Sox9 был определен как ключевой регулятор тканевых стволовых клеток и клеток предшественников во время развития в некоторых органных системах [18]-[22],[28], совсем недавно он был связан с функцией раковых стволовых клеток [24]. Потенциальная роль Sox9 в регуляции функции стволовых клеток и клеток предшественников молочных желез выяснилась в недавних исследованиях, использовавших эктопическую экспрессию и анализ клонов раковых клеток груди. Однако физиологическая роль Sox9 в развитии молочных желез и стволовых клеток и клеток предшественников молочных желез оставалась неизвестной. Здесь мы использовали подход условной делеции гена для получения in situ доказательства физиологической роли Sox9 как важного регулятора развития молочных желез. Мы также использовали кратковременный и долговременный анализ отслеживания клонов, чтобы выявить роль Sox9 в поддержании стволовых клеток молочных желез и просветных предшественников.

Наше заключение, что Sox9 является важным компонентом программы развития молочных желез, базируется на существенной задержке постнатальной элонгации и ветвления протоков молочных желез у мышей с MMTV-Cre управляемой делецией Sox9 (Figure 1). Дефекты в развития особенно тяжелые в ранних временных точках (3 недели постнатального развития), но сопровождаются постепенным восстановлением, при этом по существу дефекты исчезают в возрасте 8 недель. Мы полагаем, что восстановление от онтогенетического блока, накладываемого с помощью делеции Sox9, преодолевается за счет экспансии эпителиальных клеток молочных желез, в которых делеция Sox9 не возникает из-за известной мозаичности экспрессии используемого MMTV-Cre (Figure 2). К сожалению прямое окрашивание на Sox9 невозможно из-за отсутствия специфических анти-Sox9 антител. Некоторые антитела, которые мы протестировали обнаруживали незначительною или неспецифическую реактивность при western blotting, IHC, IF (Additional file 1: Figure S3). Поэтому мы использовали экспрессию Cre в качестве суррогата делеции Sox9 и установили, что клетки с делецией Sox9 теряются у cKO мышей в возрасте 8 недель (Figure 2). Соотв., отсутствуют последующие дефекты развития молочных желез, определяемые во время беременности и лактации. Эти результаты предполагают, что делеция Sox9 позволяет предшественникам молочных желез освободиться от онтогенетических повреждений. Наши усилия по получению условной делеции Sox9 в молочных железах с использованием K14-Cre, который активен по время эмбриональной стадии плакод молочных желез [34], оказались неосуществимыми из-за перинатальной гибели мышей с целенаправленной делецией. Однако, отсутствие молочных желез в редких случаях кратовременно живущих особей подтверждает заключение, достигнутое на базе использования MMTV-Cre управляемых Sox9 нокаутных мышей (data not shown). Наши результаты напоминают более тяжелые фенотипы делеции гена с использованием K14-Cre в противовес MMTV-Cre, описанным для делеции GATA-3 [30]. Индуцибельная модель, представленная здесь предоставляет поддающуюся обработке систему для дальнейшего изучения клеточных и молекулярных основ функции Sox9 в молочных железах.

Ввиду важности Sox9 в развитии молочных желез, мы рассматриваем возможность, что Sox9 важен для функционирования популяций стволовых клеток и клеток предшественников молочных желез в качестве источника онтогенетического роста и экспансии молочных желез. Чтобы протестировать эту возможность беспристрастным способом, мы осуществили исследование по отслеживанию клонов с использованием Sox9-управляемого с помощью Cre, чтобы выйти на репортеров, которые позволят нам отследить потомство Sox9-экспрессирующих предшественников. Когда такое исследование было проведено в ходе эмбрионального развития (используя не индуцибельный Sox9-Cre), то все эпителиальные клетки молочных желез, включая просветные и миоэпителиальные/базальные слои клеток оказались униформно позитивными в отношении экспрессии репортерного гена (Figure 5). Принимая во внимание этот результат, 4 недели слежки после индукции tamoxifen-индуцибельного Sox9-CreERT2 драйвера у постнатальных мышей привело к появлению потомства от Sox9-экспрессирующих предшественников как в просветной, так и миоэпителиальной/базальной популяциях клеток молочных желез (Figure 4). Эти исследования подтвердили, что экспрессия Sox9 маркирует ранние бипотентные MaSCs, однако, мы не смогли устранить возможность, что Sox9 мог экспрессироваться как в просветных, так и миоэпителиальных предшественниках. Ввиду этих дефектов развития молочных желез после делеции Sox9 (обсуждено выше), мы предположили, что Sox9 является важным регулятором программы развития MaSCs. Более того, ранее мы опубликовали сообщение о выделении и иммортализации линии MaSC человека, которая способна дифференцироваться в миоэпителиальный клон [35]. Данные Western blot подтвердили, что экспрессия Sox9 заметно выше в иммортализованных линиях MaSC в противовес их потомству, дифференцированному в направлении миоэпителиального клона (Additional file 1: Figure S2). Более того, делеция Sox9 приводит к ингибированию пролиферации как человеческих молочных эпителиальных, так и мышиных молочных эпителиальных клеток (Additional file 1: Figure S1 and S2).

