Кишечный тракт является одним из наиболее архитектурно и функционально сложных органов. Кишечник человека длиной 8 м (Hounnou et al., 2002) и подразделен на 5 функциональных доменов вдоль проксимо-дистальной оси: двенадцатиперстная кишка, тощая кишка и подвздошная кишка являются сегментами тонкого кишечника, а слепая кишка и ободочная кишка составляют толстый кишечник. Кишечник представлен специализированными клетками и типами тканей из всех трех зародышевых листков. Кишечные ткани включают происходящий из энтодермы эпителий, дающий приют специализированным intestinal stem cells (ISCs) (Sato and Clevers, 2013), происходящие из мезодермы гладкие мышцы, кровеносные и лимфатические сосуды и иммунные клетки и происходящая из эктодермы enteric nervous system (ENS). Вклады из всех зародышевых слоёв необходимы, чтобы скоординировать мириады сложных кишечных функций.

Кишечник известен лучше всего своей функцией переваривания пищи, он регулирует абсорбцию и выделение отходов. Менее оцененной является центральная роль эндокринной системы кишечника в координации системных уровней питательных веществ и в режиме питания др. систем органов посредством эндокринных гормонов. Кроме того, эпителий кишечника действует как избирательный барьер, ограничивающий микробов в просвете кишечника (Turner, 2009). Эти функции эпителия в основном выполняются 4 типами клеток: абсорбтивными энтероцитами и тремя секреторными клонами. Секреторные клетки, участвующие в барьерной функции, включают бокаловидные (goblet) и Paneth клетки, секретирующие муцин и противомикробные факторы. Энтероэндкринные клетки являются редкими, но разнообразны популяции типов клеток, секретирующих гормоны, которые регулируют сытость, подвижность, абсорбцию, пролиферацию β-клеток, секрецию др. гормонов и переваривающих ферментов, помимо прочего (Engelstoft et al., 2013). Эпителий кишечника обновляется каждые 5 дней у мышей и эта регенеративная способность управляется постоянно присутствующей популяцией ISCs (Creamer et al., 1961; Sato et al., 2009). Механические функции кишечника контролируются с помощью сложных взаимодействий между эпителием, гладкими мышцами и ENS, регулирующих перистальтику, чтобы гарантировать однонаправленное перемещение содержимого просвета.

Принимая во внимание клеточную и функциональную сложность, неудивительно, что имеются люди, подверженные дисфункции кишечника. Широко распространенными кишечными нарушениями являются инфекции, синдром усиленной перистальтики (IBS), недостаточное всасывание и непроизвольный стул. Др. истощающие болезни включают inflammatory bowel disease (IBD), рак толстого кишечника и болезни, которые в некоторых случаях, имеют генетическую основу, такие как болезнь Гиршпрунга. Кроме того, поскольку большинство лекарств, принимаемых через рот, абсорбируется в кишечнике, то наиболее распространенными побочными эффектами являются кишечные. Принимая во внимание большое количество функций, выполняемых кишечником, существует огромный интерес к предупреждению или устранению болезней кишечника с помощью манипуляций кишечной клеточной биологии; напр., с помощью стимуляции роста ISC как средства защиты или восстановления целостности эпителия и барьерной функции после повреждений (Zhou et al., 2013). Однако исследования желудочно-кишечных (GI) болезней в основном базируются на исследованиях животных in vivo, которые от природы обладают низкой производительностью и иногда неадекватно воспроизводят физиологию человека. Поэтому проводимые in vitro исследования кишечных тканей человека представляют мощный инструмент для функционального моделирования врожденных дефектов развитии кишечника человека, для преклинического скрининга эффективности лекарств и тестирования на токсичность и для разработки моделей для изучения механистических основ болезней, включая IBD и рак.

Здесь мы обсудим современное понимание развития кишечника и как эта информнация может быть использована для управления дифференцировкой человеческих плюрипотентных стволовых клеток (PSCs) в ткани кишечника in vitro/ Этот подход требует определенных по времени манипуляций с сигнальными путями пошаговым способом, которые воспроизводят раннее развитие кишечника (Fig. 1). Эти основные ступени развития включают формирование дефинитивной энтодермы, формирование паттерна задней части энтодермы, образование кишечной трубки и рост и морфогенез кишечника (Fig. 2). Успехи в этой области в основном обусловлены переходом с двухмерных к трехмерным условиям роста и присутствием мезенхимных типов клеток, это усложняет тканевой уровень и лучше всего напоминает развитие кишечника in vivo. Fig. 1. Fig. 2.

