Посещений:
РАЗВИТИЕ НЕОКОРТЕКСА

Роль транскрипционных факторов и цис-действующих регуляторных элементов

From trans to cis: transcriptional regulatory networks in neocortical development
Mikihito Shibata, Forrest O. Gulden, and Nenad Sestan 1
Trends in Genetics, February 2015, Vol. 31, No. 2 P. 77

Transcriptional mechanisms mediated by the binding of transcription factors (TFs) to cis-acting regulatory ele- ments (CREs) in DNA play crucial roles in directing gene expression. While TFs have been extensively studied, less effort has gone towards the identification and func- tional characterization of CREs and associated epigenet- ic modulation. However, owing to methodological and analytical advances, more comprehensive studies of regulatory elements and mechanisms are now possible. We summarize recent progress in integrative analyses of these regulatory components in the development of the cerebral neocortex, the part of the brain involved in cognition and complex behavior. These studies are uncovering not only the underlying transcriptional reg- ulatory networks, but also how these networks are altered across species and in neurological and psychiat- ric disorders.



CREs are integral components of transcriptional regulatory networks


Фундаментальный вопрос биологии развития - как множественные структуры, необходимые для функционирования организма возникают в результате общего геномного наследования от единственной зиготы [1]. Трансформация от зиготы ко взрослому организму сложная серия онтогенетических событий, каждое из которых базируется на точной пространственно-временной регуляции экспрессии генов [1-3]. Эти программы, по большей части, обеспечиваются с помощью транс-действующих факторов (т.e. TFs), которые соединяются со специфическими геномными последовательностями [4,5] в CREs. В соответствии с их структурными и функциональными свойствами, TFs могут быть отнесены к большому числу отличающихся семейств [4]. В зависимости от их функции, CREs могут быть также подразделены на разные классы с проксимальными промоторами, энхансерами, инсуляторами и обеспечивающими молчание (silencers), довольно хорошо изученные [6-10]. В то время как др. регуляторные элементы, оперирующие на транскрипционном и пост-транскрипционном уровне также существуют, включая, но не ограничиваясь ремодельеры хроматина, РНК-связывающие белки, регуляторные РНК и цис-регуляторные РНК элементы, сложный набор взаимодействий между TFs и CREs формируют центральный стержень транскрипционных регуляторных сетей (TRNs) (Box 1) [1].
Взаимодействия между TFs и CREs сложные, динамичные и модулируемыми с помощью разных эпигенетических процессов [12]. Поскольку индивидуальные CREs могут регулироваться с помощью конкурентного или кооперативного связывания многих TFs, множественные CREs также могут обеспечивать транскрипционный контроль экспрессии любого одиночного гена [12]. Более того, TFs и CREs регулируют транскрипцию совместно со своими родственными транскрипционными ко-факторами, хроматиновыми регуляторами, эпигенетическими модификациями, РНК-связывающими белками и не кодирующими РНК [2,13]. Эта комбинаторная и многоуровневая транскрипционная регуляция значительно увеличивает сложность регуляции экспрессии генов, облегчая формирование уникальных пространственно-временных паттернов, необходимых для тканевого развития и функционирования [3].
Исследователи давно распознали важность TFs в развитии, эволюции, функции и патогенезе. Хотя вклады CREs также определенно распознаны, наше понимание их ключевой биологической роли и ассоциированных TRNs затруднено благодаря трудностям, связанным с их систематической идентификацией и функциональной охарактеризованостью. К счастью, благодаря многим недавним методологическим и аналитическим успехам, более исчерпывающие и функционально значимые исследования CREs сегодня возможны в разных сложных тканях и физиологических контекстах (Box 2).
Среди наиболее сложных биологических тканей с мириадами клеточных типов и очень защищенным развитием, находится церебральный неокортекс. Неокортекс является частью головного мозга, уникального для млекопитающих, увеличенного у людей и критического для распознавания, восприятия и сложного поведения [14-16]. Развитие неокортекса, а, следовательно, его функция зависят от высоко контролируемой регуляции экспрессии генов. Примеры вклада TFs в развитие неокортекса и в неврологические и психиатрические нарушения, многочисленны [17-20], но как для большинства сложных биологических систем, знания, связанные с CREs и их интеграцией с TFs и др. регуляторными компонентами в TRNs сильно отстают.
Ниже мы суммировали недавние успехи в изучении избранных ключевых TFs, CREs и ассоциированных регуляторных процессов в контроле экспрессии генов, лежащих в основе развития, эволюции и патогенеза неокортекса (Box 3).



