WMZ: Z191701361450 WMR: R209318204033 |
β-catenin regulates Pax3 and Cdx2 for caudal neural tube closure and elongation | |
Non-canonical Wnt/planar cell polarity (PCP) signaling plays a primary role in the convergent extension that drives neural tube closure and body axis elongation. PCP signaling gene mutations cause severe neural tube defects (NTDs). However, the role of canonical Wnt/?-catenin signaling in neural tube closure and NTDs remains poorly understood. This study shows that conditional gene targeting of ?-catenin in the dorsal neural folds of mouse embryos represses the expression of the homeobox-containing genes Pax3 and Cdx2 at the dorsal posterior neuropore (PNP), and subsequently diminishes the expression of the Wnt/?-catenin signaling target genes T, Tbx6 and Fgf8 at the tail bud, leading to spina bifida aperta, caudal axis bending and tail truncation. We demonstrate that Pax3 and Cdx2 are novel downstream targets of Wnt/?-catenin signaling. Transgenic activation of Pax3 cDNA can rescue the closure defect in the ?-catenin mutants, suggesting that Pax3 is a key downstream effector of ?-catenin signaling in the PNP closure process. Cdx2 is known to be crucial in posterior axis elongation and in neural tube closure. We found that Cdx2 expression is also repressed in the dorsal PNPs of Pax3-null embryos. However, the ectopically activated Pax3 in the ?-catenin mutants cannot restore Cdx2 mRNA in the dorsal PNP, suggesting that the presence of both ?-catenin and Pax3 is required for regional Cdx2 expression. Thus, ?-catenin signaling is required for caudal neural tube closure and elongation, acting through the transcriptional regulation of key target genes in the PNP Рисунки к статье |
Нервная трубка млекопитающих обнаруживает первое смыкание в области будущего заднего мозга и границе шеи, последующее смыкание происходит в нескольких отличающихся регионах головного мозга и финальное закрытие происходит в регионе заднего нейропора (PNP) (Bassuk and Kibar, 2009; Copp and Greene, 2010). Неспособность к смыканию в этих анатомически определенных зонах может приводить к спектру neural tube defects (NTDs). Причины и предотвращение NTDs остаются плохо изученными (Copp et al., 2013;Wallingford et al., 2013). NTDs являются широко распространенными врожденными дефектами с риском наследуемости, но только небольшое количество генных мутаций сцеплено с NTDs человека (De Marco et al., 2011; Kibar et al., 2007). При изучении же мутантных мышей более 200 генов удалось связать в NTDs (Harris and Juriloff, 2007; Harris and Juriloff, 2010), это отражает сложные генетические основы закрытия нервной трубки.
Независимый от β-catenin неканонический путь передачи сигналов Wnt/planar cell polarity (PCP) регулирует динамику цитоскелета, и существует стержневая сигнальная программа для ориентации тканевых перемещений, таких как конвергентное вытягивание (convergent extension), которое является потенциальной движущей силой, управляющей закрытием нервной трубки и удлинением оси тела (Copp et al., 2003; Wallingford, 2006; Ybot-Gonzalez et al., 2007). Craniorachischisis, тяжелый тип NTD, ассоциированный с дефектами конвергентного вытягивания, наблюдается у мутантных мышей по семействам PCP сигнальных генов Celsr, Dvl, Fzd и Vangl подтверждая, что мутации этих генов могут также вызывать NTDs у людей (De Marco et al., 2011; Juriloff and Harris, 2012). Однако некоторые из этих PCP сигнальных молекул, такие как Fzds и Dvls, также являются важными компонентами канонического пути передачи сигналов Wnt/β-catenin (MacDonald et al., 2009). Кроме того, Lrp6 является ключевым корепрессором в каноническом пути Wnt и необходим для широкого круга органогенетических событий, включая закрытие нервной трубки у мышей (Carter et al., 2005; Kokubu et al., 2004; Mao et al., 2001; Pinson et al., 2000; Song et al., 2009; Song et al., 2010; Tamai et al., 2000; Wehrli et al., 2000; Zhou et al., 2008; Zhou et al., 2004; Zhou et al., 2010). Однако, Lrp6 участвует также в конвергентном вытягивании во время гаструляции Xenopus (Tahinci et al., 2007) и может обеспечивать неканоническую передачу сигналов Wnt signaling для закрытия нервной трубки (Gray et al., 2013). Т.о., роль канонической передачи сигналов Wnt и особенно β-catenin в закрытии нервной трубки и возникновении NTDs остается неизвестной.
