Посещений: 
ОРГАНИЗАЦИЯ ЯДРА
Роль длинных некодирующих РНК
|
|
Long noncoding RNAs: an emerging link between gene regulation and nuclear organization Sofia Quinodoz,
Mitchell Guttman
 Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 11, November 2014, Pages 651–663 |
Mammalian genomes encode thousands of long noncoding RNAs (lncRNAs) that play important roles in diverse biological processes. As a class, lncRNAs are generally enriched in the nucleus and, specifically, within the chromatin-associated fraction. Consistent with their localization, many lncRNAs have been implicated in the regulation of gene expression and in shaping 3D nuclear organization. In this review, we discuss the evidence that many nuclear-retained lncRNAs can interact with various chromatin regulatory proteins and recruit them to specific sites on DNA to regulate gene expression. Furthermore, we discuss the role of specific lncRNAs in shaping nuclear organization and their emerging mechanisms. Based on these examples, we propose a model that explains how lncRNAs may shape aspects of nuclear organization to regulate gene expression.
Рисунки к статье
|
RNA and 3D nuclear organization
Хотя весь геном присутствует в ядре каждой клетки, разные гены необходимы для достижения м экспрессии в разных клеточных условиях. Соответственно, ядро каждой клетки - это высоко организованное распределение ДНК, РНК и белков, которые динамически образуют ансамбли и регулируются при разных клеточных состояниях 1-3. Эти динамичные ядерные структуры в основном организованы вокруг функционально связанных ролей и часто появляются поперек нескольких хромосом 2-4. Сюда входят крупные ядерные тельца (т.e., ядрышко 5 and 6, ядерные пятна (speckle) [7], и paraspeckle 8 and 9), межгенные взаимодействия (т.e., транскрипционные фактории 10-12 и polycomb тельца 13-16), и взаимодействия промотор-энхансер [17]. Однако молекулярные компоненты, участвующие в становлении этой динамической организации всё ещё в основном неизвестны 1-3.
Давно подозревалось, что РНК могут играть роль в организации структур ядра. Ранние исследования heterogeneous nuclear RNA (hnRNA) выявили крупные пропорции poly(A)-модифицированных РНК, которые сохранялись в ядре и имели иной состав, отличный от messenger RNA (mRNA) и их предшественников 18-20. Многие из этих РНК были обнаружены локализованными в точных регионах ядра, включая ядерные пятнышки (speckles) [21] и др. ассоциированные с хроматином регионы 21 and 22. Последующие исследования показали, что глобальное нарушение транскрипции РНК, но не трансляции белков, приводит к видимым перестройкам ядерной организации [23]. Эти исследования привели к предположению, что охраняемые в ядре РНК могут играть важную структурную роль в ядре 18, 21 and 23.
В последнюю декаду многие тысячи функциональных lncRNAs были идентифицированы 24-27. Недавние работы подчеркнули, что многие из этих lncRNAs могут играть важную роль в разных биологических процессах 28-37. Как класс эти lncRNAs обычно многочисленны в ядре, особенно внутри фракции, ассоциированной с хроматином 27 and 38. Соотв. многие работы сфокусировались на роли lncRNAs в регуляции генов и особенно в рекрутировании хроматин регулирующих белков на места геномной ДНК 25, 39 and 40. Помимо этой роли некоторые недавние исследования продемонстрировали др. важную роль lncRNAs в ядре - оказалось. что некоторые lncRNAs важны для организации определенных ядерных структур 41-50.
Поскольку lncRNAs, скорее всего, распадаются на много разных классов с разными механизмами 25, 39 and 40, здесь рассмотрим только те lncRNAs, которые участвуют в регуляции экспрессии генов 25 and 40 и формировании 3D организации ядра 4, 35, 42-45 and 51.