Box 1. Core classes of CREs in DNA
CREs in genomic DNA can be divided into functional classes, with promoters, enhancers, insulators, and silencers being the core components that have historically been the most widely studied. Promoters may be proximal promoters, located near the transcription start site and occupied by the primary transcriptional machinery, or distal promoters, bound by TFs but having a weaker regulatory influence. In either case, the promoter serves as a scaffold where general TFs such as TAF1 bind to initiate transcription. Besides RNA polymerase II, active promoters may be associated with histone H3 trimethylated lysine 4 (H3K4me3) or other markers of promoter activity [114].
Enhancers, silencers, and insulators can influence target gene transcription more globally. Enhancers may facilitate gene expres- sion by serving as scaffolds to recruit both TFs and proteins with histone acetyltransferase activity. This allows the decondensation of chromatin, permitting the general transcription machinery greater access to promoters. In contrast to enhancers, silencers and insulators act as negative regulators of gene expression. These regulatory elements may prevent the spread of heterochromatin or prevent the activation of promoters unrelated to nearby enhancers. The effects of these CREs are orientation-independent and may be temporally or tissue-specific.
As with promoters, there are several markers for active enhancers, silencers, and insulators. For example, active enhancers may be associated with histone H3.3 [115], histone H2A.Z [7], histone H3 acetyl Lys27 (H3K27ac) [115], H3K4me1, or other markers. Among the markers for active silencers and insulators are REST [116], SUZ12 [117], and CCCTC-binding factor (CTCF) [118].
Super-enhancers consist of clusters of enhancers spanning up to 50 kb, are densely occupied by master TFs and Mediator complexes, and play crucial roles in defining cell identity in many differentiated cell types including mouse progenitor B cells, T helper cells, and macrophages [112,119]. Super-enhancers may also activate the expression of master TFs and other genes that play important roles in cell type specification, potentially making the expression of genes regulated by super-enhancers sensitive to perturbations impacting upon master TFs or Mediator complex.
Numerous other regulatory components exist. Other cis-elements affecting gene expression, if not always transcription, are 3 0 untranslated regions, splicing regulatory elements, and epigenetic factors including DNA methylation, histone modifications, chromosomal conformation, and chromatin state. Additional trans-regulatory elements include regulatory RNAs (i.e., miRNAs, lincRNAs, and so on), RNA-binding proteins, splicing factors, and chromatin modifiers/remodelers.




Transcriptional regulation of neocortical neurogenesis and gliogenesis


Неокортекс в основном состоит из множества нейрональных и глиальных типов клеток. Нейроны грубо подразделяются на две большие группы - глютаматергические возбуждающие проекционные нейроны (известные также как пирамидальные нейроны) и GABAергические ингибирующие локальные circuit промежуточные нейроны, которые следуют значительно отличающимися программам развития [17-22]. Проекционные нейроны, которые объясняют приблизительно 80% неокортикальных нейронов, происходят из стволовых клеток и клеток предшественников в неокортикальной стенке в дорсальной части переднего мозга (Figure 1), тогда как промежуточные нейроны возникают преимущественно из клеток предшественников в вентральной части переднего мозга и мигрируют тангенциально в кору. Клетки макроглии, классифицируются в основном как астроциты, эпендимные клетки и олигодендроциты, также происходят из тех же самых клонов нейральных предшественников [24].
Обеспечение перехода от пролиферации к дифференцировке стволовых клеток и клеток предшественников в вентрикулярной зоне (VZ) и субвентрикулярной зоне (SVZ) важно для детерминации размера неокортекса и др. аспектов нормального развития [14]. Некоторые TFs участвуют в контроле начала, прогрессии и окончании нейрогенеза неокортекса. Среди них EMX1, EMX2, FOXG1, HES1, HES5, LHX2 и PAX6 экспрессируются на высоком уровне в клетках кортикальных предшественников в ходе нейрогенеза и, как было установлено, играют критические роли, способствуя поддержанию состояния предшественников [25-29]. Др. TFs, такие как FEZF2 (FEZL или ZFP312), ID4, NGN1, NGN2 и NR2E1 (TLX), обогащены в ранних клетках предшественниках [30-32], тогда как TFAP2C (AP2-g), CUX1, CUX2, POU3F3, POU3F2 (BRN1 и BRN2, соотв.), и TBR2 обогащены в поздних клетках предшественниках [31,33-36]. Каждый из этих TFs может способствовать нейрогенезу в некоторых

Box 2. Advances in the study of TFs and CREs Advances in genomics and global scientific infrastructure have facilitated the attainment, preservation, and dispersal of organisms and tissues, including human and non-human primate brains, previously not easily available to the scientific community. This has allowed comparative genomics to flourish, leading to the identifica- tion of potential CREs through the recognition of sequence conserva- tion across species [120,121]. Similarly, improvements in tissue and cell processing methods have allowed the isolation of cells and discrete morphological areas on a level previously impossible [105,122-126]. This has aided the creation of high-quality databases profiling the genome, transcriptome, epigenome, and regulome of multiple neural cell types, tissues, developmental periods, species, and diseases [10,96,97,105,127] (see http://www.genome.gov/encode; www.1000genomes.org; www.roadmapepigenomics.org; www. gtexportal.org; www.brain-map.org; www.genepaint.org; www. enhancer.lbl.gov; www.brainspan.org, and www.commonmind.org). Technological advances have also facilitated the discovery and characterization of CREs. While the increasingly long lists of TFs annotated for their involvement in any given development process have provided progressively more 'bait' for chromatin immunopreci- pitation (ChIP) assays [23,128], the ability to couple ChIP with next- generation sequencing, as in ChIP-seq, has allowed global assessments of CRE activity. The use of ChIP-seq using more general markers not associated with any single CREs, such as EP300 (also known as p300), RNA polymerase II (Pol II), and H3K27ac, has also allowed these global searches for CREs to be performed independently of knowledge of (or antibodies against) TFs [10,12,96,129,130]. Recently developed techni- ques for mapping chromosomal interactions over long distances, such as ChIA-PET (chromatin-interaction analysis with paired-end tag sequencing), couple ChIP-seq with assays that identify both the distal and proximal gene regulatory elements of promoters by tethering conformationally related chromosomal regions [131-133]. Taken to- gether, these advances allow both the identification of hundreds of thousands of CREs and novel opportunities to correlate promoter and enhancer occupancy with gene expression. With the identification of so many regulatory elements has come an increased ability to validate and functionally characterize those elements. The massively parallel reporter assay (MPRA) and other similar approaches allow the rapid validation of hundreds of putative CREs in a single experiment [134]. Once validated, CREs can be functionally characterized through the use of bacterial artificial chromosome (BAC) transgenesis [69], site-directed mutagenesis by CRISPR/Cas technology [135,136], or other techniques drawn from an expanding molecular toolkit.

