Вызванное повреждением возникновение Ca²⁺, экзоцитоз и репарация плазматической мембраны

Давно известно, что поврежденные эукариотические клетки репарируют ранения клеточной плазматической мембраны в несколько секунд с помощью механизма, сильно зависящего от внеклеточного Ca²⁺, поступающего в клетки через повреждение, запускающего локальный взрыв экзоцитоза, процесс, необходимы1 для репарации плазматической мембраны 3 and 4. Ультраструктурный анализ показал, что присутствие крупных внутриклеточных пузырьков вблизи раны [3], это привело к предположению, что приток Ca²⁺ вызывает слияние гомотипичных пузырьков, образуя крупные экзоцитотические мембранные заплатки, способствующие лигированию после слияния с раной [5]. Однако, большинство из этих ранних исследований не использовало специфические маркеры для идентификации вызываемых повреждениями внутриклеточных пузырьков и для подтверждения их exocytic происхождения. Недавние исследования пересмотрели этот вопрос и сделали неожиданные наблюдения, подтвердившие важную роль экзоцитоза в заживлении ранений клеток, но выявили дополнительные механизмы, которые, по-видимому, участвуют непосредственно в удалении повреждений, а не просто в накладывании заплатки на поврежденную мембрану.

Figure 1. Proposed mechanisms for plasma membrane repair. Small wounds (<100 nm) such as those generated by pore-forming toxins were proposed to be repaired by two mechanisms: (A) endocytosis of caveolar vesicles [16]; and (C) ESCRT-mediated vesicle budding [27]. Large wounds (>100 nm) were proposed to be repaired by: (B) a mechanism involving endocytosis, clustering, and fusion of caveolae that leads to wound constriction [16]; or (D) patching by a large intracellular exocytic vesicle proposed to fuse at several points at the periphery of the wound, resulting in shedding of the damaged membrane [25]. Internalization of streptolysin O (SLO) pores in caveolar vesicles has been observed [16], but direct evidence for extracellular shedding of wounded plasma membrane remains unavailable

Figure 2. Transmembrane pores formed by streptolysin O (SLO) are internalized in caveolar vesicles that gradually traffic into lysosomes for degradation. During the first 30 s after cell permeabilization with SLO in the presence of Ca2+, individual caveolae accumulate at the cell periphery. In subsequent minutes, caveolar vesicles carrying SLO pores merge, forming larger compartments. SLO pores are ultimately sorted into luminal vesicles of multivesicular bodies and degraded in mature lysosomes [26]. The images show transmission electron microscopy of endocytic vesicles observed in normal rat kidney (NRK) cells at increasing time points after permeabilization with SLO; the arrows point to bovine serum albumin (BSA)–gold used as an endocytic tracer.

Plasma membrane repair is mediated by lysosomal exocytosis

Запускаемый Ca²⁺ экзоцитоз рядом с ранением плазматической мембраны первоначально был обнаружен на изображениях, где клетки метились в течение нескольких часов липофильными красками. Такие краски метят многие внутриклеточные органеллы, так что эти ранние эксперименты не позволяли идентифицировать участвующие пузырьки [3]. Последующие исследования установили, что специфические маркеры лизосом, такие как просветные эпитопы гликопротеина Lamp1, появляются на клеточной поверхности после повреждения [6]. Это наблюдение, хотя первоначально показалось неожиданным, было подтверждено на нескольких типах клеток после разных форм повреждений, включая наносимые бактериальными и простейшими патогенами 7 and 8. Лизосомные гидролазы высвобождаются в суперталант раненых клеток в присутствии, но не в отсутствии Ca²⁺ [9], это согласуется с находкой, что обычные лизосомы ведут себя как зависимые от Ca²⁺ секреторные пузырьки [10]. До этих исследований зависимый от Ca²⁺ экзоцитоз, как полагают, участвует только в органеллах, родственных лизосомам в специализированных клетках, таких как цитотоксические лимфоциты, меланоциты и альвеолярные клетки лёгких [11]. Ясно, что способность сливаться с плазматической мембраной на подъеме внутриклеточного Ca²⁺ является свойством лизосом, обнаруживаемых во многих различных типах клеток, включая клетки, не специализированные ы отношении секреции, регулируемой Ca²⁺ 12-14. Зависимый от Ca²⁺ экзоцитоз также происходит и в поврежденных мышечных волокнах 15 and 16.

