Посещений:
ЛИМФАНГИОГЕНЕЗ КОЖИ

Роль передачи сигналов TGFβ

TGFβ signaling is required for sprouting lymphangiogenesis during lymphatic network development in the skin
Jennifer M. James,Ani Nalbandian and Yoh-suke Mukouyama Development140, 3903-3914. 2013

Dermal lymphatic endothelial cells (LECs) emerge from the dorsolateral region of the cardinal veins within the anterior trunk to form an intricate, branched network of lymphatic vessels during embryogenesis. Multiple growth factors and receptors are required for specification and maintenance of LECs, but the mechanisms coordinating LEC movements and morphogenesis to develop three-dimensional lymphatic network architecture are not well understood. Here, we demonstrate in mice that precise LEC sprouting is a key process leading to stereotypical lymphatic network coverage throughout the developing skin, and that transforming growth factor ? (TGFβ) signaling is required for LEC sprouting and proper lymphatic network patterning in vivo. We utilized a series of conditional mutants to ablate the TGFβ receptors Tgfbr1 (Alk5) and Tgfbr2 in LECs. To analyze lymphatic defects, we developed a novel, whole-mount embryonic skin imaging technique to visualize sprouting lymphangiogenesis and patterning at the lymphatic network level. Loss of TGFβ signaling in LECs leads to a severe reduction in local lymphangiogenic sprouting, resulting in a significant decrease in global lymphatic network branching complexity within the skin. Our results also demonstrate that TGFβ signaling negatively regulates LEC proliferation during lymphatic network formation. These data suggest a dual role for TGFβ signaling during lymphatic network morphogenesis in the skin, such that it enhances LEC sprouting and branching complexity while attenuating LEC proliferation.


