Конечности позвоночных предоставляют мощную систему для изучения формирования тканевого паттерна и морфогенеза. Конечности позвоночных это очень сложная мышечно-скелетная система с более 40 самостоятельными мышцами, соединенными с помощью сухожилий со скелетными элементами. Морфология каждой индивидуальной мышцы и кости предназначена для выполнения специфической функции, чтобы осуществлять крупного масштаба движения и тонкий контроль движений конечностей. Эти ткани д. быть тонкого рисунка и интегрированы во время развития, чтобы сформироваться соответственно. Накоплены значительные знания относительно молекулярных путей, участвующих в дифференцировке каждого типа ткани: мышц, сухожилий и костей (Buckingham et al., 2003; Karsenty et al., 2009; Tozer and Duprez, 2005). Однако существенно меньше известно о том, как собственно интегрируются одна с др., чтобы давать функциональные единицы для передвижения.
Hox гены давно считаются как важные паттерн-формирующие сигналы вдоль передне-задней оси скелета позвоночных и проксимо-дистальной оси скелета конечностей (Izpis?a-Belmonte and Duboule, 1992; Mallo et al., 2010; Wellik, 2007). Имеется высокой степени сходство последовательности и функционального перекрывания между членами внутри группы Hox паралогов (Mallo et al., 2009; Wellik, 2007). Потеря функции Abdominal-B класса Hox генов из групп паралогов 9-13 ведет к нарушению формирования паттерна скелетных элементов конечностей внутри специфических поксимо-дистальных регионов, тогда как др. регионы конечности остаются в основном не затронуты. Гены паралоги Hox9 и Hox10 формируют паттерн скелета stylopod (бедро или плечевая кость) (Fromental-Ramain et al., 1996a; Wellik and Capecchi, 2003), Hox11 гены действуют в zeugopod (radius/ulna, tibia/fibula) (Boulet and Capecchi, 2004; Davis et al., 1995; Wellik and Capecchi, 2003) , а Hox13 гены необходимы для развития аутопода (Fromental-Ramain et al., 1996b). Во время морфогенеза конечностей обнаружены динамические паттерны экспрессии для Hox генов. Они сначала экспрессируются широко в дистальной части мезенхимы раннего зачатка конечности, а позднее ограничиваются действием вдоль проксимо-дистальной оси, регионами, в которых они формируют паттерн, при этом гены Hox9 и Hox10 наиболее проксимальны, а гены Hox13 наиболее дистальны (Izpis?a-Belmonte and Duboule, 1992; Nelson et al., 2008;Zakany and Duboule, 2007).
Используя
Hoxa11eGFP knock-in аллель с потерей функции, чтобы визуализовать экспрессию гена Hox11 и получить информацию о возможных механизмах формирования паттерна Hox элементов скелета конечностей, мы получили неожиданный результат, что экспрессия гена
Hox11 в основном исключена из конденсирующегося хряща с самых ранних стадий. Гены
Hox11 экспрессируются строго в наружном слое надхрящницы развивающегося zeugopod, по всем сухожилиям, а также в мышечной соединительной ткани zeugopod передних конечностей. В отсутствие Hoxa11 и Hoxd11, формирование паттерна мышц и сухожилий в zeugopod передних конечностей сильно нарушено, в дополнение к ранее описанным дефектам скелета, тогда как формирование мышечно-скелетного паттерна регионов stylopod и autopod в основном не затронуто. У
Hox11 мутантов отсутствуют многочисленные мышцы и сухожилия, а др. неспособны отделиться в соотв. образом сформированные мышечные пучки. У компаундных мутантов с одиночным аллелем дикого типа или
Hoxa11 или
Hoxd11, скелет конечности развивается нормально в ходе эмбриональных стадий; однако, формирование паттерна мышц и сухожилий нарушено, демонстрируя тем самым, что дефекты формирования паттерна сухожилий и мышц не являются вторичными нарушениями из-за морфологи скелета. Наши находки сдвигают образ функционирования Hox в формировании мышечно-скелетного паттерна с того, при котором Hox гены оказываются критическими факторами для формирования скелетного паттерна, к такому, который распознает их критическую роль в формировании паттерна и интеграции всех трех типов тканей скелетно-мышечной системы; костей, сухожилий и мышц. Экспрессия генов
Hox11 в zeugopod подтверждает, что Hox действуют регионально в соединительной ткани, чтобы контролировать эти события во время развития.
