые интегрируют всю доступную информацию недоступны.

Интересно, что многие lncRNAs, обладают более ограниченным и тканеспецифичным паттерном экспрессии, чем мРНК [14-16]. Как это достигается, пока открытый вопрос. Одним из важных намеков является недавнее исследование, показавшее ассоциацию промоторов тонко контролируемых генов lncRNA с супер-энхансерами, которые очень высоко специфичных для определенных типов клеток [17,18]. Тонкий контроль lncRNAs подтверждает специфические роли в дифференцировке и функции определенных типов клеток. Недавнее сообщение предоставило ряд примеров, продемонстрировавших решающую роль некоторых lncRNAs в эмбриональном развитии и органогенезе (Table 1).

lncRNAs acting in epigenetic control during mammalian development

Многочисленные lncRNAs взаимодействуют с разного типа белками, участвующими в модификациях гистонов, ремоделировании хроматина или метилировании ДНК. В частности, Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), который важен для эмбрионального развития, связывает тысячи ncRNAs, включая многочисленные lncRNAs [19-21]. Эта находка подкрепляет идею, что lncRNAs могут участвовать в доставке PRC2 на специфические контролирующие элементы генов.

Напр., Xist (X-inactivation specific transcript) соединяется с PRC2, вызывая тем самым экстенсивное триметилирование в гистоне 3 лизина 27 (H3K27me3) вдоль Х хромосомы, это сопровождается инактивацией маркированной копии, механизм, необходимый для дозовой компенсации у самок млекопитающих [22]. Некоторые др. lncRNAs, осуществляющие свою функцию путем связывания PRC2, недавно были идентифицированы. Один хорошо известный пример - это Hotair (HOX antisense intergenic RNA), которая регулирует экспрессию генов в кластере HoxD и во многих импринтируемых генах [23]. Потеря Hotair у нулевых мутантных эмбрионов мыши приводит к гомеотическим трансформациями и слияниям запястных элементов в кисти [23]. Др. пример - это Fendrr (fetal-lethal noncoding developmental regulatory RNA). Взаимодействие Fendrr с PRC2 необходимо для соотв. уровней экспрессии её генов мишеней, которые участвуют в контроле развития латеральной мезодермы. Удивительно, два непосредственных гена мишени для Fendrr идентифицированы как Foxf1 (Fork-head-box F1) и Pitx2 (paired-like homeodomain transcription factor 2), являются транскрипционными факторами, которые играют жизненно важную роль в дифференцировке латеральной мезенхимы и обнаруживаются фенотипы гапло-недостаточности у мутантов, экспрессирующих только один функциональный аллель. Доставка PRC2 на промоторы для этих транскрипционных факторов с помощью Fendrr т.о., играет важную роль в тонкой настройке уровней экспрессии этих чувствительных к дозе регуляторов. Генетическое устранение Fendrr транскрипта приводит к уродствам сердца и стенки тела, которые возникают латеральной мезодермы и в конечном итоге к эмбриональной гибели [24,25]. Др. lncRNA важна для спецификации раннего клона сердечных клеток, это Braveheart, которая взаимодействует с компонентом из PRC2, SUZ12 [26]. Braveheart необходима для активации сети генов, которые устанавливают кардиальный клона из предшественников в латеральной мезодерме. Интересно, что Braveheart действует выше Mesp1, транскрипционного регулятора и раннего пионерского фактора клона кардиальных клеток, который в свою очередь может регулировать экспрессию Fendrr на транскрипционном уровне [27]. Следовательно, последние две lncRNAs действуют совместно с PRC2 в регуляторной сети, контролирующей ранний кардиальный клеточный клон (Figure 1A).