Канонический Wnt/β-catenin путь играет жизненно важную роль в развитии и в болезнях (Clevers and Nusse, 2012). Когда Wnt белки соединяются с Fzd и Lrp рецепторами, то функция деградации Axin1-APC-Gsk3 комплекса репрессируется, приводя к повышенным уровням свободного β-catenin (Li et al., 2012). Накопленный цитоплазматический β-catenin транслоцируется в ядро, где он соединяется с транскрипционным комплексом Tcf/Lef, чтобы регулировать активность промотора нижестоящих генов мишеней для осуществления различных биологических функций (Cadigan, 2012). Мы полагаем, что каноническая передача сигналов canonical Wnt/β-catenin необходима для закрытия нервной трубки посредством регуляции транскрипции критических нижестоящих генов мишеней. Нулевые по β-catenin эмбрионы мыши прекращают развитие во время гаструляции (Haegel et al., 1995; Huelsken et al., 2000). Анализ условных β-catenin нарушений осуществлялся при различных онтогенетических процессах, хотя не целенаправленно в отношении закрытия нервной трубки (Grigoryan et al., 2008). В данной работе внимание направлено на сигнальную функциюf β-catenin и получено доказательство, что β-catenin необходим для активации транскрипции paired-box гена Pax3 и caudal-type гомеобоксного гена Cdx2, которые являются критическими эффекторами для закрытия каудальной части нервной трубки и/или процесса элонгации (Epstein et al., 1991; Savory et al., 2011; Young et al., 2009). Далее мы продемонстрировали, что эктопическая активация трансгена Pax3 может устранять spina bifida у β-catenin мутантных мышей и что Pax3 необходим, но не достаточен для активации Cdx2 в дорсальной части PNP. Эти результаты выявляют новый каскад передачи сигналов β-catenin/Pax3/Cdx2, который необходим для закрытия PNP и/или процесса элонгации во время нейруляции. DISCUSSION Pax3 обеспечивает передачу сигналов β-catenin для закрытия каудальной части нервной трубки Данное исследование выявило новую функцию β-catenin в нейруляции. Вызываемое условиями устранение β-catenin в дорсальной части нервной трубки или нервных складок, экспрессирующих Pax3, вызывает дефекты закрытия и удлинения PNP и приводит к spina bifida и укорочению хвоста. Эти дефекты связаны с уменьшение экспрессии генов Pax3 и Cdx в дорсальной части dorsal PNPs у β-catenin нокаутных эмбрионов. Pax3 экспрессируется в клетках дорсальной части нейроэпителия вдоль всей передне-задней оси во время процесса закрытия (Goulding et al., 1991; Solloway and Robertson, 1999). Недавнее исследование подтвердило связь мутаций PAX3 со spina bifida у людей (Agopian et al., 2013), это не было обнаружено в более ранних исследованиях (Greene et al., 2009; Lu et al., 2007). Pax3 гомозиготные мутантные эмбрионы мыши обнаруживают как spina bifida, так и экзэнцефалию (Engleka et al., 2005; Epstein et al., 1991), тогда как позднее этого не обнаруживали у β-catenin условно нокаутных мутантов. Это различие может быть связано с двумя используемыми различающимися генетическими подходами у мышей или с регион-специфческими механизмами. В эксперименте с генным таргетингом, осуществленном в данном исследовании, Pax3 экспрессируется при закрытии нервной трубки у мутантов до устранения β-catenin с помощью Pax3Cre/+. Хотя мы наблюдали драматическое снижение, но не полное отсутствие мРНК Pax3 в дорсальной части PNPs у β-catenin нокаутов на ст. E9.5. Оставшийся Pax3 (экспрессируемый до устранения β-catenin) у мутантов недостаточен для закрытия PNP, но может быть достаточен для закрытия краниальной части нервной трубки. Отметим, что когда белок Pax3 заметно снижен у гетерозиготных Pax3Cre/+ эмбрионов (Engleka et al., 2005), то одиночные Pax3Cre/+ или двойные β-cateninflox/+; Pax3Cre/+ гетерозиготы не имеют NTDs, жизнеспособны и плодовиты. Более того, одиночная копия Pax3 кДНК трансгена, индуцированная тем же самым Cre способна устранять spina bifida у β-cateninflox/flox;Pax3Cre/+ мутантов. Эти результаты демонстрируют, что Pax3 является ключевым медиатором передачи сигналов β-catenin в процессе закрытия PNP.