Box 3. Epochs of neocortical development The vast majority of cells occupying the adult neocortex originate either from radial glia (RG) in the ventricular zone (VZ), intermediate progenitor cells (IPCs) in the subventricular zone (SVZ), or from progenitor pools located within the ganglionic eminences. In these proliferative niches, multiple TFs act to maintain progenitor cells in a proliferative state. Other TFs promote the production of differentiated neurons, glia, and astrocytes. The mechanisms mediating the choices between proliferation and differentiation, and neurogenesis and gliogenesis, are tightly regulated. As nascent neurons exit mitosis, they migrate from these pro- liferative niches to their ultimate destinations. Interneurons arising from the ventrally located ganglionic eminences tend to migrate tangentially along cortical layers. Cells arising in the VZ or SVZ of the dorsal telencephalon migrate radially along a radial glial scaffold and deposit themselves in a time-dependent manner. Preplate neurons, including Cajal-Retzius cells, are born first. These cells secrete reelin, an instructive guidance molecule for the formation of neocortical layers. Newly born neurons migrate radially, first splitting the preplate and forming the cortical plate between the marginal zone and the subplate. Subsequently born neurons migrate into the cortical plate in an inside-out manner as progressively younger neurons migrate past their older siblings. At the end, later-born, superficial-layer neurons reside in L2 to L4, and earlier-born deep-layer neurons in L5-6. A schematic depicting this process can be seen in Figure 1. Cellular diversification and differentiation generates the wide diversity of neuronal types present in the adult neocortex. While strong evidence for the prepatterning of cells within the ventricular zone exists, many of the TFs implicated in the development of specific cell fates only begin to be expressed as cells complete their terminal mitosis. At this time cells may express TFs essential for the attainment of multiple distinct cell fates. However, through a series of feedback mechanisms including mutual cross-repression, cells ultimately settle on a final identity. An example of a transcriptional regulatory network involved in cell type specification is shown in Figure 2. In addition, the assembly and function of neuronal circuits is essential for normal function. As in differentiation, the genetic and molecular components essential for both synaptogenesis and connectivity may be expressed during, or be influenced by, earlier developmental epochs. Other factors, including extracellular stimuli, can influence the expression of TFs, the activity of CREs, and the function of TRNs.


онтогенетических контекстах. Напр., некоторые TFs, такие как INSM1, NGN2, TBR2 и TFAP2C, как было установлено, способствуют генерации базальных предшественников в SVZ из клеток VZ предшественников [33,36-38]. Знание о CREs, участвующих в этих процессах важно для понимания, как эти наборы TFs интегрируются, чтобы способствовать соотв. онтогенетическим путям. К сожалению, известный репертуар CREs

Figure 1. Schematic illustration of the generation, migration and differentiation of neural cells in the neocortex. Neuroepithelial cells (NPCs) undergo symmetric cell division to produce an initial pool of cortical progenitors that later transform into apical radial glia cells (aRGCs). Neocortical aRGCs line the ventricular zone from where they extend a long radial process stretching to the basal surface. aRGCs begin asymmetric cell division to generate another aRGC and a nascent projection neuron. The neuron then migrates radially from the ventricular zone (VZ) along the basal process of a RGC into the cortical plate (CP). The earliest-born neurons migrate to form the preplate. Later-migrating neurons split the preplate into the marginal zone (MZ) and subplate (SP). The MZ also consists of Cajal-Retzius cells originating from multiple sites in the forebrain including the cortical hem. As neurogenesis proceeds, diverse subtypes of neurons are generated through the successive asymmetric division of RGCs. Early-born nascent projection neurons settle in the deep layers (layers 5 and 6; red layers) and later-born projection neurons settle in towards the mid-neurogenesis stage. In addition, some populations of RGC daughter cells become intermediate progenitor cells (IPC) or basal radial glial cells (bRGC) in the subventricular zone (SVZ). After the neurogenic stages, the radial scaffold detaches from the apical surface and aRGCs become gliogenic, generating astrocytes, or transform into ependymal cells. Tangential migration of interneurons is observed in the MZ, intermediate zone (IZ), and SVZ. Neocortical projection neurons mature into cortical projection neurons (CPNs), which show layer- and subtype-specific morphology and axonal projection patterns. Subcerebral projection neurons, which extend axons to the diencephalon, brainstem, and spinal cord, are located in the deep layers. Upper-layer projection neurons project axons within the telencephalon (i.e., cerebrum). Adapted from Kwan et al. [18].