DISCUSSION
Значительная часть нашего понимания роли генов Hox в формировании паттерна получена благодаря анализу скелетного фенотипа при потере функции Hox. Наши результаты показывают, что аллельHoxa11eGFP экспрессируется широко по всему зачатку конечности на ранних стадиях и ограничивается наружной частью надхрящницы, сухожилиями и фибробластами мышечной соединительной ткани региона zeugopod, когда конденсируется скелетный зачаток. Клетки перихондрия секретируют разные факторы, которые сильно влияют на хондрогенную дифференцировку (Karsenty, 2008; Kronenberg, 2007). Эти данные подтверждают, что гены Hox могут осуществлять свое влияние на развитие скелета, регулируя экспрессию паракринных факторов внутри надхрящницы и тем самым направляя рост подлежащего хряща.
C потерей функции Hoxa11 и Hoxd11 клетки предшественники сухожилия, по-видимому, специфицируются нормально, также как и хрящевая матрица zeugopod специфицируется соотв. образом; однако, формирование паттерна сухожилий в регионе zeugopod сильно нарушено. Сухожилия это специализированная соединительная ткань, которая связывает мышцы с костью и модулирует силы во время движения. Зачатки сухожилий возникают в мезенхиме конечности в дорсальной и вентральной областях конечности и впоследствии выстраиваются между мышечными массами и скелетными элементами (Schweitzer et al., 2001). Позднее морфогенез сухожилий нуждается в присутствии мышц, поскольку предшественники сухожилий прогрессивно теряются в отсутствии инвазии мышц (Bonnin et al., 2005; Edom-Vovard et al., 2002; Kardon, 1998; Kieny and Chevallier, 1979). Эксперименты по удалению сухожилий подтвердили, что сухожилия вносят вклад в формирование паттерна мышц путем ограничения мышечных доменов во время развития (Kardon, 1998). У Hox11 мутантов предшественники сухожилий обнаруживаются, но они не дифференцируются нормальным образом; они бедны пучками, а некоторые сухожилия в zeugopod неспособны формироваться. Наивысшие уровни экспрессии Hoxa11eGFP во всех клетках сухожилий указывают на прямую роль Hox генов в морфогенезе сухожилий.
Наши результаты также продемонстрировали сильные нарушения в формировании паттерна мышц в zeugopod с потерей генов Hox11, тогда как др. регионы конечности остаются незатронутыми. В противоположность др. компонентам скелетно-мышечной системы, таким как кости, сухожилия и мышечная соединительная ткань, которые возникают из клеток внутри мезодермы латеральной пластинки, мышечные клетки мигрируют из осевых сомитов в зачаток конечности, где они пролиферируют, агрегируют и дифференцируются, чтобы сформировать дорсальные и вентральные мышечные массы. Эти массы впоследствии сегрегируют в индивидуальные, анатомически отличающиеся мышечные массы, чтобы достичь финального паттерна мышц (Chevallier et al., 1977; Christ et al., 1977b; Ordahl and Le Douarin, 1992; Wachtler et al., 1981). Эксперименты с эмбриологическими манипуляциями показали, что мышечные клетки не обладают прирожденной регуляторной информацией для становления паттерна; скорее всего, эта информация передается посредством клеток в мезодерме латеральной пластинки. В экспериментах, где сомиты из аксиальных уровней вне обычного региона образования конечностей трансплантировали, чтобы заместить сомиты, соотв. уровняю конечности, то мышечные клетки, мигрирующие в конечность, оказались способны давать нормальные мышцы конечностей (Chevallier et al., 1977; Christ et al., 1977b). Кроме того, классические эксперименты по трансплантации между перепелом и курицей и анализ клонов от одиночной клетки показали, что индивидуальные миогенные клетки не предетерминированы давать какую-либо определенную анатомическую мышцу (Chevallier et al., 1977; Christ et al., 1977b; Christ et al., 1977a; Kardon et al., 2002). Эти исследования показали, что клетки внутри мезенхимы