The first step: endoderm formation

Получение кишечных клеток из PSCs нуждается в ступени, воспроизводящей процесс гаструляции и формирование дефинитивной энтодермы (DE) (Fig. 1). Исследования гаструляции с использованием эмбрионов рыб, кур и мышей оказались существенными в идентификации консервативных молекулярных путей, управляющих гаструляцией клеток в энтодермальный и мезодермальный клоны (rev. Zorn and Wells, 2009; Zorn and Wells, 2007). Центральным в этих процессах является Nodal семейство TGFβ сигнальных белков, которые у эмбрионов лягушек действуют, чтобы инициировать гаструляцию и управлять спецификацией клонов мезодермы и энтодермы зависимым от дозы способом (Green and Smith, 1990). Nodal действует посредством своих родственных Type I (Alk4/7) и type II (ActRIIA or B) рецепторов и также нуждается в корецепторе Crypto для сильной активации передачи сигналовin vivo (Gritsman et al., 1999). Активность серин-треониновой киназы Nodal-рецепторного комплекса обеспечивает фосфорилирование и локализацию в ядре комплекса Smad2/3/4. Оказавшись в ядре, Smads взаимодействуют с транскрипционными кофакторами, таким как FoxH1/FAST1 или Mix-подобными гомеодоменовыми белками, чтобы активировать высоко конервативную сеть энтодермальных регуляторных генов (Hoodless et al., 2001; Tremblay et al., 2000). Стержневыми в этой транскрипционной сети у позвоночных являются транскрипционные факторы Sox17, Foxa2, Mix, Gata4/6 и Eomes. Хотя точная роль этих факторов может слегка варьировать среди позвоночных, они действуют скоординировано в индукции энтодермального клона (Sinner et al., 2006).

Establishing posterior identity from the DE

В конце гаструляции действуют 4 основных сигнальных пути, способствующих формированию заднего паттерна у эмбрионов позвоночных: Wnt, Fgf, ретиноевая кислота (RA) и Bmp. У эмбрионов Xenopus, высокие уровни β-catenin зависимой передачи сигналов Wnt (Wnt/β-catenin) способствуют экспрессии задних генов в энтодерме, тогда как в то же самое время ингибируют экспрессию передних генов в задней части (McLin et al., 2007; Zorn and Wells, 2009). Напротив, репрессия Wnt с помощью Sfrp семейства секретируемых антагонистов Wnt необходима, чтобы помочь становлению границы между желудком и двенадцатиперстной кишкой (Kim et al., 2005). Bmp лиганды, экспрессируемые в задней мезодерме и действующие паракринным способом, способствуют выбору задней судьбы энтодермой у эмбрионов лягушек, рыб и кур (Kumar et al., 2003; Rankin et al., 2011; Roberts et al., 1995; Tiso et al., 2002). Сходным образом, лиганды Fgf, экспрессирующиеся в задней части мезодермы, действуют на соседнюю эктодерму и энтодерму, чтобы способствовать выбору задней судьбы (Dessimoz et al., 2006; Wells and Melton, 2000). Наконец, RA, как известно, способствует формированию паттерна задней части энтодермы (Bayha et al., 2009; Huang et al., 1998; Niederreither et al., 2003;Stafford and Prince, 2002; Wang et al., 2006b).

Одним из основных способов, с помощью которых эти пути способствуют приобретению задней судьбы, является непосредственная регуляция генов Caudal homeobox (Cdx), впервые идентифицированных в качестве главных регуляторов приобретения задней судьбы у Drosophila (Macdonald and Struhl, 1986; Mlodzik et al., 1985). Один из членов семейства, Cdx2, экспрессируется динамически во времени и пространстве, сначала его экспрессия обнаруживается во всех трех зародышевых листках во время ранней беременности, затем ограничивается кишечным эпителием в середине беременности. Первоначальная информация о критической роли Cdx2 во время развития кишки/кишечника была получена методом комплементации тетраплоидов (Chawengsaksophak et al., 2004). Эти эксперименты показали, что Cdx2-нулевая мезодерма и нейроэктодерма специфицируются должным образом, в то же время задняя кишка неспособна экспрессировать энтодермальный Shh и задерживается образование задней кишки. Последующие исследования показали, что условная делеция Cdx2 в энтодерме с использованием Foxa3-Cre дает мутантных мышей, которые образуют кишечную трубку, укороченную в области слепой кишки, полностью лишенную толстого кишечника и заканчивающуюся слепым мешком. Мутантный кишечник неспособен к морфогенезу ворсинок и экспрессирует гены, специфичные для программ передней кишки и пищевода, при этом эпителий морфологически напоминает слущивающийся эпителий пищевода. Итак, в отсутствии Cdx2, программа для передней кишки эктопически активируется в регионе всего кишечника (Gao et al., 2009).