HOTTIP (HOXA transcript at the distal tip) был первой lncRNA, обнаружившей взаимодействие с WDR5 (WD repeat domain 5)[28]. Инактивация HOTTIP в фибробластах человека с помощью small hairpin RNAs (shRNAs) уменьшает оккупацию MLL1 (mixed lineage leukemia 1) и WDR5 вблизи transcription start sites (TSS) для кластера генов HOXA, который особенно важен в 5'-регионе этого кластера генов [28]. Это приводит к более низкой экспрессии HOXA генов мишеней из HOTTIP. Вирусом обусловленная инактивация HOTTIP с помощью shRNAs у эмбрионов кур вызывает укорочение дистальных элементов костей в передних конечностях [28]. В последующем исследовании идентифицирован карман для связывания РНК в WDR5, который создает специфический интерфейс для связывания HOTTIP и др. lncRNAs [29]. Заметим, что ES клетки, экспрессирующие мутантную форму WDR5, дефектную по связыванию РНК и неспособны поддерживать самообновление и подвергаются преждевременной дифференцировке в эктодермальные и мезодермальные клоны. Это, по крайней мере,

Table 1. Selection of lncRNAs involved in cell lineage and organ development

частично обусловлено нарушением стабильности мутантного WDR5 белка [29]. Fendrr взаимодействует с PRC2 и WDR5, но происходит ли это в то же самое время неясно, и модифицируются ли мишени для Fendrr посредством взаимодействия с WDR5 неизвестно [22]. lncRNA, которая обнаруживает взаимодействие с WDR5 и модулирует уровни H3K4me3 (histone 3 lysine 4 trimethylation) непосредственно посредством TrxG/Mll (Trithorax group/mixed-lineage Leukemia), это NANCI (Nkx2.1-associated noncoding intergenic RNA) [30]. Она экспрессируется ниже и в том же самом направлении, что и Nkx2.1 (NK2 homeobox 1). Нокдаун in vivo NANCI вызывает снижение экспрессии Nkx2.1, это совпадает со снижением уровней H3K4me3 на его промоторе. Nkx2.1 является транскрипционным фактором и является важным регулятором, обладающим гапло-недостаточностью в отношении развития легких [30]. NANCI и Nkx2.1 совместно экспрессируются в развивающихся легких эмбрионов мыши ст. E12.5, а истощение NANCI с помощью shRNA, вызывающей нокдаун in vivo? фенокопирует морфологические аномалии, наблюдаемые в мутантных легких, экспрессирующих только один функциональный аллель Nkx2.1. Ряд lncRNAs взаимодействует с энзимами метилирования ДНК и поэтому могут быть вовлечены в импринтинг [31].

Недавно, Dali (DNMT1-associated long intergenic), которая экспрессируется ниже гена транскрипционного фактора Pou3f3 (POU domain, class 3, transcription factor 3), как было установлено, взаимодействует с энзимом поддержания моделирование ДНК (cytosine-5) -methyltransferase

Figure 1. Long noncoding RNAs (lncRNAs) participate in complex gene regulatory networks of organ development. (A) The lncRNAs Braveheart and Fendrr (fetal-lethal noncoding developmental regulatory RNA) interact with Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) to control lateral mesoderm and cardiac transcription factors, together contributing to the gene regulatory network regulating heart development [24,26,27]. (B) The lncRNAs linc-Brn1b and Dali regulate the important developmental transcription factor coding gene Pou3f3. Dali interacts with DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 (DNMT1) and with POU3F3 to regulate cortical development [25,32].

1 (DNMT1) и регулирует статус метилирования промоторов, ассоциированных с островками CpG. Dali используется в регуляции транскрипции Pou3f3. Истощение Dali во время дифференцировки клеток (N2A) с помощью нокдауна РНК приводит к образованию меньшего количества клеток, формирующих нейриты, и к снижению роста нейритов [32]. Более того, нокдаун Dali приводит к нарушению регуляции ключевых генов нервного развития в дифференцирующиеся клетки по сравнению с контрольными клетками и Dali и POU3F3 обладают общими транскрипционными мишенями в этом процессе (Figure 1B). Эти данные указывают на Dali как важный модулятор GRN, действующей во время нейральной дифференцировки.