которые активны в разного типа клетках кортикальных предшественников вовремя нейрогенеза в основном неполный, а те что функционально охарактеризованы в этом отношении, редки. Одним из хорошо изученных примеров таких CRE связан с удивительно парадоксальной способностью PAX6 способствовать как экспрессии генов для само-обновляющихся предшественников, так и для их дифференцировки в нейроны. Эти конфликтующие способности уживаются частично благодаря энхансеру низкого сродства E1, из Ngn2 [39]. Когда концентрация PAX6 низкая, то PAX6 неспособен соединяться с E1 и не индуцирует экспрессию пронейрального гена Ngn2. Вместо этого, PAX6 вызывает экспрессию генов, способствующих самообновлению, тогда как др. транскрипционный фактор, HES1, непосредственно репрессирует некоторые гены, способствующие дифференцировке [40]. Однако, когда уровни PAX6 более высокие, то PAX6 способен соединяться с E1 и индуцировать экспрессию NGN2. Др. TFs, включая FEZF1 и FEZF2, индуцируются в дальнейшем и прямо репрессируют Hes1 и родственный Hes5 [41]. Этот сдвиг соотношения между PAX6 и HES1, следовательно, непосредственно связан с нейрогенезом [40].
Др. примеры регуляторных элементов, обеспечивающих нейрогенез, также существуют. BAF (mSWI/SNF) комплекс, ремоделирующий хроматин, участвует в регуляции размера и толщины неокортекса [42] и способности PAX6 соединяться со специфическими CREs и регулировать нижестоящие гены мишени, модулируемые с помощью этого комплекса вовремя нейрогенеза у взрослых [43]. Эти исследования подтвердили, что эпигенетические механизмы, такие как ремоделирование хроматина [11], могут играть критическую роль в регуляции транскрипции вовремя нейрогенеза в ходе развития. Кроме того, специфические не кодирующие РНК, как было установлено, регулируют кортикальный нейрогенез путем целенаправленного воздействия на многие ключевые TFs [44,45], осуществляя механизм регуляторной обратной связи и др. слой комплексности.
TFs и CREs также контролируют переключение с нейрогенеза на глиогенез, который обычно происходит позднее в развитии. Здесь снова ключевые примеры подчеркивают важность эпигенетической регуляции, такой как метилирование ДНК, в контроле транскрипционных регуляторных взаимодействий и транскрипции генов. Во время нейрогенеза неокортекса, промоторы генов, специфичных для астроцитов, таких как glial fibrillary acidic protein (Gfap), подвергаются сильному метилированию и замолкают [46]. Приобретению судьбы астроцитов мешает NGN1, который способствует нейрональной судьбе благодаря конкуренции с STAT3 за EP300-SMAD активаторные комплексы [47]. Однако в конце нейрогенеза промотор Gfap деметилируется, чтобы облегчить как дифференцировку астроцитов, так и трансформацию клеток предшественников радиальной поддержки в предшественники глии, дифференцированные астроциты и эпендимные клетки [46]. Это оказывается возможным, поскольку супрессия экспрессии NGN1, связанная с деметилированием промоторов генов, специфичных для астроцитов, начинается с помощью NFIA [48], позволяя JAK-STAT3 и BMP путям инициировать экспрессию генов, способствующих астроцитам.
Др. большой класс глиальных клеток, олигодендроциты, развиваются из пролиферирующих клеток предшественников олигодендроцитов, которые возникают в пролиферативной зоне множественных регионов вентральной и дорсальной частей переднего мозга, мигрируют по всему развивающемуся белому веществу головного мозга и делятся ограниченное число раз перед терминальной дифференцировкой. Среди TFs, способствующих спецификации и созреванию олигодендроцитов находятся OLIG1, OLIG2, SOX10, YY1, MRF и ZFP219 [49,50]. Интересно, что DLX1 DLX2 TFs необходимы для спецификации судьбы промежуточных нейронов, а OLIG1 и OLIG2 контролируют приобретение нейрональной судьбы в противовес олигодендроглиальной в развивающейся вентральной части переднего мозга [51]. DLX1/2 способствует нейрогенезу за счет клона олигодендроцитов путем репрессии экспрессии Olig2 [51,52]. Напротив, OLIG1 непосредственно соединяется с Dlx1/2 I12b межгенным энхансером, чтобы репрессировать экспрессию Dlx1/2, приводя к приобретению судьбы олигодендроцитов [52].