Клеточный и молекулярный механизмы функции Pax3 при закрытии нервной трубки остаются в основном неизвестными. Повышение апоптоза обнаруживается в дефектной нервной трубке Pax3-дефицитных Splotch мышей (Phelan et al., 1997). Ингибирование p53-зависимого апоптоза может снизить величину проявления NTD у таких мутантов (Pani et al., 2002), указывая тем самым на анти-апоптическую роль Pax3 во время закрытия нервной трубки. С др. стороны, появляется апоптоз во время нормальной нейруляции и во многих др. процессах эмбриогенеза. Ингибирование активности caspase у эмбрионов кур может предупредить закрытие нервной трубки (Weil et al., 1997). Напротив, генетическое и химическое подавление пути caspase у эмбрионов мыши демонстрирует, что апоптоз не нужен для процесса закрытия нервной трубки (Massa et al., 2009). Мы не выявили каких-либо очевидных изменений в апоптозе в связи с уменьшением экспрессии Pax3 в мутантном PNPs. Однако будущие исследования могут выявить, может ли ингибирование апоптоза предупредить NTDs у β-catenin cKO эмбрионов. Изучение химерных мышей показало, что Pax3 действует клеточно автономно в нервной трубке и может влиять на свойства клеточной поверхности (которые пока не определены) (Mansouri et al., 2001). Исследование in vitro показало, что Pax3 может вызывать агрегацию клеток и регулировать фенотипические мезенхимно-эпителиальные взаимные превращения (Wiggan et al., 2002). Pax3 экспрессируется также во вторичной нервной трубке (Shum et al., 2010), которая образуется при вторичной нейруляции в каудальной части оси на ст. E10.5 (примерно ст. 31 сомита) у мышей или на соотв. ст. у эмбрионов кур, непосредственно после завершения закрытия первичной нервной трубки (Cambray and Wilson, 2002; Gofflot et al., 1997; Shum and Copp, 1996). Неясно, необходима ли передача сигналов β-catenin/Pax3 для вторичной нейруляции и как она может вносить вклад в spina bifida у β-catenin cKO или родственных мутантов. Клеточные действия и подлежащие молекулярные механизмы передачи сигналов β-catenin/Pax3 при закрытии нервной трубки нуждаются в дальнейшем исследовании. Co-regulation of Cdx2 by β-catenin and Pax3 during neurulation Исследование показало, что экспрессия Cdx2 снижается в дорсальной части PNPs уβ-catenin cKOs или Pax3-нулевых эмбрионов. Существенно, что эктопическая активация трансгена Pax3 может устранять NTDs, но не укорочение хвоста у β-catenin cKOs без восстановления Cdx2 в дорсальной части PNPs. "b результаты подтверждают, что Cdx2 может быть активирован в присутствии как β-catenin, так и Pax3 в месте закрытия дорсальной части PNP, и что Cdx2 может играть менее доминирующую роль в закрытии PNP. В соответствии с этим, Cdx2+/-;Cdx4-/- мыши обладают укороченным осевым скелетом, но без spina bifida (Young et al., 2009). Среди Cdx генов, только Cdx1 и Cdx4 известны в качестве мишеней для передачи сигналов Wnt/β-catenin (Bеland et al., 2004; Lickert et al., 2000; Pilon et al., 2006). Однако, Cdx1-нулевые и Cdx4-нулевые мыши жизнеспособны и плодовиты (Subramanian et al., 1995; van Nes et al., 2006). Интересно, что Cdx2-нулевые мыши погибают на ст. E3.5 (Chawengsaksophak et al., 1997), тогда как компаундные Cdx2;Cdx1 мутанты имеют тяжелый NTD craniorachischisis со снижением экспрессии Ptk7 (Savory et al., 2011). Эти результаты подтверждают, что Cdx2 выполняет функции, отличающиеся от тех, что выполняют др. Cdx гены м является критическим для инициации закрытия нервной трубки и также для элонгации PNP. Наши результаты показывают, что экспрессия Cdx2 регулируется с помощью β-catenin и возможно также с помощью Pax3 во время развития PNP. Недавнее исследование сообщило, что экспрессия Pax3 может регулироваться с помощью Cdx и Wnt во время развития нервной трубки (Sanchez-Ferras et al., 2012). Эти противоположные наблюдения подтверждают, что Pax3 и Cdx2 могут регулироваться