Некоторые сообщения показали, что lncRNAs, которые могут взаимодействовать конкурентно со многими комплексами и могут служить в качестве компонентов каркаса для крупных комплексов. Напр., Hotair взаимодействует с PRC2 и CoREST/REST/LSD1 комплексом, чтобы координировать комбинированную доставку обоих комплексов на геномные регионы, делая возможным эффективное деметилирование активирующей гистоновой меткой H3K4me2 и одновременно запуская репрессивную H3K27me3 гистоновую метку [33]. Др. пример это Kcnq1ot1 (KCNQ1 overlapping transcript 1), который взаимодействует с многочисленными комплексами и компонентами комплексов, таких как PRC2, DNMT1 и G9a (for review see [34]). Сходным образом, Dali взаимодействует с рядом компонентов комплексов, модифицирующих хроматин, таких как BRG1 (Brahma-related gene 1, also: SMARCA4, SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 4), P66beta (transcriptional repressor p66-beta) и SIN3A (SIN3 transcription regulator family member A) у мышей [32]. Идентификация общих мишеней для Dali и POU3F3 и взаимодействие этих факторов, наблюдаемое при RNA immunoprecipitation (RIP), подтверждает, что они формируют функциональный комплекс [32]. Интересно, что мутантные мыши, несущие генетическую делецию всего lncRNA локуса linc-Brn1b, обнаруживают существенное снижение активности гена Pou3f3 и обнаруживают дефекты в организации коры и кортикальных слоёв [25]. Это подтверждает, что Dali и linc-Brn1b могут действовать в генетической регуляторной сети c Pou3f3? чтобы контролировать нейрональное развитие (Figure 1B). Итак, по крайней мере, субнабор lncRNAs, по-видимому, формирует связи между эпигенетическим аппаратом и транскрипционными факторами.

lncRNAs as cofactors of transcriptional regulators

Некоторые lncRNAs, как было установлено, взаимодействуют с транскрипционными факторами, важными для эмбрионального развития и тем самым действуют как транскрипционные ко-регуляторы. Консервативная lncRNA Evf-2 (splice variant of Evf-1, embryonic ventral forebrain) кооперирует с транскрипционным фактором DLX2 (distal-less homeobox 2), чтобы контролировать экспрессию Dlx5/6 посредством энхансера в нейрональной (medial ganglionic eminence, MGE) ткани у E13.5 эмбрионов мыши [35]. Стабильный комплекс Evf-2 с DLX1/2 белками соединяется с регуляторными элементами в локусе Dlx5/6 in vivo, скорее всего, предупреждая метилирование ДНК репрессивного энхансера [36,37]. Генетическое истощение Evf-2 с помощью с помощью преждевременного окончания транскрипции приводит к снижению GABAergic промежуточный нейронов у взрослых мышей из-за снижения в количестве нейронов, специфицированных для этого клона во время эмбрионального развития [37]. Др. lncRNA, которая специфически экспрессируется в нервной ткани - это Rmst (Rhabdomyosarcoma 2-associated transcript) [38]. Rmst взаимодействует с транскрипционным фактором SOX2 (sex determining region Y-box 2) [39], позволяя SOX2 соединяться с нейрогенными промоторами и регулировать генетические программы, необходимые для нейрального развития [40].

Взаимодействуют ли эти lncRNAs с транскрипционными факторами непосредственно, lncRNA Six3os (SIX homeobox 3 opposite strand) соединяется с транскрипционными ко-регуляторными белками [EYA1, EYA3, and EYA4 (Eyes absent homolog 1,3,4)] в развитии сетчатки [41]. Вирусом обусловленный нокдаун Six3os в развивающейся сетчатке эмбрионов мыши приводит к редукции биполярных клеток и параллельно увеличиваются клетки Мюллеровой глии в сетчатке. Т.о., Six3os, по-видимому, участвует в контроле баланса при генерации разных типов клеток во время развития.