Исследования in vitro и in vivo подтвердили, что передача сигналов Wnt обеспечивает приобретение задней кишки, регулируя экспрессию Cdx2. Напр., электропортация постоянно активной формы β-catenin в энтодерме передней кишки мыши, генетическая активация β-catenin или стабилизация β-catenin с использованием Gsk3b ингибитора на ст. E8.25 приводит к эктопической индукции Cdx2 и к репрессии Sox2 в передней кишке (Sherwood et al., 2011). Пути передачи сигналов Fgf, RA и BMP сходным образом регулируют спецификацию задней энтодермы путем регуляции экспрессии генов Cdx (Bayha et al., 2009; Dale et al., 1992; Dessimoz et al., 2006; Keenan et al., 2006; Kinkel et al., 2008; Kumar et al., 2003; Lickert and Kemler, 2002; Northrop and Kimelman, 1994). Во многих случаях, эти пути непосредственно регулируют экспрессию Cdx посредством элементов, чувствительных к Wnt, RA и Fgf (Haremaki et al., 2003; Rankin et al., 2011; Tiso et al., 2002). Наконец, Cdx факторы воздействуют обратным образом на эти пути постериоризации путем регуляции экспрессии ключевых сигнальных компонентов, таких как Wnt3, Fgf8 и RA синтезирующий фермент Cyp26a1. Эти данные подтверждают, что имеется задняя регуляторная сеть, использующая синергичные активности Fgf, Wnt и RA, которые действуют, чтобы регулировать экспрессию семейство Cdx транскрипционных факторов.

Using embryonic patterning and inductive cues to generate intestinal tissue in vitro

Активация передачи сигналов Nodal является первым приближением к генерации клеток DE из эмбриональных стволовых клеток (ESCs) мыши и человека (D'Amour et al., 2005; Kubo et al., 2004). Это требует культивирования ESCs при высоких уровнях activin A (100 ng/ml) в течение 3 или 4 дней, это дает в результате монослойные культуры DE клеток, экспрессирующих маркеры энтодермы, такие как Sox17 и Foxa2. Смыслом большинства протоколов является использование nodal миметика activin, поскольку он не нуждается в корепрессоре crypto и в несколько раз более активен, чем nodal в стимуляции образования энтодермы из человеческих PSCs или анимальных шапочек Xenopus (Tada et al., 2005). Хотя DE, произошедшие после воздействия Nodal или activin удивительно сходны, но недавнее исследование показало, что имеются некоторые отличия в экспрессии генов и в потенциале дифференцировки in vivo в activin или nodal индуцированных DE (Chen et al., 2013). Частично это может быть обусловлено достоверными отличиями в активности activin в противовес nodal в отношении уровней передачи сигналов nodal, это может влиять на anterior-posterior (A-P) природу энтодермы. Напр., высокие уровни передачи сигналов nodal/activin в передней части первичной полоски мыши способствуют выбору судьбы передней энтодермы (Chen et al., 2013; Spence et al., 2011b). В соответствии с этим более длительное воздействие активина направляет ESCs на выбор судьбы передней дефинитивной энтодермы. Дальнейшие отличия между сгенерированными с помощью nodal и activin DE могут быть обусловлены их дифференциальной способностью действовать синергично с передачей сигналов Wnt, чтобы способствовать приобретению судьбы передней энтодермы, как это было продемонстрировано на рыбах и лягушках (Ho et al., 1999; Zorn et al., 1999) и на ESCs (Sumi et al., 2008).

Манипуляции с задней регуляторной сетью были сфокусированы на усилиях управлять дифференцировкой кишечника, происходящего из PSC DE мыши и человека (Ameri et al., 2009; Cao et al., 2010; McCracken et al., 2011; Ogaki et al., 2013; Sherwood et al., 2011; Spence et al., 2011b; Ueda et al., 2010). Активация пути Wnt в культурах DE, произошедших ESCs мыши управляет приобретением задней судьбы, как это показано с помощью экспрессии Cdx2. Однако, Cao с коллегами сообщили, что экспрессия Cdx2 нуждается в присутствии среды, кондиционированной фибробластами (Cao et al., 2010), подтвердив, что др. сигнальные факторы, секретируемые фибробластами, действуют совместно с Wnt, чтобы обеспечивать заднюю спецификацию. В самом деле, пути WNT и FGF, как было установлено, действуют синергично, чтобы индуцировать заднюю судьбу в культуре PSC человека, маркированную широкой экспрессией CDX2 (Fig. 1B) (McCracken et al., 2011; Spence et al., 2011b). Более того, эти исследования продемонстрировали, что имеется потребность в своевременной передаче сигналов, так как пролонгированная совместная активация путей передачи сигналов FGF и WNT необходима, чтобы необратимо специфицировать заднюю судьбу. Напр., продолжительная обработка культур DE человека с помощью FGF4 и WNT3A белков в течение 4-х дней оказалась необходимой для стабильной и необратимой экспрессии CDX2 и была критической для спецификации кишечника. Напротив, более короткое воздействие в течение 2-х дней приводило к временной обратимой индукции CDX2 и было недостаточным для спецификации кишечника (Spence et al., 2011b). Как обсуждалось выше пути WNT и FGF могут иметь множественные узлы пересечения с передачей сигналов RA и BMP во время становления задней оси эмбриона. Т.о., разумно ожидать комбинаторной роли этих путей в активации задней регуляторной сети в культурах PSC; однако это пока не продемонстрировано.

