Нервная ткань Xenopus laevis приобретает свою сложную структуру посредством сложных процессов. Нейральная индукция, как полагают, происходит вследствие миграции дорсальной мезодермы, известной как Шпемановский организатор, и последующего контакта с презумптивной нейроэктодермой во время гаструляции. Гены, которые кодируют нейрализующие факторы, такие как noggin, chordin и follistatin экспрессируются в дорсальной мезодерме (Smith and Harland, 1992; Lamb et al., 1993; Smith et al., 1993; Sasai et al., 1994; Hemmati-Brivanlou et al., 1994), и кодируют белки, индуцирующие образование нервной ткани с помощью, противодействующей передачи сигналов bone morphogenetic protein (BMP) в нейроэктодерму (Sasai et al., 1994; Zimmerman et al., 1996; Hemmati-Brivanlou et al., 1994).
Lетальное формирование паттерна нейрального региона вдоль antero-posterior (A-P) оси также происходит во время гаструляции. Передняя мезодерма (также наз. головным организатором) индуцирует передние структуры, тогда как хордомезодерма (наз. организатором туловище-хвост) индуцирует развитие спинного мозга. Предыдущие исследования показали, что канонический путь передачи сигналов Wnt играет важную роль в формировании нейрального АР паттерна. В самом деле, ингибирование передачи сигналов как BMP, так и канонической передачи сигналов Wnt необходимо и достаточно, чтобы индуцировать голову (Glinka et al., 1997). Передняя мезэнтодерма секретирует cerberus, dickkopf-1 и frzb, каждый из которых противодействует Wnt и способствует anteriorization (Bouwmeester et al., 1996; Glinka et al., 1998; Leyns et al., 1997; Wang et al., 1997, Piccolo et al., 1999).
Формирование нейрального паттерна включает индукцию нервного гребня и передней краниальной плакоды между эпидермисом и нервной пластинкой, а индукция этих структур нуждается в соотв. уровнях BMP, fibroblast growth factor (FGF), retinoic acid (RA) и передачи сигналов Wnt (Durston et al., 1989; LaBonne and Bronner-Fraser, 1998; Villanueva et al., 2002; Marchant et al., 1998). Однако, недавние исследования показали, что образование нейрального региона нуждается также в дополнительных процессах. Напр., избыточная экспрессия антагонистов BMP в компетентном эпибласте кур не всегда вызывает экспрессию генов нейральных маркеров, а BMP белок действительно не оказывает эффекта на развитие нервной пластинки (Linker and Stern, 2004).
Кроме того, ранняя каноническая передача сигналов Wnt у эмбрионов Xenopus индуцировала экспрессию chordin и noggin в BCNE (Blastula Chordin-Noggin Expressing) центре, который содержит презумптивную нейроэктодерму, а также Шпемановский организатор (Kuroda et al., 2004). Хотя инволюция мезодермы предупреждается в эксплантах дорсальной части маргинальной зоны, передняя нервная ткань может быть сформирована в
BCNE центре (Kuroda et al., 2004). Эти находки указывают на важную роль презумптивной эктодермы в формировании нейрального паттерна, Более того, engrailed-2 (en2; экспрессируемый на границе между средним и задним мозгом), и xOtx2 (ген головного маркера) всё ещё экспрессируются в эксплантах Keller, подтверждая, что экспрессия некоторых генов нейральных маркеров не зависит от контакта между нейроэктодермальной и мезодермальной тканью (Ruiz i Altaba 1992: Kuroda et al., 2004).
Подобные исследования подтверждают, что формирование нейрального паттерна предопределяется с помощью ещё не установленных механизмов, действующих перед гаструляцией. Мы сконцентрировались на границе между дорсальной и вентральной стороной на ст. 4-х клеток, что приблизительно соответствует эпидермально-нейральной границе на ст. нейрулы. В данном исследовании анализировали различия в экспрессии генов региона анимального полюса бластулы между дорсальной стороной (Dorsal Animal Pole (DAP)) и вентральной (Ventral Animal Pole (VAP)). Используя анализ микромассивов ДНК, мы установили, что более 100 генов экспрессировались более интенсивно в DAP, чем в VAP. Один из них, Xenopus nodal-related gene 3 (Xnr3) , экспрессировался в несколько сот раз выше на дорсальной стороне, чем вентральной стороне (data not shown).
