В данной работе мы предоставили впервые in vivo функциональные характеристики Emilin3, раскрывая структурную и функциональную роль для развития хорды у рыбок данио. Электронная микроскопия показала, что Emilin3 необходим для собственно структурной организации базальной мембраны вокруг хорды. В отсутствие Emilin3, оболочка недостаточно резистентна, чтобы противостоять давлению, создаваемому вакуолизацией клеток хорды, и этот дефект позволяет объяснить наблюдаемые искажения хорды у морфантов Emilin3.

Интересно, что фенотипические отклонения хорды у двойных Emilin3 эмбрионов морфантов сходны с теми, что описаны для др. компонентов ECM. В частности, ультраструктурные альтерации мы нашли в медиальном слое оболочки хорды, напоминающие те, что описаны для мутантов gulliver рыбок данио, которые несли миссенс мутацию в глобулярном домене C1q гена col8a1 (Gansner and Gitlin, 2008). Интересно, что в отличие от др. EMILIN белков, этот домен отсутствует в Emilin3. Было показано, что глобулярный домен C1q участвует в супрамолекулярной организации EMILINs за счет взаимодействия с доменом EMI (Doliana et al., 2000), тем самым подтверждается возможность, что Emilin3 и коллаген VIII являются взаимодействующими партнерами в медиальном слое оболочки хорды.

Наши данные также подтвердили предыдущие находки, показывающие, что дефекты в оболочке хорды могут влиять на паттерн экспрессии генов клетками хорды. Однако в дополнение к тому, что наблюдалось на др. моделях нарушений хорды (Parsons et al., 2002; Pagnon-Minot et al., 2008; Yamamoto et al., 2010), мы установили, что col2a1 и Hh лиганды не регулируются совместно. В самом деле, у двойных морфантов Emilin3 экспрессия col2a1 усиливается по всей хорде, тогда как shh и ehh избыточно экспрессируются только в области экспрессии emilin3a и emilin3b, на уровне хордонейрального шарнира. Напротив, мутанты по laminin и морфанты по collagen XV обнаруживают сходное усиление активности col2a1 и ehh по всей хорде (Parsons et al., 2002; Pagnon-Minot et al., 2008). Это указывает на то. что клетки хорды могут реагировать на внеклеточные сигналы регион-специфическим образом.

Вторая функция, которую мы здесь описали для Emilin3, связана с регуляцией происходящих из хорды сигналов Hh. Мы показали, что Emilin3 взаимодействует с Scube2 во внеклеточной среде. Недавно, Scube2 был идентифицирован как секретируемый, разрешающий фактор, действующий клеточно неавтономно при высвобождении lipidated Shh из продуцирующих клеток (Creanga et al., 2012;Tukachinsky et al., 2012). Scube2 является многодоменовым белком с сигнальной пептидной последовательностью на N-терминальном конце, сопровождаемой девятью EGF повторами, одним спейсерным регионом, тремя богатыми цистеином мотивами и одним CUB доменом на C-терминальном конце. Домен CUB, как было установлено, взаимодействует с Shh и его присутствие необходимо для активности Scube2 по высвобождению Shh (Creanga et al., 2012; Tukachinsky et al., 2012). Наша находка, что Emilin3 способен взаимодействовать с EGF повторами на Scube2, подтверждает гипотезу, что этот регион белка может быть важным для доставки Scube2 в ECM и для тонкой настройки его локализации и активности во внеклеточном окружении. Поэтому мы предположили, что дефицит Emilin3 нарушает образование оболочки хорды и вызывает аномальную локализацию и/или активность Scube2 во внеклеточной среде, приводя тем самым к усилению передачи сигналов Hh (Fig. 5). Можно предположить, что Emilin3, подобно Emilin1, ассоциирует с фибриллиновыми микрофибриллами в ECM, и поэтому взаимодействие Scube2/Emilin3 представлять собой новый механизм, с помощью которого микрофибриллы контролируют тканевой гомеостаз. В целом наши данные показывают, что ECM обеспечивает новый уровень регуляции передачи сигналов Hh посредством Scube2, и мы полагаем, что взаимодействие Emilin3 и Scube2 в оболочке хорды является критическим для собственно паттерн-формирующей активности хорды.

Fig. 5. Hypothetical model of Emilin3 and Scube2 interaction in the notochord sheath. Emilin3 is located in the extracellular matrix of the notochord sheath and interacts with Scube2, a secreted factor that mediates the release of lipid-modified Hh ligand. In wild-type embryos, Emilin3 ensures the integrity and function of the notochord sheath, which is necessary for proper notochord patterning activity. Emilin3 deficiency results in the disruption of the notochord sheath and affects Scube2 localization and activity in the extracellular milieu, thus leading to increased Hh signals.