Транскрипция может также регулироваться с помощью взаимодействия lncRNAs с белками, которые не относятся к регуляторам транскрипции. Напр., lncRNA TUNA/megamind (Tcl1 upstream neuron-associated lincRNA) взаимодействует с некоторыми РНК связывающими белками [PTBP1 (polypyrimidine tract binding protein 1), hnRNP-K, and NCL/Nucleolin], участвующими в поддержании плюрипотентности ES клеток [42-44]. TUNA/РНК связывающий белковый комплекс был обнаружен на промоторах факторов плюрипотентности NANOG, SOX2 и fibroblast growth factor 4 (FGF4). TUNA специфически экспрессируется в ES клетках в нейральном клоне и в ЦНС взрослых мышей. TUNA экспрессия повышается во время нейральной дифференцировки клеток ES in vitro? а истощение TUNA с помощью нокдауна РНК вызывает уменьшение генов некоторых нейральных клонов, подтверждая важную роль в развитии и функционировании нервов. В соответствии с этими находками in vitro истощение TUNA/megamind с помощью morpholino-обусловленного нокдауна у развивающихся эмбрионов рыбок данио приводит нарушению нейрального развития и нарушению двигательной функции в тесте реакции на прикосновение у личинок рыбок данио [42,45].

Транскрипционные факторы нуждаются во взаимодействии с транскрипционным аппаратом (machinery), в особенности в mediator комплексе, для активации транскрипции генов. Важная субъединица медиаторного комплекса - это MED12 (mediator complex subunit 12), которая, по-видимому, служит ждя передачи сигналов от нескольких важных онтогенетических сигнальных путей, таких как WNT и Hedgehog, которые существенны для эмбрионального развития [46]. Интересно, что определенные мутации в MED12 человека, которые устраняют взаимодействие MED12 с lncRNAs, ассоциируют с врожденной болезнью человека, синдромом Opitz-Kaveggia (FG) [47]. Более того, в развивающихся лёгких мышей экспрессия некоторых lncRNAs коррелирует с экспрессией генов, кодирующих соседний транскрипционный фактор [30]. Нокдаун двух (NANCI и LL34) lncRNAs показал, что обе играют важные и различающиеся роли в энтодерме и развитии легких путем контроля экспрессии транскрипционных факторов, критических для формирования этого органа.

Сходным образом, lncRNAs регулируют важные для контроля транскрипции факторы во время развития сердца [48]. Очевидно, что помимо рассмотренных выше механизмов, транскриптом клеток может быть изменен за счет lncRNAs посредством большого количества др. регуляторных функций. Интересным примером является lncRNA TINCR (terminal differentiation-induced ncRNA), которая взаимодействует с мРНК и тем самым увеличивает концентрации мРНК важных для дифференцировки кожи генов [49]. Такой результат достигается за счет прямого взаимодействия TINCR с РНК связывающим белком STAU1 (double-stranded RNA-binding protein Staufen homolog 1) и возможно за счет стабилизации мРНК мишеней.

lncRNAs might promote cell diversification during embryogenesis

Хотя лишь небольшое количество lncRNAs проанализировано в отношении их функции в эмбриональном развитии, но обнаруживается общее свойство в некоторых из этих исследований. При анализе потери функции отсутствие некоторых lncRNAs вызывает диспропорцию в потенциале развития или в дифференцировке определенного типа клеток или клонов или приводит к дисфункции органов. Это говорит о том, что lncRNAs играют важную роль в контроле клеточных судеб.