Рисунки к статье


Лимфатические сосуды возникают из вен эмбриона и формируют замысловатую, разветвленную сеть по всему телу (Srinivasan et al., 2007). Лимфатические сосуды необходимы для абсорбции липидов, а также для переноса и надзора за иммунными клетками. Лимфатическая система поддерживает гомеостаз тканевой жидкости путем возвращения вышедших из сосудов компонентов крови (или лимфы) обратно в кровообращение через торакальный проток, предупреждая отеки эмбрионов и у взрослых (Cueni and Detmar, 2006; Tammela et al., 2007). Патологический лимфангиогенез происходит во время хронического воспаления и метастазов опухолей (Oliver and Alitalo, 2005; Das and Skobe, 2008;Alitalo and Detmar, 2012), при этом некоторые опухоли способны модулировать лимфангиогенез, секретируя соотв. факторы (Mandriota et al., 2001; Skobe et al., 2001; He et al., 2005;Burton et al., 2008). Сегодня роль лимфатической системы в гомеостазе и при болезнях неизбежно влечет идентификацию новых молекулярных путей, контролирующих лимфангиогенез.
Развитие лимфатических сосудов начинается, когда субнабор венозных эндотелиальных клеток экспрессирует транскрипционный фактор PROX1, главный регулятор судьбы lymphatic endothelial cell (LEC) (Wigle and Oliver, 1999). PROX1+ LECs формируют пре-лимфатические кластеры, которые раздуваются сбоку кардинальных вен, а также мигрируют от вен в качестве небольших групп из LECs, чтобы сформировать первичный лимфатические мешки (Fran?ois et al., 2012; Yang et al., 2012). LECs затем отпускают отростки и мигрируют, чобы заселить кожу и большинство внутренних органов эмбриона, покрывая ткани разветвленной сетью лимфатических сосудов (Sabin, 1902; M?kinen et al., 2007; Oliver and Srinivasan, 2008). Удивительно, мало известно о клеточных механизмах молекулярных путях, контролирующих образование динамической лимфатической сети, где периферические лимфатические сосуды, как полагают, генерируются с помощью разветвления лимфатических сосудов и миграции из первичных лимфатических мешков. Подробное исследование этих процессов формирования паттерна нуждается в модели лимфатических сосудов, которая бы позволяла непосредственно наблюдать лимфатическую сеть с анатомически различимым паттерном.
Путь vascular endothelial growth factor C (VEGFC) и VEGF receptor 3 (VEGFR3; также известный как Flt4) является главным регулятором лимфатического развития (Dumont et al., 1998;M?kinen et al., 2001; Karkkainen et al., 2004). У Vegfc гомозиготных мутантов, PROX1+ LECs первоначально специфицируются внутри вен, но затем неспособны формировать первичные лимфатические мешки, приводя в результате к неспособности развития лимфатической сети (Karkkainen et al., 2004). Передача сигналов VEGFC/VEGFR3 , по крайней мере, частично ответственна за тонкую настройку ветвления лимфатической сети посредством взаимодействий с корецептором VEGFC neuropilin 2 (NRP2) (Xu et al., 2010). У Nrp2 гомозиготных мутантов, лимфатические капилляры расширены, с признаками гиперпролиферации и неспособны собственно ветвиться (Yuan et al., 2002). Принимая во внимание сложные морфогенетические процессы, необходимые для формирования лимфатической сети, скорее всего, и др. факторы или способствуют или подавляют ветвление лимфатических сосудов. Передача сигналов TGFβ активна в LECs (Oka et al., 2008; Niessen et al., 2010) и играет также жизненно важную роль в сердечно-сосудистом развитии (Lebrin et al., 2005; Pardali et al., 2010). Однако роль передачи сигналов TGFβ во время развития лимфатической сети in vivo неясна. TGFβ вызывает образование гетеромерного комплекса, содержащего типа 1 и типа 2 serine/threonine-киназные трансмембранные рецепторы (Heldin et al., 1997; Shi and Massagu?, 2003; Feng and Derynck, 2005; Ikushima and Miyazono, 2010). После соединения TGFβ лиганда с TGFβR2 (типа 2 рецептором) с высоким сродством, TGFβR2 трансфосфорилирует типа 1 рецептор, приводя к его активации. Постепенно типа 1 рецептор распространяет сигнал в клетки путем фосфорилирования рецептором регулируемых Smads (R-Smads), которые затем формируют гетеромерные комплексы с общим медиатором SMAD4 (Co-Smad). В эндотелиальных клетках передача сигналов TGFβ осуществляется посредством двух отличающихся типа 1 рецепторов: посредством обычного TGFβR1 [который также известен как activin receptor-like kinase 5 (ALK5)], активируя SMAD2 и SMAD3, или посредством ALK1 [который также известен как activin A receptor, type II-like 1 (ACVRL1)] , активируя SMAD1 и SMAD5. Предыдущие исследования в культурах и in vivo моделей опухолевого лимфангиогенеза продемонстрировали, что передача сигналов TGFβ негативно регулирует лимфангиогенез (Oka et al., 2008), тогда как постнатальное развитие лимфатических сосудов нуждается в Alk1-обеспечиваемой передаче сигналов TGFβ для поддержания качественных особенностей LEC (Niessen et al., 2010). Эти исследования не касались вопроса, необходима ли передача сигналов TGFβ для формирования паттерна лимфатических сосудов и морфогенеза сети во время развития. Генетические исследования на мышах продемонстрировали, что потеря существенной части TGFβ рецепторов, таких как Tgfbr2 (Oshima et al., 1996),Tgfbr1 (Larsson et al., 2001) или Alk1 (Oh et al., 2000; Urness et al., 2000), ведет к гибели эмбрионов из-за дефектов морфогенеза сердца и тяжелых сосудистых аномалий. Эти фенотипы с ранним началомe в сердечно-сосудистом развитии затрудняют изучение, влияет ли передача сигналов TGFβ непосредственно на развитие лимфатических сосудов in vivo.
Чтобы обойти раннюю эмбриональную летальность у обычных мутантов, мы использовали условные и индуцибельные Cre линии, скрещиваемые с floxed аллелями Tgfbr2 и Tgfbr1, чтобы нарушить передачу сигналов TGFβ в LECs, когда они впервые появляются из вен и начинают формирование сети. Чтобы оценить дефекты формирования паттерна лимфатической сети, мы разработали новую эмбриональную технику наблюдения для анализа развития лимфатической сети в коже мышей. Используя эти подходы, мы установили, что нарушения в передаче сигналов TGFβ во время лимфангиогенеза ведут к значительному уменьшению локального разрастания LEC и в свою очередь к достоверному уменьшению сложности разветвленной лимфатической сети. Мы также установили, что передача сигналов TGFβ негативно регулирует пролиферацию LEC во время лимфангиогенеза в коже. Получены строгие доказательства, что передача сигналов TGFβ необходима для лимфатического разрастания и усиливает собственно морфогенез лимфатической сети в коже, в то же время конкурентно ограничивает пролиферацию LEC.