Несколько недавних исследований подтвердили наше заключение, что Sox9 выполняет критическую функцию в поддержании MaSCs. Напр., эктопическая совместная экспрессия Sox9 и Slug репрограммирует зрелые просветные эпителиальные клетки молочных желез в MaSCs, способные генерировать подобные молочным железам выросты из трансплантатов [24]. Подавление Wnt-1-индуцируемого сигнального белка-2 (WISP2) в довольно хорошо дифференцированных клетках линии рака груди MCF7 способствует появлению клеток с фенотипом, подобным раковым стволовым клеткам, при этом наблюдается усиление активности SOX9 [36]. В др. исследовании экспрессия miR-140, которая нацелена непосредственно на Sox9,как было установлено, снижает рак груди у пациентов и количества раковых стволовых клеток и ассоциированное увеличение экспрессии SOX9 [37]. Высокая экспрессия Sox9 в базальных подобных раку груди клетках коррелирует с плохим прогнозом и активацией пути Wnt/β-catenin, а замалчивание SOX9 снижает пролиферацию и инвазию клеток [38]. Более того, избыточная экспрессия в клеточных линиях повышает передачу сигналов Wnt, а трансгенная избыточная экспрессия в молочных железах мышей увеличивает ветвление вторичных протоков [38]. Поскольку Sox9 является мишенью для Wnt в др. системах стволовых клеток [39], и накапливаются доказательства, подтверждающие ключевую роль пути Wnt/β -Catenin в поддержании MaSCs [9],[40], было бы разумным предположить, что Sox9 является важным компонентом поддержания MaSC с помощью Wnt/β-Catenin и потенциально др. путей.

Отметим две важные находки в нашем исследовании, указывающие на более важную роль Sox9 в регуляции просветных предшественников. Вo-первых, кратковременное отслеживание клонов почти исключительно метит слой просветных клеток молочных желез, а FACS анализ с использованием CD61 подтверждает, что меченная популяция является просветными предшественниками (Figure 3). Во-вторых, когда мы осуществляли отслеживание клонов в контексте делеции Sox9, вызываемой с помощью MMTV-Cre, мы отметили, что потомство от предшественников с делецией Sox9 отсутствует из компартмента просветного эпителия, но такие клетки всё ещё присутствовали внутри компартмента миоэпителиальных/базальных клеток и могут представлять потомство от ограниченных миоэпителиальных предшественников, которые подверглись делеции Sox9 (Figure 6). Эти результаты подтвердили, что функция Sox9 может быть особенно критической для развития просветного клона. Селективное мечение просветных предшественников после кратковременного отслеживания согласуется с этим заключением. Эта идея далее была подтверждена недавними находками, что эктопическая экспрессия Sox9 в зрелых молочных эпителиальных клетках превращает их в клетки, экспрессирующие маркеры просветных предшественников [24].

Итак, представленные находки демонстрируют физиологическую роль Sox9 в развитии молочных желез. Наши результаты, рассматриваемые в свете недавних публикаций, указывают на Sox9 как ключевой регулятор поддержания молочных стволовых клеток и клетокпросветных предшественников. Получены доказательства, что Sox9 может вносить вклад в поддержание стволовых клеток рака груди, модель индуцибельной делеции Sox9 и информация, представленная здесь, д. облегчить дальнейшие попытки оценить Sox9 как биомаркер или терапевтическую мишень рака груди.