Transcriptional regulation of neuronal migration


После нейрогенеза зарождающиеся проекции нейронов движутся по направлению дорсальной (pial) поверхности развивающегося головного мозга, чтобы в конечном итоге сформировать 6-слойную архитектуру зрелого неокортекса головного мозга. Несколько TFs, участвующих на каждом из этапов нейронального развития, включая SOX5, NGN2, POU3F3 и POU3F2, участвуют также в радиальной миграции зарождающихся проекций нейронов в дорсальной части телэнцефалона [53-55]. Предположительно эти TFs регулируют экспрессию генов, участвующих в динамике цитоскелета и др. аспектах клеточного движения, но до недавнего времени детали этой регуляции оставались неизвестными. Недавняя работа, связанная с CRE в Rnd2 предоставила информацию об этом процессе.
Rnd2 является геном, кодирующим RhoA-like GTPase, участвующую в регуляции динамики цитоскелета и влияющую на нейрональную миграцию [56]. Экспрессия RND2 регулируется с помощью конкурентного связывания NGN2 и ZBTB18 (ZFP238 или RP58) с CRE в 3' регионе Rnd2. В отсутствие связывания NGN2, фактор RND2 не экспрессируется, а нейроны с прирожденной экспрессией RND2 неспособны мигрировать из SVZ в кортикальную пластинку [57]. В противоположность NGN2, фактор ZBTB18 репрессирует Rnd2 [58]. Нейроны, истощенные по ZBTB18, обнаруживающие усиление активности RND2, также не могут мигрировать из SVZ благодаря неспособности перехода от мультиполярности к двуполярности [59]. Более того, NGN2 активирует транскрипцию Zbtb18 за счет соединения с его промотором [60], тогда как ZBTB18 репрессирует Ngn2 [59,61]. NGN2 и ZBTB18, следовательно, образуют петлю обратной связи, оперирующую посредством общего CRE, чтобы тонко настраивать экспрессию Rnd2, контролируя тем самым радиальную миграцию проекций нейронов.

Transcriptional regulation of neuronal diversification and differentiation


Организация неокортекса на функционально отличающиеся слои и области коренится в диверсификации развивающихся проекций нейронов в самостоятельные подтипы. Ранний пул предшественников дает subplate (SP) и глубокие слои (L5-6) нейронов, тогда как пул поздних предшественников генерирует верхние слои нейронов (L2-4). Дальнейшее возникновение разнообразия на многие подтипы происходит во время ранней постмитотической и постмиграторной жизни проекционных нейронов (Figure 1) [23,54,62-65].
Исследования позиции слоёв и спецификации кортикальных клонов проекционных нейронов иллюстрируют важность пространственного распределения относящихся к делу TFs и способность CREs интегрировать эффекты этих TFs. Эти процессы также модулируются с помощью нескольких др. транскрипционных и пост-транскрипционных регуляторных процессов. Напр., FEZF2, который обогащен в L5 и в меньшей степени в L6 проекционных нейронах, необходим для спецификации subcerebral (corticofugal) проекционных нейронов, включая кортикоспинальный нейроны [66-70]. Действует вместе с FEZF2 в незрелых L5 кортикоспинальных нейронах и члены семейства SOX

Figure 2. Transcriptional regulatory networks controlling the specification and differentiation of cortical projection neurons. (A) Key transcription factors (TFs) involved in neurogenesis and cell type specification. Solid lines indicate direct activation or repression of a downstream target by the upstream TF indicated. Dashed arrows indicate regulation by unknown direct or indirect mechanisms. (B-D) Models for the regulation of the transcription of Fezf2, Bcl11b (also known as Ctip2), and Tbr1 during cell type specification. (B) Regulation of Fezf2 transcription. SOX4 and SOX11 activate Fezf2 transcription while SOX5 suppresses this expression by competing for the E4 enhancer. The physical interaction was tested by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and chromatin immunoprecipitation (ChIP) [69]. TBR1 suppresses Fezf2 expression by binding to another cis-acting regulatory element (CRE). This physical interaction was tested by ChIP [23]. (C) SATB2 represses Bcl11b expression by binding to MAR (matrix attachment regions) sequences (orange boxes) [62]. (D) SATB2 induces the expression of Tbr1 by binding to three MAR sequences [70].