Contribution of other germ layers to the developing intestine

Кишечник собирается из предшественников, возникающих из трех зародышевых слоёв. Хотя большинство исследований сфокусировано на эпителии, происходящим из энтодермы, происходящие из мезодермы и эктодермы ткани играют центральную роль в развитии и функционировании кишечника. Мезодерма, дающая мезенхиму кишечника генерируется во время гаструляции и распределяется латерально вдоль туловища эмбриона позвоночных. Эта латеральная пластинка мезодермы разделена на соматическую и спланхническую мезодерму, последняя из них является самостоятельной популяцией клеток, соседствующей с развивающимся кишечным эпителием перед смыканием в кишечную трубку у эмбрионов птиц (Thomason et al., 2012). Как только происходит закрытие кишечной трубки и эпителий созревает, спланхническая мезодерма формирует мезенхиму, которая покрывает кожухом примитивную кишечную трубку. Эта мезенхима формирует множественные слои с отличающимися типами и функциями клеток, включая субэпителиальные миофибробласты и фибробласты, а также кольцевые и продольные гладкие мышцы. Кроме того, происходящие из мезодермы, эндотелиальные клетки и перициты формируют сложное сосудистое сплетение, которое необходимо в тесной близи к эпителиальным клеткам для передачи питательных веществ и гормонов (Powell et al., 2011; Zorn and Wells, 2009; Zorn and Wells, 2007).

В дополнение к присутствию множественных типов клеток мезенхима также является критическим игроком при образовании ворсинок (Mathan et al., 1976; Karlsson et al., 2000) (see Fig. 3). Агрегаты мезенхимы по соседству с кишечным эпителием впервые становятся видимы на ст. E14.5, и экспрессируют platelet-derived growth factor A (Pdgfra) (Karlsson et al., 2000). На более поздних стадиях эпителий ремоделируется, чтобы создать ворсинки, проецирующиеся в просвет, а мезенхимные кластеры остаются ассоциированными с кончиками эпителия ворсинок экспрессируют несколько сигнальных лигандов, включая Bmp2 и Bmp4. Кроме того, эпителий, соседствующий с мезенхимными кластерами, и сами кластеры, по-видимому, не пролиферируют, подтверждая, что кластеры могут действовать как сигнальные центры, чтобы координировать появление ворсинок и выход из клеточного цикла (Karlsson et al., 2000). В соответствии с этим ингибирование передачи сигналов Bmp ведет к избыточной пролиферации и к эктопическому образованию похожих на крипты структур на ворсинчатом эпителии, сходные с теми, что наблюдаются у человека при ювенильном полипозе (Haramis, 2004; Batts et al., 2006). Fig. 3.

Недавняя работа продемонстрировала, что мезенхимные кластеры, реагируют на и зависят от передачи сигналов эпителиального hedgehog (Hh) (Walton et al., 2012). Передача сигналов Hh, как было установлено, является критической для морфогенеза ворсинок (Madison et al., 2005; Mao et al., 2010). Исследование Walton коллегами описало механизм, с помощью которого передача сигналов Hh контролирует размер и образование Pdgfra⁺ мезенхимных кластеров, делая возможным морфогенез ворсинок. В отсутствие передачи сигналов Hh, не образуются ни мезенхимные кластеры, ни ворсинки (Walton et al., 2012). Помимо формирования кластеров новая работа также выявила важность происходящих из мезенхимы слоёв кишечных гладких мышц, генерирующих компрессионные силы, необходимые для образования кишечных складок, видимых у разных позвоночных и это приводит к увеличению области поверхности кишечника (Shyer et al., 2013).