Хотя основной план тела всех позвоночных консервативен, разные виды развивают органы с очень большим диапазоном функциональной сложности. Увеличение сложности органов требует значительного разнообразия типов клеток во время эмбрионального развития, это означает, что во время эволюции, существующие определенные типы клеток в довольно примитивном организме дивергируют на два или несколько сходных, но отличающихся типа клеток ц более сложных организмов. Однако несмотря на увеличение сложности органов основная сеть транскрипционных факторов контролирует органогенез, напр., развитие сердца, хорошо законсервирована, напр., у рыбок данио и человека. Хотя высокая сложность клеточного протеома из-за дифференциального сплайсинга и пост-трансляционных модификаций безусловно вносит вклад в эволюцию наивысшей клеточной сложности, ключевым фактором для эволюции сложных организмов является сильное увеличение регуляторной сложности [50]. Растет количество lncRNAs, увеличивающих сложность органов [51] (Figure 2A), и значительная фракция lncRNAs участвует в организации ядра, модификациях хроматина и эпигенетическом контроле генов. Т.о., lncRNAs, скорее всего, играют существенную роль в создании наивысшей сложности в регуляторных механизмах. Это в дальнейшем было подтверждено наблюдениями, что многие lncRNAs обладают более специфическим паттерном экспрессии, чем белок кодирующие гены [14,15]. В частности, головной мозг человека наиболее сложный орган из все, экспрессирует большие количества lncRNAs с высоко специфичными паттернами экспрессии [52]. Вполне возможно, что lncRNAs участвуют в тонкой настройке GRNs, контролирующих дифференцировку специфических типов клеток и клонов и вносят существенный вклад в формирование и собственно функционирование усовершенствованной ткани и органов из довольно простых предшественников (Figure 2B) [53]. Более того, низкая консервация последовательностей ортологичных lncRNAs, наблюдаемая между даже близко родственными видами, говорит, что lncRNAs предоставляют подходящую платформу для быстрой эволюции новых функций.

Сложение доказательств и наблюдений позволяет предположить, что lncRNAs играют важную роль в диверсификации клеток

Figure 2. Long noncoding RNAs (lncRNAs) may have contributed to the evolution of higher organ complexity. (A) An increase in organ complexity during evolution is correlated with rising lncRNA gene numbers. Left: single-chambered heart and simple brain in the fish. Right: double-chambered heart and complex brain with enlarged cortex in the human. (B) lncRNAs modulating an evolutionary conserved gene regulatory network (GRN) might promote cell lineage diversification.

во время эмбриогенеза, приводя к более сложным тканям и органам во время эволюции, создавая тем самым более сложные организмы.

Concluding remarks

Thorough genetic and molecular investigations of numerous individual lncRNAs will be required to elucidate the full range of mechanisms by which lncRNAs take part in GRNs controlling cell differentiation and diversification. Careful consideration must be given to the design of genetic manipulations used to interfere with or disrupt lncRNA function, as the type of mutation may have an important impact on the outcome and thus may influence the interpretation of the role of the lncRNA [54]. For example, partially conflicting results have been obtained in studies on MALAT1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1) and lincRNA-p21, depending on whether the genes were inactivated via RNAi or via genetic ablation [55–59]. Furthermore, a recent study in zebrafish, in which antisense RNA (morpholino)-guided mutants (morphants) and genetic mutants of the same proteincoding and noncoding genes were compared, revealed only a poor correlation between the phenotypes [60]. These studies provide strong arguments in favor of genetic inactivation as a more reliable approach.

However, only a small proportion of 18 lncRNA knock-out lines generated in mice showed impaired organ development or compromised animal survival [25]. In some instances removal of lncRNAs may have caused an imbalance rather than a dysfunction of the GRNs controlling cell differentiation. It is also likely that some phenotypes may be subtle and only become apparent upon environmental challenges of the knockout animals or in particularly permissive genetic backgrounds. Nevertheless, ideally investigations should be done in an in vivo context using animal models and primary cells. Further in-depth analyses may reveal a wider spectrum of lncRNA functions in the fine-tuning of GRNs controlling cell differentiation. This requires, among other approaches, further improvement of current methods for the identification of direct genomic targets of lncRNAs as well as for the purification and analysis of lncRNA/protein complexes, allowing their application to the numerous, low abundant lncRNA transcripts [61–63].

Long noncoding RNAs in organogenesis: making the difference Phillip Grote 1 and Bernhard G Herrmann Trends in Genetics Volume 31, Issue 6, June 2015, Pages 329–335

Long noncoding RNAs in organogenesis: making the difference
Phillip Grote 1 and Bernhard G Herrmann
Trends in Genetics Volume 31, Issue 6, June 2015, Pages 329–335