Xnr3 один из 6 генов, родственных nodal, который принадлежит к сверхсемейству transforming growth factor-β (TGF-β) у Xenopus (Smith et al., 1995; Jones et al., 1995; Joseph and Melton, 1997; Takahashi et al., 2000). Однако, Xnr3 отличается от Xnrs в некоторых аспектах. Напр., Xnr3 белок лишен 7-го цистеина, который сильно законсервирован по всему сверхсемейству TGF-β (Ezal et al., 2000). Кроме того, др. Xnrs кооперируются с VegT и Vg1, чтобы индуцировать дорсальную мезодерму, тогда как Xnr3 нет (Jones et al., 1995; Hansen et al., 1997; Agius et al., 2000; Hyde and Old, 2000). Xnr3 экспрессируется также в презумптивной дорсальной эктодерме на ст. бластулы (Smith et al., 1995), тогда как др. Xnrs секретируются в центре Nieuwkoop, расположенном в дорсальном вегетативном регионе (Jones et al., 1995; Joseph and Melton, 1997; Takahashi et al., 2000).
Nodal легенды продуцируются как белки предшественники, которые состоят из pro-region и зрелого региона. Как только белки предшественники образуют связанные дисульфидными мостиками гомодимеры, pro-регион отщепляется от лиганда (Massague 1990; Agius et al., 2000). Nodal pro-белок довольно стабильный, тогда как преобразованный зрелый лиганд с готовностью деградирует после проникновения в клетку (Haramoto et al., 2004). В случае Xnr3, зрелый лиганд не активирует путь Smad, но индуцирует экспрессию Xenopus brachyury (Xbra) посредством mitogen-activated protein (MAP) киназного пути (Yokota et al., 2003). Индукция Xnr3 т.о. вмешивается в гаструляцию и особенно в конвергентное удлинение дорсальной мезодермы (Yokota et al., 2003). С др. стороны, pro-region Xnr3 противодействует передаче сигналов BMP путем соединения с BMPs после расщепления, приводя к индукции нервной ткани (Haramoto et al., 2004).
Здесь мы исследовали роль Xnr3 в формировании нейрального паттерна. С помощью гибридизации
in situ и RT-PCR анализа было установлено, что избыточная экспрессия
Xnr3 индуцирует специфический паттерн экспрессии гена, особенно на границе между нейроэктодермой и эпидермисом. Зрелый регион Xnr3 достаточен для формирования специфического паттерна, но добавление pro-региона усиливает эффект. Клонально-клеточные исследования показали, что инъекция Xnr3 подавляет клеточную миграцию в пограничном регионе между вентральной и дорсальной эктодермой. Нормальные эмбрионы, содержали удлиненные клетки в этом регионе, а направление клеточной элонгации сопровождалось миграцией клеток, тогда как в которые вводили мРНК Xnr3 не обнаруживали элонгации. Эти находки указывают на то, что Xnr3 воздействует на перемещения клеток, которые участвуют в изменении формы клеток в пограничном регионе между вентральной и дорсальной эктодермой и тем самым воздействует на формирование нейрального паттерна.
Discussion
В данном исследовании мы установили, что избыточная экспрессия Xnr3 вызывает эктопические изменения в формировании нейрального паттерна во время эмбриогенеза Xenopus. Этими изменениями были: (1) уменьшение переднего конца нервной пластинки и (2) изгибание паттерна krox20 и передней элонгации нервного гребня. В качестве причины уменьшения переднего конца нервной пластинки предполагается эффект posteriorization. Обработанные RA эмбрионы не обнаруживают действительно экспрессии krox20 (Fig. 1), тогда как у эмбрионов, которым инъецировали Xnr3, экспрессия krox20 всё ещё наблюдалась, хотя пространственный паттерн был изменен, указывая тем самым, что эффект Xnr3 отличен от такового RA-индуцированной posteriorization. Аномальная гаструляция может быть также причинно связана и в самом деле Xnr3 влияет на гаструляционные движения (Herrmann et al., 1990; Schulte-Merker and Smith, 1995; Wilson et al., 1995; Tada and Smith, 2000).