TFs (SOX4, SOX5 b SOX11), также как и BCL11B (CTIP2) (Figure 2) [54, 69, 71, 72]. Сходная ситуация TFs, обнаруживающих слой- и подтип-специфические профили экспрессии, обнаруживается в развивающихся проекционных нейронах в L6 (SOX5, TBR1 и NR2F1), L4 (NR2F1, LHX2, CUX1/2 и BHLHB5), и в L2-4 (CUX1/2, BHLHB5, и SATB2).
Знание транскрипционных взаимодействий, участие CREs м эпигенетического аппарата необходимо для понимания тип-специфической экспрессии этих TFs. SOX5 необходим для миграции и спецификации L5/6 проекционных нейронов, но он также репрессирует Fezf2 в L6 кортикоталамических проекционных нейронах путем прямой репрессии, обеспечиваемой с помощью E4 энхансера вблизи Fezf2 [54,71] (Figure 3A-C). Напротив, SOX4 и SOX11 конкурируют с SOX5 за активацию энхансера E4 [69] (Figure 2A, B). Локус Fezf2 также связывает TBR1, это ещё больше способствует репрессии Fezf2 в L6 нейронах [23,73] (Figure 2B). В свою очередь, FEZF2, среди прочих TFs, включая BCL11B, прямо или косвенно репрессирует экспрессию Tbr1 (Figure 2A). SATB2, связывающий ДНК белок, экспрессируется незрелыми нейронами в нескольких кортикальных слоях, чья экспрессия опосредованно регулируется с помощью FEZF2, при этом оба активируют экспрессию TBR1 и супрессируют экспрессию BCL11B (Figure 2A, C, D) [70,74].
Проблема наследования 'закрытой' TRN описана выше, однако она может быть нарушена несколькими способами, что делает возможной продукцию множественных подтипов нейронов глубоких и поверхностных слоёв. Это, по крайней мере, частично обеспечивается с помощью TF FOXG1. FOXG1 экспрессируется в неокортикальных предшественниках и нейронах поверхностных слоёв и прямо супрессирует экспрессию TBR1 путем связывания 5' региона локуса Tbr1. Это ведет к активации генов глубоких слоёв, включая Fezf2 и Bcl11b. Нейроны глубоких слоёв затем сами продуцируют клеточный внешний сигнал, который будучи связан с репрессией Tbr1 с помощью FOXG1, делает предшественников компетентными дифференцироваться в нейроны верхних слоёв [75].
Специфичная для типов клеток, и поддерживаемая экспрессия TFs необходима для спецификации, развития и позднейшего поддержания типов нейрональных клеток, поддерживается, по крайней мере, частично с помощью эпигенетических способов [76]. Это также верно для кортикальных проекционных нейронов. Напр., BCL11B, который экспрессируется проекциями subcerebral нейронов в L5/6, недавно идентифицирован как субъединица BAF хроматин-ремоделирующих комплексов [77]. Как таковой он, скорее всего, кооперирует с др. TFs, чтобы находить различающиеся хроматиновые локусы, содержащие CREs, используемые для специфичной для типов клеток активации или репрессии экспрессии генов. Разные примеры используют взаимодействие AF9 с DOT1L гистоновой H3 метилтрансферазой, белком, которые обеспечивает метилирование гистона H3 по лизину 79 (H3K79) в сайте старта транскрипции Tbr1 [78]. Эта эпигенетическая модификация супрессирует экспрессию Tbr1 в нейронах верхних слоёв и способствует поддержанию судьбы внутримозговых проекционных нейронов в этих слоях. Сходным образом, SATB2 сам является модификатором хроматина и соединяется непосредственно с регионами прикрепления матрикса. Это позволяет SATB2 рекрутировать гистоновые деацетилазы и замалчивать экспрессию локусов, включая Bcl11b [62,63,79].
OLIG1/2, рассмотренные ранее как TFs, необходимые для глиогенеза, также играют критическую роль в дифференцировке олигодендроцитов. Напр., OLIG2 транскрипционно формирует препаттерны хроматин-ремоделирующего фактора SMARCA4 (BRG1) [80]. Др. исследования также связали метилирование ДНК и модификации хроматина с глиальной дифференцировкой и её поддержанием [81].

Figure 3. The identification and characterization of the E4 enhancer of Fezf2. In this example of cis-regulatory element (CRE) discovery and functional characterization, transcriptome analysis and comparative genetics were coupled with bacterial artificial chromosome (BAC) transgenesis to identify and characterize an enhancer of the Fezf2 gene. (A) Fezf2 is a transcription factor (TF) identified in a genome-wide search for genes enriched among corticospinal motor neurons and their predecessors as compared to other cortical projection neurons. Within the Fezf2 locus are four conserved non-exonic regions, labeled E1, E2, E3, and E4, with high levels of homology across species. The Fezf2 coding region is also indicated. (B) Schematic of a BAC reporter where a reporter gene, Gfp, is driven by the native regulatory environment governing Fezf2. (C) GFP expression, driven by the unmanipulated Fezf2-Gfp BAC, is present throughout the dorsal telencephalon and the corticospinal tract (arrow). This is also true when the putative enhancers E1, E2, and E3 are deleted (D). However, deletion of the E4 enhancer (right panel) results in a loss of GFP expression from the dorsal telencephalon and the apparent absence of the corticospinal tract. (D) Sequence-level homology of the E4 enhancer of Fezf2 in several species. Putative binding sites for SOX proteins are shaded. Note the generally high levels of homology except for the lack of homology in zebrafish at the second shaded SOX binding site. (E) SOX11 stimulates expression of a construct containing the E4 enhancer of Fezf2. The construct containing the zebrafish E4 sequence, which lacks the second consensus SOX binding site, is not induced by SOX11. (F) The putative SOX binding sites were mutagenized in mouse and zebrafish, effectively swapping mouse sequence into zebrafish and vice versa. (G) Swapping the sequences of the second SOX binding site between zebrafish and mouse reduces the ability of SOX11 to induce transcription from mouse E4 while increasing the ability of SOX11 to induce transcription from zebrafish E4. No change is observed when the sequences of the first and third putative SOX binding sites are swapped. Abbreviations: CNS, central nervous system; Hyp; hypothalamus; Ncx, neocortex; OB, olfactory bulb.