Mechanisms of lncRNA regulation of gene expression through chromatin regulation
Становится ясно, что многие lncRNAs м. влиять на экспрессию разных генетических программ 25 and 40. Первым доказательством роли lncRNAs в регуляции генов стали исследования по инактивации Х хромосом у млекопитающих (XCI), процесса, обеспечивающего молчание всей Х хромосомы во время развития самок [52]. Этот процесс контролируется с помощью Xist lncRNA, которая транскрибируется исключительно с неактивной Х хромосомы (Xi) 53-55 и покрывает целиком Xi [56]. Важно, что генетическая делеция Xist предупреждает XCI [57], а индукции Xist достаточно, чтобы инициировать XCI на той же самой хромосоме, с которой она транскрибируется 58 and 59. Эта способность замалчивать зависит от дискретного региона lncRNA, домена A-повторов, чья делеция предупреждает транскрипционное молчание, не нарушая локализацию Xist по Х хромосоме [60].
Имеются многочисленные дополнительные примеры lncRNAs, участвующих в регуляции различных генов. Классический пример это Air lncRNA, которая ответственна за регуляцию гена Igfr2, контролирующего генетический импринтинг 61- 63. Кроме того, HOX антисмысловая межгенная РНК (HOTAIR) влияет на экспрессию генов в кластере HoxD [64] помимо др. генов по всему геному 33 and 65. Недавно было показано, что большой процент lncRNAs в клетке влияет на экспрессию разных генных программ 29, 30 and 66, включая те, что участвуют в эмбриональном развитии 28-30, кардиальной функции 31 and 32, иммунном ответе 67 and 68 и канцерогенезе 33-37. Исходя из этого были предложены разные регуляторные стратегии для lncRNAs, включая активацию 47 and 69 и репрессию 34, 52 and 64 генов в цис- 47 and 52 и трансположении 33 and 64.
lncRNAs can recruit chromatin regulatory proteins to genomic DNA targets
Информация о том, как lncRNAs могут регулировать экспрессию генов первоначально была получена в исследованиях Xist. В частности, эмбрионы самок, содержащие делецию компонентов Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), который помещает репрессивные гистоновые модификации на хроматин [70], неспособны поддерживать собственно XCI [71]. Позднее было показано, что PRC2 комплекс рекрутируется на всю Xi [38] и что время рекрутирования PRC2 в точности совпадает с индукцией Xist во время развития 52, 72 and 73. Важно, что делетирование определенного региона Xist lncRNA, домена B-F-повторов, вызывает потерю рекрутирования PRC2 на Xi не влияя на транскрипционное молчание или локализацию Xist по Xi во время индукции XCI[74]. Не смотря на это, всё ещё много вопросов остаются открытыми об обусловленном Xist рекрутировании PRC2. Во-первых, может ли Xist физически взаимодействовать с комплексом PRC2 75 and 76 или косвенно рекрутирует PRC2 74, 77 and 78 [78] (Box 1). Во-вторых, как Xist замалчивает транскрипцию и какова роль PRC2 во время индукции XCI [78], поскольку рекрутирование PRC2, по-видимому, не нужно для замалчивания транскрипции на Xi [74]. В частности, Xist мутанты, нарушающие способность рекрутирования PRC2 (мутации B-F повторов) всё ещё замалчивают транскрипцию [74], а мутанты, которые неспособны замалчивать транскрипцию (мутанты A-повторов) ё могут рекрутировать PRC2 на Xi 74 and 79, и Xist может индуцировать транскрипционное молчание в клетках, содержащих генетическую делецию PRC2 80 and 81. Несмотря на эти открытые вопросы, становится ясно, что Xist необходима для рекрутирования комплекса PRC2 на Х хромосому 73, 74 and 79.
|
Box 1.
Experimental methods to define lncRNA-protein interactions
There are several common methods for purifying lncRNA-protein complexes including protein-based and RNA-based purification methods. For a more complete discussion of these methods and their strengths and limitations, see [90].