Однако наши результаты обнаружили связь ведущего края дорсальной мезодермы, поступающей на передний конец у Xnr3-инъецированныъх эмбрионов (Fig. 4), т.о., специфический нейральный паттерн, индуцируемый с помощью Xnr3, скорее всего, не зависит от дефектов гаструляции. Как показано на Fig. 5, миграция переднего конца дорсальной эктодермы также нарушена при инъекции Xnr3, и это укорочение может быть связано с дефектами миграции кпереди. Наиболее характерным изменением в формировании нейрального паттерна, индуцированными с помощью Xnr3 является латеральное расширение и переднее изгибание домена экспрессии krox20. Мы полагаем, что такие альтерации отражают изменения в позиционной информации в передней части нейроэктодермы. Однако окрашивание phalloidin показало, что избыточная экспрессия Хnr3 подавляет удлинение клеток вдоль границы (Fig. 4). Более того, эксперименты по отслеживанию клеток подтвердили, что дефект вызывается специфическим ингибированием клеточной миграции на нейро-эпидермальной границе. Поэтому мы предположили, что потеря клеточной полярности д. вызывать дефект миграции пограничных клеток, приводя к искривлению домена экспрессии krox20.
Эпидермальный регион, соседний с нервной пластинкой необходим для удлинения нервной пластинки и закрытия нервной трубки (Jacobson and Moury, 1995). Клетки нейрально-эпидермальной границы также вносят вклад в точное формирование нейрального региона, хотя планарные перемещения на границе не были исследованы в деталях. Наше исследование предоставляет новую модель, согласно которой специфические перемещения пограничных клеток важны для формирования нейрального паттерна. Клеточная адгезия может участвовать в таких изменениях специфических перемещений. В самом деле Xbra ингибирует миграцию клеток путем ослабления адгезии между мезодермальными клетками и фибронектином in vitro (Kwan and Kirschner, 2003). Др. возможность в том, что специфические перемещения клеток на нейрально-эпидермальной границе зависят от ориентации ECM вдоль границы, дальнейшие исследования прояснят участие этих факторов.
Ранее было показано, что инъекции morpholino antisenseoligo против Xnr3 (Xnr3MO) в дорсальную экваториальную область вызывает изгиб и укорочение оси и потерю головных структур (Yokota et al., 2003). Хотя инъекции в анимальную шапочку не вызывали такого эффекта, эти результаты показывают, что Xnr3, по крайней мере, необходим для собственно образования головы. Тем не менее дальнейший анализ Xnr3MO необходим для выяснения эндогенной роли Xnr3 в детерминации нейрально-эпидермальной границы.
Как показано на Fig. 3, зрелый регион Xnr3 затрагивает формирование нейрального паттерна, а pro-регион увеличивает активность зрелого региона. И отщепление pro-региона и димеризация зрелого региона необходимы для сигнальной активности членов семейства TGF-beta (Lopez et al., 1992; Hawley et al., 1995; Osada and Wright 1999). Однако, Xnr3 не образует гомодимеров, а мутантный по расщеплению Xnr3 достоверно увеличивает экспрессию Xbra (Ezal et al., 2000; Haramoto et al., 2007). Более того, исследования на рыбках данио или культивируемых клетках показали, что pro-домен nodal не деградирует вскоре после расщепления, а на самом деле он играет роль в стабилизации зрелого домена. Зрелый регион сам по себе обладает сильной активностью, но он быстро интернализуется и деградирует в таком состоянии без pro-региона (Beck et al., 2002; Le Good et al., 2005). Исходя из этих результатов усовершенствование pro-региона Xnr3 может быть обусловлено стабилизацией зрелого региона. Исходя из этих результатов нашего исследования мы предложили новый механизм образования нейрально-эпидермальной границы за счет специфической миграции клеток.