Промежуточные нейроны подразделяются на несколько типов в зависимости от их происхождения и молекулярных маркёров. Parvalbumin (PVALB)- и somatostatin (SOM)-позитивные интернейроны преимущественно генерируются из MGE, а calretinin (CALB2 или CR) -позитивные интернейроны возникают из caudal ganglionic eminence (CGE). Несколько TFs участвуют в контроле спецификации и дифференцировки этих промежуточных нейронов, включая NKX2.1 (TTF1), ASCL1 (MASH1), LHX6, SOX6, NR2F1 и NR2F2 (COUP-TF1 и COUP-TF2, соотв.), также, как и члены семейства DLX [21,82,83].
Тогда как NKX2.1, LHX6, SOX6, NR2F1 и NR2F2 выполняют разные роли в спецификации разных подтипов интренейронов, DLX1/2/5/6 и ASCL1 важны для широкой спецификации и дифференцировки интернейронов. Напр., три CREs из Dlx1, называемые URE2, I12b и 156i, ассоциированы с разными подтипами интернейронов [84]. URE2 активен в PVALB/CALB2/NPY/NOS1-позитивных интернейронах, тогда как I12b и I56i специфически активны в SOM/VIP/CALB2-позитивных интернейронах. Это подтверждает, что разные комбинации Dlx1 энхансеров используются для спецификации интернейронов. Итак, эти примеры демонстрируют, что комбинация TFs, CREs, эпигенетических модификаций и внешних сигналов действует, чтобы сначала специфицировать, а затем поддержать разные типы нервных клеток.

Transcriptional regulation of the assembly and function of neural circuits


Онтогенетически регулируемые изменения в TRNs продолжаются дальше после нейрогенеза, хотя затухают и продолжают детерминировать разные клеточные судьбы. Сенсорная вызываемая экспериментами синаптическая активность во время постнатального развития инициирует различные транскрипционные регуляторные программы, делая возможными клеточные функции и процессы, такие как синаптогенез, приспособить к окружающим условиям [85,86]. Напр., BDNF член семейства нейротрофинов участвует в выживании, дифференцировке нейронов, росте нейритов и синаптической пластичности. Некоторые из CREs из гена Bdnf связываются и активируются с помощью CREB, ARNT2, NPAS4, CARF и USF1, белков, чья способность индуцировать экспрессию генов регулируется активностью мембраны [87].
Зависимая от активности регуляция не является уникально для гена BDNF. CREB-binding protein (CREBBP или CBP) является ДНК-связывающим транскрипционным ко-активатором, ассоциированным с активностью энхансера, что делает возможным достижение общим аппаратом транскрипции промоторов, облегчая тем самым экспрессию генов. После деполяризации мембраны, ряд сайтов связывания CBP в геноме возрастает приблизительно в 1000 - 28 000 раз [88]. Это включает, как оценено по присутствию энхансерного маркера, монометилирование гистона H3 по лизину 4 (H3K4me1), приблизительно 12 000 регулирующих активность энхансеров. Многие из этих энхансеров связаны с помощью FOS [85]. Наблюдается и существенное повышение связывания CREB, NPAS4 и SRF как с энхансерами, так и промоторами. Активность множественных TRNs из потенциально тысяч генов может, следовательно, регулироваться с помощью синаптической активности и с помощью параллельного подключения, клеточного окружения и опыта. Кроме того, здесь снова знание CREs и участвующих регуляторных механизмов, необходимо для понимания паттернов генной экспрессии.

Evolution of neocortical CREs


Хотя неокортекс присутствует у всех млекопитающих, имеются существенные вариации в его развитии и организации, которые могут лежать в основе видо-специфических аспектов познания и поведения. Изменения в кодирующих последовательностях без сомнения вносят вклад в фенотипы, уникальные для любого данного вида [89-91], но существенная пропорция их уникальности может быть обусловлена изменениями в TRNs, включая CREs и др. регуляторные компоненты [92-94]. Более того, изменения в последовательности и активности CRE оказались связанными с эволюцией у млекопитающих [69,92,93,95]. Напр., только 58% локусов, занятых белками, ассоциированных с энхансером EP300 в неокортексе человека в средине плодного периода было одновременно обогащено при ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation combined with deep sequencing) сайтами ортологами в геноме мыши [96].
Поскольку функциональные последствия таких изменений в активности CRE в основном неизвестны, то эти данные подтверждают массивные изменения в регуляторной архитектуре, управляющей появлением и развитием неокортекса. Влияние CREs на эту регуляторную архитектуру и структуру неокортекса само по себе было подкреплено находками, показавшими, что главные региональные домены переднего мозга могут быть далее подразделены на несколько субдоменов, ограниченных активностью энхансеров [96,97]. Эти результаты также подтвердили, как активность относительно небольшого числа TFs с широкими градиентами экспрессии, может быть интегрирована, чтобы продуцировать сравнительно тонкие отличия внутри ткани. CREs являются поэтому потенциально мощными субстратами для эволюции, чтобы участвовать в создании новых субдоменов и типов клеток в телэнцефалоне и др. частях.
Конкретные примеры критической новой информации в функциональное значение видовых различий в последовательности и активности CREs на развитие и эволюцию неокортекса начали обнаруживаться. Так, приобретение млекопитающими (и возможно птицами) (Figure 3D-G) E4 энхансерной последовательности для Fezf2 возможно оказало влияние на появление системы кортикоспинальных проекций, предоставив тем самым высококвалифицированный моторный контроль, типичных для этих видов [69]. Такие примеры не ограничиваются сайтами связывания TF, поскольку изменения последовательностей ДНК в др. регуляторных сайтах, связываемых с помощью РНК-связывающих белков в транскриптах, экспрессирующихся в неокортексе, также подвергаются эволюционным изменениям. Один пример этого у человека связан с NOS1 мРНК и FMRP [98].