Происходящие из эктодермы ткани также являются критическими для развития и функционирования кишечника. Внутри кишечной мезодермы имеются два нервных сплетения, контролирующих подвижность кишечника. Эти нейроны коллективно названы энтерической нервной системой (ENS), они контролируют мышечные сокращения перистальтики, которые контролируют перемешивание пищи с переваривающими ферментами и перемещение содержимого просвета по GI тракту. Периферическая нервная система происходит из субнабора клеток нервного гребня туловища (NCCs), обозначаемых как вагусные клетки нервного гребня, происходящие непосредственно каудальнее заднего мозга в регионе между сомитами 1 и 7 (Burns et al., 2002; Durbec et al., 1996). Вагусные NCCs мигрируют вентрально и проникают в мезенхиму, окружающую примитивную кишечную трубку на ранних сомитных стадиях у эмбрионов (rev. Kuo and Erickson, 2010). NCCs мигрируют каудально, чтобы колонизировать развивающийся тонкий и толстый кишечник, а миграция регулируется несколькими путями, включая передачу сигналов netrin, Bmp и endothelin (Goldstein et al., 2005; Jiang et al., 2003; Nataf et al., 1996). Наконец, NCCs дифференцируются в нейрональные и глиальные клоны для этого используется репрессия нескольких сигнальных путей, включая Bmp и Notch (Chalazonitis et al., 2004; Goldstein et al., 2005).

Harnessing embryonic morphogenesis and tissue-tissue interactions to generate more functional intestinal tissues from PSCs

Мультиклональные вклады и межтканевые взаимодействия являются критическими для развития функционального кишечника. Возникла концепция, что одной из причин отсутствия функциональности многих клеток, происходящих из PSC, и тканей является отсутствие органного морфогенеза в культуре монослоя PSC. Напр., монослойная культура, дающая панкреатические эндокринные клетки, лишенные способности секретировать инсулин в ответ на глюкозу (D'Amour et al., 2006) и печеночные гепатоциты, имеющие профиль экспрессии энзимов, являющийся фетальным по природе (DeLaForest et al., 2011). Эти не физиологические двухмерные, (2D) монослойные культуры не могут воспроизвести многие морфогенетические процессы, происходящие во время развития энтодермы в органе. Попытки использовать почти трехмерные (3D) подходы для дифференцировки PSCs в основном применяли спонтанные агрегации в эмбриоидных телах. Однако стохастическая природа этого подхода делает его мало эффективным для управления дифференцировкой в специфические клетки и типы тканей. Более того, мало доказательств, что нормальный морфогенез происходит в эмбриоидных телах. Мы должны обсудить морфогенетические процессы, важные для развития кишечника и как они были использованы для управления морфогенезом PSCs в сложных, 3D кишечных 'органоидах' человека (HIOs; see Box 1).

Box 1. PSC-derived versus primary intestinal epithelial cultures: what is the difference?

One of the major advances in gastrointestinal biology includes long-term growth and expansion of individual adult ISCs in three-dimensional 'enteroid' cultures (Ootani et al., 2009; Sato et al., 2009; Sato and Clevers, 2013; Sato et al., 2011). Enteroids are also commonly referred to as 'mini-guts', as well as 'organoids' (Sato and Clevers, 2013). Human intestinal organoids (HIOs), however, are derived from pluripotent stem cells and are significantly different from enteroids, as recently discussed at length (Finkbeiner and Spence, 2013). Briefly, enteroids are derived from fully committed adult intestinal crypts (or single ISCs) that are isolated from human or mouse intestine (Gracz et al., 2013; Wang et al., 2013). Enteroids consist of epithelium only and are biased towards an undifferentiated stem-cell fate due to the culture conditions (Miyoshi et al., 2012). Enteroids have proven to be an unparalleled model in which to study molecular mechanisms by which adult intestinal stem cells are regulated and maintained, and are well suited to adult disease studies (de Lau et al., 2011; Dekkers et al., 2013;Zhou et al., 2013). HIOs, however, are generated by recapitulation of a developmental program and are therefore an unparalleled model in which to study human gastrointestinal development (Du et al., 2012). Both HIOs and adult enteroids have great potential as new in vitro models for drug screening, infectious disease and cancer.