Ca²⁺ -запускаемый экзоцитоз лизосом непосредственно наблюдался с помощью total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M) и эти исследования показали, что большинство лизосом сливаются с плазматической мембраной, относящейся к предсуществующей membrane-proximal популяции [17]. Ca²⁺ -регулируемый экзоцитоз лизосом происходит в двух формах - полное слияние или поцелуй и бегство (kiss and run) [18] - и может регулироваться с помощью двух мембранных белков лизосом, Ca²⁺ сенсор Syt VII и транспортер катионов mucolipin 1. Syt VII предоставляет пригодный инструмент для демонстрации, что Ca²⁺-регулируемый лизосомный экзоцитоз необходим для репарации плазматической мембраны [6]. Считается, что лизосомы способствуют восстановлению плазматической мембран, предоставляя внутриклеточную мембранную заплатку, которая должна прикладываться непосредственно на раневую мембрану, репарируя повреждение [5]. Однако в экспериментах с использованием локальных ранений с помощью микроинъекционой иглы лизосомный маркер Lamp1 был обнаружен в виде точечного рисунка, окружающего место ранения - наблюдение, не согласующееся со слиянием крупной, происходящей из лизосом заплатки непосредственно с раной [6]. Кроме того, модель заплатки на репарирууемую плазматическую мембрану не объясняет удовлетворительно, как повреждения, формируемые за счет инсерции стабильных, выстланных белком трансмембранных пор, могут быть репарированы.

Wounded membrane is actively removed

Будучи поврежденные клетки эукариот репарируются в несколько секунд. Вызываемый повреждением приток Ca²⁺ вызывает экзоцитоз лизосом, считалось, что это способствует репарации за счет наложения 'заплатки' на рану. Новые доказательства показали, что заживление связано с непосредственным удалением раны. Экзоцитоз лизосомной acid sphingomyelinase (ASM) запускает эндоцитоз повреждений, сопровождаемый их внутриклеточной деградацией. Анализ и характеристика индуцированных повреждениями эндосом выявили роль кавеол (caveolae), инвагинаций плазматической мембраны, обогащенной сфинголипидами, которые затягивают внутрь (интернализуют) вызванные токсином прорехи (поры). Известно, что они многочисленны в клетках, подвергающихся механическим стрессам. Эти находки предоставляют новое механистическое объяснение патологии мышц, ассоциируемой с мутациями белков кавеол. Ремоделирование мембран с помощью ESCRT комплекса, как было установлено, также участвует в репарации небольших ран, подчеркивая, что заживление клетки использует ранее нераспознанные механизмы удаления повреждений, отличающиеся от модели заплатки.