DISCUSSION


Представленные здесь данные демонстрируют потребность в передаче сигналов TGFβ во время развития лимфатической сети в коже. Условное устранение или главного TGFβ рецептора во время спецификации LEC драматически снижает охват лимфатической сетью в коже, даже если спецификация LEC и образование первичных лимфатических мешков были нормальными. Однако, генетическое нарушение Tgfbr2 или Tgfbr1 на более поздней стадии, когда лимфатическая сеть активно развивается в коже, ведет к достоверному снижению ветвления в сети и образования кончиковых клеток. У VECadCreERT2tg; Tgfbr2f/f or Tgfbr1f/f и Tgfb2 мутантов, нарушения передачи сигналов TGFβ могут также приводить к достоверному увеличению пролиферации LEC приводя в результате к гиперпластичным лимфатическим сосудам. Это подтверждает двойную роль передачи сигналов TGFβ во время развития лимфатической сети в коже, причем передача сигналов TGFβ улучшает разрастание LEC и усиливает сложность сети, тогда как негативно регулирует пролиферацию LEC.
Во время формирования лимфатической сети LEC разрастаются или кончиковые клетки обнаруживают динамические филоподии и миграторное поведение, но редко пролиферируют, подобно сосудистым эндотелиальным кончиковым клеткам. Наши результаты показывают, что нарушения в передаче сигналов TGFβ в LECs ведут к снижению разрастаний LEC и к незначительному увеличению количества LEC в коже, подтверждая двойную роль передачи сигналов TGFβ, которая позитивно индуцирует разрастания LEC или образование кончиковых клеток путем усиления активности VEGFR3 и NRP2, тогда как негативно регулирует пролиферацию LEC. Идентификация нижестоящих мишеней, которые способствуют разрастанию LEC или ингибируют пролиферацию LEC, предоставит информацию о двойной роли передачи сигналов TGFβ в развитии лимфатических сосудов.
Многие типы клеток, присутствующие внутри кожи, экспрессируют TGFβ лиганды. Тканевые макрофаги участвуют в качестве важного источника про-ангиогенных и про-лимфангиогенных факторов во время эмбрионального и постнатального ангиогенеза и лимфангиогенеза (Kubota et al., 2009;Fantin et al., 2010; Gordon et al., 2010). LYVE1+ тканевые макрофаги тесно ассоциированы с лимфатическими сосудами в развивающейся коже (Fig. 1C) (Gordon et al., 2010). Более того, мыши, дефицитные по тканевым макрофагам, такие как Pu.1-/- и Csfr1-/- мутанты, обнаруживают гиперплазию лимфатической сети (Gordon et al., 2010). Лимфатические фенотипы у мышей, дефицитных по тканевым макрофагам, сходны, но менее тяжелые, чем те, что у условных Tgfbr2 иTgfbr1 мутантов. Тканевые макрофаги являются источником TGFβs в коже, принимая во внимание, что экспрессия всех главных TGFβ лигандов обнаружима в F480+/LYVE1+ тканевых макрофагах, FACS-изолированных из кожи эмбрионов (J.M.J. and Y.M., unpublished). Мы не можем исключить возможность, что др. типы клеток, такие как тромбоциты и эндотелиальные клетки, являются источником TGFβs во время развития. Прямая демонстрация, что происходящие из макрофагов TGFβs необходимы для собственно формирования лимфатических сосудов в коже, нуждается в специфичных для макрофагов нокаутах TGFβs.
Передача сигналов TGFβ, по-видимому, участвует во многих аспектах лимфангиогенеза, включая миграцию и разрастание LEC. Предыдущая работа продемонстрировала, что ALK1, др. главный TGFβ типа 1 рецептор, который соединяется с bone morphogenetic protein (BMP) 9 (также известен как GDF2), BMP10 и TGFβ, регулирует постнатальное развитие лимфатических сосудов (Niessen et al., 2010). Ингибирование передачи сигналов ALK1 с использованием растворимой ловушки ALK1 рецептора или ALK1-специфических нейтрализующих антител ведет к нарушению врастания лимфатических сосудов в сеть, подобную пчелиным сотам в коже хвоста постнатальных детенышей, тогда как такое воздействие оказывает незначительный эффект на кровеносную сеть кожи. В комбинации с нашим наблюдением, что Tgfbr2 и Tgfbr1 необходимы для лимфангиогенеза в эмбриональной коже, передача сигналов TGFβ может использовать множественные рецепторы, чтобы регулировать формирование сети лимфатических сосудов на разных стадиях развития. Наша работа подтверждает, что способность к миграции и врастанию LECs усиливается с помощью передачи сигналов TGFβ во время формирования лимфатической сети. Поскольку VEGFC участвует в лимфатическом разрастании за счет передачи сигналов VEGFR3-NRP2 рецепторных комплексов (Xu et al., 2010), то передача сигналов TGFβ может кооперировать с передачей сигналов VEGFR3/NRP2 , чтобы способствовать лимфатическому разрастанию. Всё же мы продемонстрировали, что TGFβ2 стимулирует экспрессию VEGFR3 и NRP2 in vitro, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять молекулярный механизм формирование TGFβ-обеспечиваемое лимфатической сети.
Во время воспаления или туморогенеза, однако роль передачи сигналов TGFβ в LECs, по-видимому, анти-лимфангиогенна (Clavin et al., 2008; Oka et al., 2008). Отчасти противоречивые результаты отражают многогранную роль передачи сигналов TGFβ в эмбриональном и патологическом лимфангиогенезе. Лимфангиогенез, индуцированный с помощью VEGFC усиливается в присутствии TGFβ receptor 1 киназного ингибитора SB431542 in vivo, который специфически подавляет Alk4 (Acvr1b), Alk5 (Tgfbr1) и Alk7 (Acvr1c) (Inman et al., 2002; Laping et al., 2002). Передача сигналов TGFβ может активировать разные комбинации Smads и/или коперировать с др. внутриклеточными сигнальными путями контекст-зависимым способом. Следовательно, чтобы понять бифункциональную роль передачи сигналов TGFβ во время эмбрионального физиологического и патологического лимфангиогенеза, важно идентифицировать Smads и их гены мишени под активацией передачи сигналов TGFβ , которые могли бы контролировать каждый индивидуальный процесс.