Transition from 2D to 3D: formation of the primitive gut tube in the embryo

Вскоре после гаструляции все три зародышевых слоя подвергаются морфогенезу, который приводит к формированию сложных 3D структур, таких как нервная трубка, сомиты и кишечная трубка. Морфогенез кишечной трубки у птиц и млекопитающих инициируется на переднем и заднем концах эмбриона, при этом образуются передняя и задняя кишка, процесс полностью завершается в течение 36 ч. Во время этого процесса, 2D клетки DE подвергаются драматическим изменениям клеточной формы, начиная как уплощенные слущивающиеся клетки, но затем переходящие в кубовидный эпителий во время морфогенеза передней и задней кишки. Весь процесс формирования кишечной трубки завершается спустя 2 дня после окончания гаструляции у мыши, в течение этого времени эпителий кишечной трубки приобретает псевдостратифицированную морфологию (Fig. 2). Кроме того, эксперименты по отслеживанию клонов показали, что клетки энтодермы и мезодермы активно мигрируют латерально и вдоль передне-задней оси между ст. гаструлы и ст. развития кишечной трубки (Kimura et al., 2006; Lawson et al., 1991;Lawson et al., 1986; Lawson and Pedersen, 1987).

Сигнальные пути, контролирующие заднюю судьбу, такие как FGF и WNT, также регулируют поведение клеток энтодермы и мезодермы и участвуют в морфогенеза кишечной трубки. Не каноническая передача сигналов Wnt участвует в морфогенезе и элонгации задней кишки. Мутации в генах, кодирующих или Wnt5a или нижестоящие медиаторы неканонической передачи сигналов Wnt, таких как disheveled-interacting protein Dapper1 (Dact1), нарушают формирование задней кишки и впоследствии удлинение кишечника (Cervantes et al., 2009; Marlow et al., 2004; Rauch et al., 1997; Tai et al., 2009; Yamaguchi et al., 1999). Передача сигналов Fgf может также играть роль в морфогенезе путем регуляции миграции презумптивной мезодермы задней кишки. У эмбрионов кур, Fgf8 и Fgf4 действуют как хемоаттрактант и отталкивающий фактор, соотв., чтобы регулировать миграцию мезодермы латерально и кзади, когда эмбрион и задняя кишка вытягиваются в каудальном направлении (Yang et al., 2002).

Triggering gut tube morphogenesis in PSC cultures

Хотя пути Wnt and Fgf выполняют разные роли во время эмбрионального морфогенеза задней кишки, исследования с использованием культур PSC человека подтвердили, что FGF и WNT синергично действуют, чтобы способствовать экспрессии CDX2 и иницировать морфогенетический процесс, сходный с морфогенезом кишечной трубки in vivo (Figs 1, 2) (Spence et al., 2011b). Напр., in vivo эмбриональные DE образуются в виде уплощенного слоя клеток с морфологией, похожей на плоские клетки. Однако, как только начинается морфогенез кишечной трубки, DE клетки переходят к кубовидному типу эпителия, выстилающего развивающиеся переднюю и заднюю кишку (Fig. 2). Сходные переходы происходят с происходящими из PSC клетками DE, начинающими как плоский слой клеток, очень напоминающих плоский эпителий. Однако, спустя 4 дня воздействия FGF4 и WNT3a, DE клетки конденсируются в кубовидный эпителий и образуют структуры, подобные кишечной трубке.

Помимо эпителиального морфогенеза, наблюдаемого в культурах PSC, мезодерма также испытывает переходы, похожие на те, что наблюдаются пои морфогенезе кишечной трубки in vivo: FGF лиганды обеспечивают спецификацию, пролиферацию и миграцию мезодермы (Yang et al., 2002). В PSC культурах FGF4 обеспечивает экспансию мезодермы, которая формирует мезенхимное окружение эпителия структур, подобных кишечной трубке. Скорее всего, эти структуры кишечной трубки полностью детерминированы к кишечному клону, т.к. рост в 3D условиях, способствующих кишечной культуре (Sato et al., 2009) приводит к формированию кишечной ткани, а не др. производных кишечной трубки.

В дополнение к кишечному эпителию происходящие из PSC HIOs обнаруживают достоверный уровень мезенхимной сложности. Мезенхима в HIOs происходит из мезодермы, заселяющей ранние DE культуры и увеличивающейся в ответ на FGF4, чтобы сформировать слой примитивной мезодермы, окружающей развивающийся органоид (Spence et al., 2011b) (see Fig. 1). Эти примитивные мезенхимные производные дифференцируются параллельно с эпителием и формируют несколько дифференцированных типов клеток, таких как гладкие мышцы, субэпителиальные миофибробласты и фибробласты, в соответствии с развитием in vivo (Spence et al., 2011b).