Box 1. Ceramide generation and plasma membrane invagination Sphingomyelin is a major sphingolipid of animal cells, present at high concentration in the outer leaflet of the plasma membrane [69]. Sphingomyelinase, a sphingomyelin-specific type C phospholipase, cleaves the phosphorylcholine head group of sphingomyelin, generating ceramide, a small lipid with a less-hydrated head group and two long, saturated hydrophobic chains. Ceramide increases the order of acyl chains in lipid bilayers, leading to a tighter packing and self-aggregation process that results in the formation of ceramide-enriched microdomains. The smaller area occupied by ceramide compared with other membrane lipids can induce outer membrane leaflets to condense and form an inverted nonlamellar phase, a process that can cause membrane invagination (Figure I). The driving force for invagination may be provided by the area difference between the adjacent monolayers and by the negative spontaneous curvature of the ceramide-enriched domain. Through this mechanism, growth of the ceramide-enriched microdomain can lead to the formation of an enclosed cavity, as demonstrated experimentally in giant liposomes [38]. In agreement with this proposed mechanism, exogenous addition of C6-ceramide or sphingomyelinase to fibroblasts and macrophages results in endocytic vesicle formation 36 and 70. Although ceramide has been suggested to have second-messenger roles in cells, it is important to note that it does not transfer spontaneously between lipid bilayers and has a slow flip-flop rate (estimated as about 22 min [71]). This suggests that ceramide is initially restricted to the bilayer side where it is generated, indicating that it may act primarily through membrane remodeling events such as microdomain formation, membrane vesiculation, and vesicular trafficking [43].

Proposed mechanism for ceramide-mediated membrane invagination.

Figure 3. Caveolae-like vesicles accumulate below the sarcolemma of primary muscle fibers in response to injury or exposure to purified sphingomyelinase. (A) Transmission electron microscopy (EM) images of mouse flexor digitorum brevis muscle fibers untreated (Control), exposed to 50 mU/ml Bacillus cereus sphingomyelinase for 5 min, or treated with 400 ng/ml streptolysin O (SLO) for 30 s. (B) Transmission EM image of the mechanically severed tip of a flexor digitorum brevis muscle fiber. Arrows in the enlarged section to the right point to merged caveolae-derived compartments below the sarcolemma. Bars, 100 nm. (C) Proposed caveolae-mediated mechanism for the resealing of mechanical wounds on a muscle fiber. Ca2+ flowing through a wound would induce internalization and intracellular merging of sarcolemma-associated caveolae, leading to the formation of larger compartments tethered to the sarcolemma that constrict and ultimately reseal the wound.

Concluding remarks

Surprising recent developments revealed that nucleated cells repair wounds on their plasma membrane by mechanisms involving lesion removal, which differs significantly from the previously proposed patch model. The role of Ca²⁺-induced exocytosis of lysosomal ASM in triggering endocytosis and lesion internalization suggests that other lysosomal hydrolases could also be involved in remodeling the cell surface to facilitate resealing. Although many questions remain (Box 4), it will be interesting to determine whether lysosomal proteases participate in this process, perhaps by cleaving cell surface proteins to facilitate the access of lipases to the lipid bilayer or by activating other enzymes through proteolytic processing. It will also be of great interest to determine whether only pre-existing caveolae are internalized after plasma membrane wounding or whether ceramide generated on the outer cell surface by sphingomyelin hydrolysis leads to de novo caveola formation. Another important topic for further investigation should be the identification of early events in the repair process. Injured cells reseal within 30 s of injury [5] and increasing evidence indicates that mechanisms may be in place to prevent loss of cytosol before the integrity of the plasma membrane can be fully restored. Previous reports suggesting the involvement of calpain, annexins, and/or transglutaminases in plasma membrane repair 22, 29, 31 and 68 propose that these Ca²⁺-dependent cytosolic proteins generate a barrier to cytosolic loss at wound sites, an intriguing possibility that should be investigated. Finally, recent evidence for the involvement of the ESCRT membrane-sculpting machinery in the shedding of small lesions from cells will encourage additional investigations, which are likely to be facilitated by established protocols for cell permeabilization using pore-forming toxins. The pace of discoveries in this field will continue to accelerate, gradually uncovering more details of the fascinating cellular machinery dedicated to restoration of plasma membrane integrity.

Damage control: cellular mechanisms of plasma membrane repair Norma W. Andrews, Patricia E. Almeida, Matthias Corrotte Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 12, December 2014, Pages 734–742

Damage control: cellular mechanisms of plasma membrane repair
Norma W. Andrews, Patricia E. Almeida, Matthias Corrotte
Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 12, December 2014, Pages 734–742