Neocortical CREs in neurological and psychiatric disorders


Альтерации в TRNs оказываются связанными со многими нарушениями, включая неврологические и психиатрические нарушения. Такие альтерации могут возникать из транс-регуляторных изменений, которые модифицируют экспрессию или функцию TFs, или из цис-регуляторных изменений, которые затрагивают связывание TFs, РНК-связывающие белки и не кодирующие РНК. Напр., многие варианты числа копий или мутации в TFs ранее были установлены, как влияющие на развитие неокортикальных связей (circuitry), включая ARX2, FEZF2, TBR1, SATB2 и SOX5 [65,99-104], они оказались сцеплены в нейрологическими и психиатрическими болезными. Растет количество исследований, в частности исследований геномных ассоциаций, которые также идентифицировали генетические полиморфизмы или экспрессию локусов количественных признаков (eQTL) в предполагаемых CREs и регуляторных не кодирующих РНК. Они могут вызывать вариации в уровнях генной экспрессии между типами нервных клеток, регионами головного мозга, временными точками или индивидами [105-107]. Др. ассоциированные с болезнями головного мозга полиморфизмы одиночных нуклеотидов (SNPs) возникают в не кодирующих регионах, которые перекрываются с предполагаемыми CREs [12,108-111]. Некоторые из них, такие как SNPs, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, были описаны как увеличение супер-энхансеров, которые влияли на становление и поддержание качественных особенностей типов клеток, по сравнению с более типичными энхансерами [112]. Однако соотв. функциональные вклады этих цис- и транс-регуляторных изменений, также, как и огромного большинства eQTLs, в молекулярные и клеточные процессы остаются в основном не исследованными.
Важно, что CREs позволяют получать данные из исследований по эволюции и нарушениям головного мозга, чтобы их синхронизировать. Сравнение распределения H3K4me3, специфической для промотора гистоновой модификации, ассоциированной с активной транскрипцией, в префронтальной коре головного мозга человека, шимпанзе и макак выявило 410 регионов, обогащенных H3K4me3, которые были уникальны, и в 61 регионе, которые были уникально утеряны у человека [113]. Среди генов, потенциально затронутых, оказались DPP10, CNTN4, CHL и др. гены, ранее связанные с нарушениями головного мозга. Анализ TRNs, использующих эти гены может предоставить информацию о том, как головной мозг человека стал чрезвычайно и возможно уникально чувствительным к определенным неврологическим и психиатрическим нарушениям по сравнению не с человекообразными приматами.

Future directions


Our focus here on TFs and the CREs that mediate, either directly or indirectly through changes in chromatin struc- ture and epigenetic modifications, the binding of TFs has led us to generally exclude from discussion many other regulatory modalities, including regulatory RNAs and chromatin remodelers, that are utilized by TRNs. Further- more, we have limited the scope to examples where molec- ular interactions between TFs and CREs were well- defined, and therefore many studies that have assessed CREs on a global scale, including eQTL, have been omitted. Despite these omissions, recent advances make clear that CREs do not function merely as passive conduits carrying developmental cues linearly from TFs. Instead, they inte- grate diverse sets of developmental programs promoted by the cellular environment, external stimuli, and TFs them- selves. This is seen in the ability of CREs to mediate competition or synergism between multiple TFs [54,69,71,96], and in the ability of CREs to make large swaths of the genome accessible – as in the new availability of the thousands of CBP binding sites present following membrane depolarization [85,88]. Such integration and regulation is bidirectional: super-enhancers may recruit some master TFs and regulate the expression of others, while at the same time DNA-binding proteins modify CREs to regulate the activity of super-enhancers [112]. As the necessity for incorporating CREs into TRNs is becoming all the more clear, so too is the need for the systematic discovery and characterization of CREs active in different neural cells, regions, timepoints, spe- cies, individuals, and disease states. Combining these data with transcriptomic and other datasets, including interactomes and epigenomes, will further aid not only the identification of target genes but also the develop- ment of new insights into how changes in TRNs contrib- ute to changes in gene expression patterns. Importantly, developing in parallel with new techniques for the identification of putative CREs are new methods for the large-scale validation of these CREs. The reconstruc- tion of TRNs, in particular through the rapid introduction or manipulation of CREs in the mouse genome by CRISPR/Cas editing, further allows functional assess- ments of CREs and their roles in TRNs. Taken together, these advances will allow scientists to characterize TRNs in neocortical development, evolution, function, and dys- function as never before.