Milestones during midgestational intestine development are mirrored in PSC-derived intestine

У эмбрионов мыши непосредственно после образования кишечной трубки (около E9.0), задняя кишка представлена просто кубовидным эпителием, который подвернгается серии изменений в течение следующих 6-7 дней, кульминацией которых является появление структур стереотипических ворсинок в постнатальном кишечнике (Fig. 3) (Spence et al., 2011a). Между E9.5 и E12.5, кишечный эпителий пролиферирует и увеличивается количество клеток, обхват и размер просвета, при этом кишечный эпителий и просвет по форме напоминают овал (Sbarbati, 1982). Недавнее исследование с использованием отслеживания генетических клонов и 3D конфокальной микроскопии продемонстрировали, что эпителий становится псевдостратифицированным примерно на ст. E12.5 (Grosse et al., 2011). Морфогенез ворсинок начинается на ст. E14.5, и приводит к образованию цилиндрического эпителия и структур стереотипичных ворсинок, проецирующихся в просвет. Кишечная мезенхима также участвует и действует как сигнальный центр, чтобы управлять морфогенезом ворсинок (Karlsson et al., 2000; Madison et al., 2005; Walton et al., 2012).

Вскоре после образования ворсинок около E16.5 у мыши пролиферирующие, находящиеся между ворсинками, клетки предшественники дают вновь дифференцированные клетки ворсинок, включающие энтероциты, бокаловидные и энтероэндокринные клетки. Конечно, Paneth клетки не дифференцируются вплоть до постнатального дня развития 14 (P14) у мыши и их дифференцировка происходит одновременно с ремоделированием ткани, которое отвечает за возникновение крипт (Calvert and Pothier, 1990; Kim et al., 2012). У человека крипты и клетки Paneth присутствуют с 22 недели беременности (Trier and Moxey, 1979).

Многие из эпителиальных характерных образований, появляющиеся на этой стадии кишечного развития, также возникают и при развитии in vitro кишечника из PSC, т.e. во время формирования HIOs (Fig. 3) (McCracken et al., 2011; Spence et al., 2011b). 3D кубовидный эпителий ранних кишечных органоидов дает псевдослойный эпителий, лежащий в основе воспроизведения морфогенеза ворсинок, за некоторыми исключениями. По мере продолжения роста органоида в культуре, псевдослойный эпителий переходит в столбчатый эпителий; однако, настоящие ворсинки не образуются. Вместо этого образуются похожие на ворсинки структуры, возникающие из эпителиальных выпячиваний, простирающихся в просвет. Эти структуры не являются настоящими ворсинками из-за отсутствия lamina propria, которая лежит в основании мезенхимной ткани, продуцирующей нервные, сосудистые, иммунные и поддерживающие клетки, обычно обнаруживаемые в стержне ворсинки. Хотя настоящие ворсинки не обнаруживаются в развивающихся HIOs, похожие на ворсинки структуры ведут себя подобно их аналогам in vivo и пролиферация ограничивается основанием ворсинко-подобной структуры, как и в домене предшественников между ворсинками и по преимуществу экспрессируют молекулярные маркеры домена меж ворсинками, включая Sox9. Более того, HIOs генерируют клетки, экспрессирующие маркеры для основных типов клеток кишечника: энтероцитов, бокаловидных, энтероэндокринных и Paneth клеток. Совместная экспрессия Gata4/Gata6 и присутствие Paneth клеток в HIOs подтверждают, что эти клетки больше всего похожи на клетки тонкого кишечника. Помимо основных клеточных типов тонкий кишечник in vivo обладает и др. типами клеток, включая tuft, cup и M-клетки; однако. остается неясным обладают ли HIOs этими типами клеток. HIOs также, по-видимому, подвергаются процессам, сходным с образованием крипт. В HIOs, маркер кишечных стволовых клеток Lgr5 не экспрессируется сильно во время ранних стадий развития органоида, но он экспрессируется в дискретных эпителиальных доменах после продолжительного культивирования. Важно подчеркнуть, что функциональная оценка всех типов клеток в органоидах не была проведена и многие из заключений сделаны на анализе маркеров. Следовательно, в этой системе всё более широко д. использоваться дополнительные уровни функциональной оценки индивидуальных типов клеток.

Future directions

Building a better intestine in vitro

Происходящие из PSC HIOs обладают несколькими базовыми функциональными свойствами; напр., они секретируют слизь в просвет и они компетентны абсорбировать дипептиды, указывая тем самым на функциональную транспортную систему дипептидов. Несмотря на эти наблюдения всё ещё неясно представляют ли собой HIOs 'зрелую' или 'незрелую' ткань. Недавнее исследование подтвердило, что происходящие из PSC кишечные ткани человека более сходны с кишечником плодов человека, чем с кишечником взрослого человека (Fordham et al., 2013). Важно, однако, что разные методы, используемые для генерации HIOs и поддержания их роста in vitro приводят в смущение сравнения одного исследования с др. В целом, генерация функциональных, зрелых клеток или тканей из культур PSC человека является манящей для многих типов тканей (Dolnikov et al., 2005; Si-Tayeb et al., 2010;D'Amour et al., 2006; Kroon et al., 2008). Недавно транскрипционный фактор Blimp1 (также известен как Prdm1) был идентифицирован как ключевой регулятор транскрипции от плодного доя зрелого эпителия кишечника, включя образование крипт (Harper et al., 2011; Muncan et al., 2011). Следовательно, идентификация сигнальных путей, которые репрессируют Blimp1 может быть одним из подходов усиления созревания HIOs.