конечности предоставляют сигналы, необходимыеe для формирования паттерна мышц. Эксперименты с конечностями, лишенными мышц, показали, что мышечная соединительная ткань организуется в самостоятельные морфологические группы в отсутствие мышечной инвазии, указывая тем самым, что мышечная соединительная ткань регулирует формирование паттерна мигрирующих миобластов (Chevallier and Kieny, 1982; Grim and Wachtler, 1991). Факторы, ответственные за формирование паттерна мышц, изучены недостаточно. Полученные нами данные подтверждают роль Hox генов в формировании паттерна региональных мышц благодаря своей экспрессии в соединительной ткани. Мышечные массы, которые отсутствуют в конечностях у двойных Hox11 мутантов имеют места закладки сухожилий, по крайней мере, частично на скелетных элементах zeugopod. Это согласуется с ролью генов Hox11 в соединительной ткани для становления соотв. скелетно-мышечных соединений в регионе zeugopod, приводя в конечном итоге к продукции самостоятельных групп мышц.
Скелет zeugopod двойных Hox11 мутантов драматически укорачивается, возникает вопрос, могут ли наблюдаемые дефекты мышц и сухожилий у этих животных, фактически быть вторичными пертурбациями из-за морфологии скелета. Поэтому мы анализировали конечности Hox11 компаундных мутантов, у которых один аллель Hox11 оставался функциональным, это позволило скелету развиваться относительно нормально на эмбриональных стадиях. Формирование паттерна мышц и сухожилий у этих животных было нарушено, демонстрируя, что эти дефекты не являются косвенным результатом нарушений скелета, а обнаруживают независимую роль генов Hox в формировании паттерна компонентов мягких тканей скелетно-мышечной системы. Существенные нарушения формирования паттерна мышц и сухожилий у Hox11 компаундных мутантов демонстрируют, что мышцы и сухожилия более чувствительны к потере генов Hox11, чем скелетные элементы во время развития. Причиной этих отличий, по-видимому, служат различия в чувствительности к дозе, что предстоит исследовать.
Хотя экспрессия Hox в зачатках ранних конечностей перед дифференцировкой мезодермы в специфические типы тканевых клеток широкая, эта экспрессия быстро становится локализованной в регионе конечности, где проявляется их паттерн-формирующая функция. Экспрессия в основном ограничена на этих стадиях соединительной тканью. Эта экспрессия сохраняется в ходе всего развития клеток соединительной ткани. Предыдущие исследования экспрессии Hox и функции в конечности преимущественно концентрировались на ранней широкой экспрессии Hox генов в мезенхиме конечностей и базировались на анализе целых зачатков конечностей скорее, чем на более детальном исследовании тканеспецифичных паттернов экспрессии. Наши результаты подтвердили возможную непрерывную роль Hox генов на всем протяжении развития конечностей.
Во время развития мышцы. сухожилия и кости д. быть тонко скоординированы, чтобы продуцировать функциональную систему. Однако образование каждой из этих тканей часто изучается в отдельности. Поэтому достигнуты важные знания о механизмах дифференцировки каждой из этих индивидуальных тканей; однако значительно меньше известно относительно того, как эти ткани интегрируются. Наши результаты демонстрируют, что Hox гены являются критическими те только для формирования паттерна скелета, но и также формирования паттерна мышц и сухожилий, чтобы давать регионально интегрированную, функциональную скелетно-мышечную систему. Данное исследование демонстрирует важную роль генов Hox в формировании паттерна тела позвоночных и сдвигает порядок функционирования Hox в развитии скелетно-мышечной системы как критических факторов для формирования морфогенеза скелета на порядок, при котором эти гены являются критическими факторами для формирования паттерна и интеграции всех скелетно-мышечных тканей.