сочетано, каждый др. др. под транскрипционным контролем β-catenin для закрытия PNP и процесса элонгации (Fig. 8E). Будущие исследования смогут определить, может ли активация Cdx2 устранять spina bifida у Pax3 или β-catenin мутантов. Наши результаты также демонстрируют дорсальный изгиб и укорочение PNP или задней части оси у β-catenin мутантов на ст. E10.5, это может быть обусловлено дефектами Pax3 и Cdx в дорсальной части PNP, при относительно консервативной передаче сигналов генной экспрессии в вентральной части оси и хвостовой почке на ст. E9.5. Однако остается неясным, происходит ли и как интеграция передачи сигналов β-catenin/Pax3/Cdx при закрытии дорсальной части PNP и процессе элонгации. Мы также наблюдали, что передача сигналов в хвостовой почке сравнительно не затронута на ст. E9.5, но снижается на ст. E10.5 у мутантных β-catenin эмбрионов, что позднее приводит к нарушению задней части оси. Cell adhesion function of β-catenin in neurulation β-catenin играет двойную роль в передаче сигналов Wnt и клеточной адгезии (Valenta et al., 2012), и как недавно было продемонстрировано важен для клеточной интеграции в каудальной оси тела. Условное устранение β-catenin с Cdx1-Cre во всех трех зародышевых слоях в задней части эмбриона приводит к прогрессивной дезинтеграции и потере задних структур перед закрытием каудальной части нервной трубки (Hierholzer and Kemler, 2010). Задняя дезинтеграция у этих мутантных эмбрионов связана с аномальной локализацией N-cadherin (Hierholzer and Kemler, 2010). Более тяжелый фенотип дезинтеграции наблюдается у N-cadherin-нулевых эмбрионов, которые обнаруживают аномальные поперечные перемещения нервной трубки неопределенные фенотипы закрытия PNP (Radice et al., 1997). Однако наши предварительные наблюдения показывают, что условное устранение N-cadherin у Pax3Cre knock-in мышей (такое же как использованное в данной работе) не вызывает NTDs. Эти наблюдения подтверждают, что функция клеточной адгезии β-catenin в Pax3-экспрессирующих нейроэпителиальных клетках, может быть необязательной для закрытия нервной трубки. Wnt/β-catenin signaling versus PCP signaling during neural tube closure Независимая от β-catenin передача сигналов PCP действует посредством цитоскелетной динамики, чтобы контролировать клеточную полярность и ориентированное перемещение ткани. Одиночные или скомбинированные мутации в генах передачи сигналов PCP у мышей, таких как Celsr1 (Curtin et al., 2003), Dvl1/2/3 (Etheridge et al., 2008;Hamblet et al., 2002; Wang et al., 2006a), Fzd3/6 (Wang et al., 2006b), Ptk7 (Lu et al., 2004), Scrib (Murdoch et al., 2003) и Vangl2 (Kibar et al., 2001; Murdoch et al., 2001), д. приводить к неспособности инициального закрытия нервной трубки и вызывать тяжелые NTDs. PCP-родственный Daam1-связывающий белок MIM необходим для закрытия нервной трубки у Xenopus (Liu et al., 2011). Среди этих генов, Fzds и Dvls также действуют выше β-catenin в каноническом пути передачи сигналов Wnt. Кроме того, Lrp6, Wnt корецептор, действующий выше β-catenin и также участвующий в конвергентном вытягивании, необходим для закрытия нервной трубки и удлинения каудальной части оси (Carter et al., 2005; Kokubu et al., 2004; Pinson et al., 2000; Tahinci et al., 2007; Zhou et al., 2010). Хотя мы не обнаружили достоверных отклонений в паттернах генной экспрессии репрезентативной передачи сигналов PCP у условных β-catenin мутантов, дальнейшие исследования необходимы для проверки, действует ли передача сигналов PCP, косвенно изменяя передачу сигналов β-catenin мутантов или передача сигналов β-catenin изменяет и вносит вклад в NTDs у PCP сигнальных мутантов, включая мутантов Fzds и Dvls.
Итак, данное исследование выявило новую функцию и подлежащий механизм передачи сигналов β-catenin в модуляции транскрипции Pax3 и Cdx2 в закрытии каудальной части нервной трубки и процессе её элонгации.
|