Одной из потенциальных причин отсутствия созревания и/или функциональности является то, что in vitro полученные ткани лишены важных типов клеток, которые являются критическими для функции органа. Напр., даже если HIOs содержат важные типы клеток, произошедшие из мезодермы, которые важны для функции кишечника, такие как гладкомышечные миоциты, фибробласты и субэпителиальные миофибробласты (Powell et al., 2011), они лишены сосудистого сплетения и энтерической нервной системы (ENS), координирующих мышечные сокращения перистальтики. Отсутствие сосудистых и нервных сплетений и делает невозможным изучение нарушений подвижности кишечника. Принимая во внимание существующие протоколы генерации эндотелиальных клеток и NCCs из PSCs человека (Bajpai et al., 2010; Lee et al., 2007; Levenberg et al., 2002), можно будет инкорпорировать сосудистые и ENS предшественники в развивающиеся HIOs в надежде генерировать сосудистые и нервные сети в них. Пример подобного подхода недавно продемонстрирован, причем сосудистые предшественники были добавлены во время дифференцировки из PSCs в предшественники гепатоцитов (Takebe et al., 2013). Добавление сосудистых клеток приводит к образованию 3D печеночных зачатков с хорошо сформированными сосудистыми сплетениями и с улучшенной функциональностью in vivo.

Development and disease research

Хотя генерация пригодных для трансплантации сегментов кишечника in vitro всё ещё далека, полученные in vitro кишечные ткани человека позволяют беспрецедентные исследования развития, гомеостаза и болезней человека. Агонисты и антагонисты могут быть использованы для выяснения роли сигнальных путей во время морфогенеза, формирование паттерна и спецификации клеточных судеб кишечника. Используя стандартные генетические подходы с избыточной и недостаточной функцией, исследуются функции генов и идентифицируются генетические регуляторные сети, участвующие в развитии и морфогенезе клонов. Альтернативно, iPSC технология может быть использована для идентификации молекулярных основ врожденных нарушений человека, затрагивающих кишечник, таких как кистозный фиброз и генетические формы нарушений абсорбции (Wang et al., 2006a). Благодаря легкости манипуляций и получения изображений подходы, базирующиеся на органоидах человека, являются мощным инструментом для изучения широкого разнообразия др. болезненных процессов. Внесение вирусных и бактериальных патогенов в просвет органоидов делает возможными новые исследования инфекционных болезней и облегчают идентификацию путей, обеспечивающих взаимодействия хозяина с патогеном (Finkbeiner et al., 2012). Органоиды, происходящие из PSCs или взрослых тканей могут быть также использованы для изучения внешнесредовых и генетических причин инициации и прогрессирования (Ootani et al., 2009). Наконец, часто приписываемые лекарства оказывают побочные эффекты на кишечник, поэтому HIOs могут быть использованы для быстрого скрининга лекарств с хорошей абсорбцией и незначительными кишечными осложнениями.

Современные усилия сфокусированы также на засевании поврежденного кишечного эпителия ISCs взрослых (Yui et al., 2012). Этот подход приводит к внедрению и экспансии трансплантированных клеток; однако, технически это затруднено и вряд ли будет широко использоваться особенно в более проксимальных регионах кишечного тракта. Более того, этот подход не помогает индивидам, страдающим от синдрома короткого кишечника. Недавние успехи в искусственном преобразовании тканей сделали возможной генерацию искусственной трахеи для трансплантации (Jungebluth et al., 2011). Сходные подходы, использующие эндогенные или биосинтетические поддержки будут возможны и для кишечника.

Human organoids are fueling a renaissance of in vitro studies of human intestinal development and disease. Organoid-based research is especially powerful when combined with new technologies such as gene targeting, real-time high content imaging, and fluidics-based platforms to grow multiple tissue-type organoids on chips to mimic systemic organ interactions.

How to make an intestine James M. Wells and Jason R. Spence Development. 2014 Feb;141(4):752-60. doi: 10.1242/dev.097386.

How to make an intestine
James M. Wells and Jason R. Spence
Development. 2014 Feb;141(4):752-60. doi: 10.1242/dev.097386.