Briefly, most lncRNA-chromatin interactions 34, 38 and 82, including the Xist-PRC2 interaction75 and 76, have been identified using 'native purification' methods, which purify RNA-protein complexes under physiological conditions. The advantage of these methods is that they preserve the native complexes present in the cell. However, these methods also have several limitations, including the potential for the identification of RNA-protein interactions that form in solution, which do not reflect interactions occurring in the cell 130 and 131. Because of these issues, there has been some debate about the biological significance of interactions detected by these methods 76, 78 and 89, including the Xist-PRC2 interaction, with some arguing that they are nonspecific [78].
One way to distinguish in vivo interactions from interactions that form subsequently in solution is by crosslinking RNA-protein complexes in the cell and purifying the complex under denaturing conditions[131]. Methods such as CLIP utilize UV crosslinking, which crosslinks directly interacting RNA and protein molecules, to purify complexes using high-stringency wash conditions followed by separation on a denaturing SDS-PAGE gel 132 and 133. A limitation of this method is that UV will not capture interactions that occur through a complex of multiple proteins [134]. This has restricted its adoption for mapping many chromatin regulatory proteins, because the precise protein within most chromatin regulatory complexes that might directly interact with a lncRNA is unknown.
Other crosslinking methods, such as formaldehyde, which crosslinks nucleic acid-protein as well as protein-protein interactions, can eliminate the need to know the exact interacting protein while enabling purification in high stringency conditions 30 and 135. Indeed, several studies have used this approach to map numerous chromatin regulatory proteins, including PRC2 and WDR5, and have identified a more specific set of interactions than previously identified by native purifications 30 and 84. However, adapting this formaldehyde approach to a denaturing strategy is challenging, since a denaturing SDS-PAGE gel will no longer resolve the purified complex. Furthermore, because formaldehyde crosslinks across a larger physical distances than UV, many of the interactions identified by this method might not reflect physical interactions between a lncRNA and chromatin complex [78]. For example, this approach will also identify chromatin proteins and lncRNAs that are in close proximity within a DNA locus; such proximity will likely occur for nascent transcripts and the many activating chromatin complexes bound near their transcription locus.
In the absence of the ability to define a lncRNA-protein interaction using direct crosslinking and denaturing conditions, it is unclear how to confidently define in vivo physical interactions using biochemical methods. In such cases, complimentary genetic methods are essential to demonstrate the functional importance of an identified lncRNA-protein interaction. | Модель рекрутирования хроматиновых белков может быть более общей и помимо Xist и была предложена для некоторых др. lncRNAs. Напр., HOTAIR, как полагают, физически взаимодействует с PRC2, а потеря функции HOTAIR приводит к уменьшению зависимого от PRC2 триметилирования гистона H3 по лизину 27 (H3K27me3), репрессивным модификациям в кластере генов HoxD 33 and 64, подтверждая, что HOTAIR рекрутирует PRC2 на эти гены и может участвовать в замалчивании их экспрессии. Др. пример - транскрипт HOXA на дистальном кончике (HOTTIP), который, как полагают, физически взаимодействует с белком WDR5, и такая потеря функции приводит к уменьшению ассоциированных с histone H3 lysine 4 trimethyl (H3K4me3) активных гистоновых модификаций на хроматине вдоль кластера генов HoxA [47], подтверждая, что HOTTIP рекрутирует WDR5 на эти гены и может быть вовлечена в активацию их экспрессии. В общем, большой процент lncRNAs, как полагают, физически взаимодействует с различными хроматиновыми регуляторными белками, включая PRC2 30, 38,82 and 83, WDR5 47 and 84 и др. считывающие 30, 35, 83 and 85, записывающие 30, 35, 63 and 86 и стирающие 30 and 87 хроматиновые модификации (Figure 1B). Эти примеры подчеркивают, как lncRNAs могут и активировать, и репрессировать экспрессию генов посредством общего механизма chromatin-centric recruitment (Figure 1A).
Figure 1.
Long noncoding RNA (lncRNA)-mediated regulation of gene expression through the recruitment of chromatin regulatory proteins. (A) Different cell types express distinct lncRNAs that can differentially recruit these same chromatin regulatory proteins, including the repressive Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) and the activating WDR5 chromatin-modifying protein, to specific genes. Inset: lncRNAs can recruit these complexes by binding to target sites through three mechanisms: tethering to its nascent transcription locus (top panel); directly hybridizing to genomic targets (middle panel); or interacting with a DNA-binding protein (bottom panel). (B) Different lncRNAs can scaffold unique assemblies of chromatin regulatory complexes. lncRNAs are generally expressed at lower levels relative their associated chromatin proteins (background). (C) lncRNAs may act to coordinate the regulation of gene expression at specific target locations. In this illustration, a lncRNA that can scaffold PRC2, the Jarid1c histone demethylase complex, and the ESET histone methyltransferase complex may act to remove histone H3 lysine 4 trimethyl (H3K4me3) and place histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3) and histone H3 lysine 9 dimethyl (H3K9me2), thereby coordinating the repression of transcription. Abbreviations: LSD1, lysine-specific histone demethylase complex 1; YY1, Yin Yang 1; CBX3, chromobox homologue 3; PolII, RNA polymerase II. |
Недавно было предположено, что PRC2 комплекс может взаимодействовать со всеми РНК в клетке - включая lncRNAs и мРНК 88 and 89. Продолжаются споры о том, сколько идентифицированных взаимодействий между lncRNAs и хроматиновыми белками специфично 76, 88 and 89 и происходят ли эти физические взаимодействия посредством прямых РНК-белок или косвенных межбелковых контактов 78 and 90 (Box 1). Однако становится всё яснее, что, по крайней мере, некоторые из этих взаимодействий lncRNA с хроматином важны для обусловленной с помощью lncRNA и хроматина регуляции генов. Напр., мутантный РНК-связывающий домен WDR5 элиминирует свои модификации хроматина и регуляторные активности генов на их сайтах мишенях, не нарушая их каталитической активности [84]. В общем, RNAi-обусловленная потеря функции некоторых lncRNAs воздействует на те же самые гены, которые испытывают влияние от потери функции ассоциированных с хроматином регуляторных белков 30 and 38.
Итак, эти результаты подтверждают, что многие lncRNAs может рекрутировать регуляторные комплексы на хроматин, чтобы специфицировать мишени на геномной ДНК для контроля генной экспрессии (Figure 1A).
lncRNAs may scaffold multiple chromatin proteins to coordinate discrete functions
Индивидуальные lncRNAs могут взаимодействовать с множественными хроматиновыми белками одновременно, что координировать многие функциональные роли, которые необходимы для собственно регуляции экспрессии генов (Figure 1B). Напр., HOTAIR, как полагают, взаимодействует как с PRC2 гистоновой метилтрасферазой, так и с LSD1 комплексом гистоновых деметилаз [87]. Это взаимодействие может быть важным для координации удаления активирующих меток (LSD1), так и для добавление репрессивных меток (PRC2) на хроматин. В общем, более 30 lncRNAs, экспрессируемых в эмбриональных стволовых клетках (ESCs), как полагают, взаимодействуют одновременно со многими регуляторными комплексами, которые могут считывать, записывать или стирать функционально важные хроматиновые метки [30]. В самом деле, некоторые из этих ESC lncRNAs могут взаимодействовать с Jarid1c с комплексом гистоновых деметилаз, PRC2 комплексом гистоновых метилтрансфераз и с комплексом ESET гистоновых метилтрансфераз [30]. Эти взаимодействия может быть важными для скоординированного удаления активирующих меток (Jarid1c) и добавления разных репрессивных меток на хроматин (PRC2, ESET) (Figure 1C). Важно, что многие из этих хроматиновых белков, как было установлено, ко-локализуются на специфических наборах генов в ESCs, даже принимая во внимание, что эти белки, по-видимому, не взаимодействуют непосредственно др. с др. 91-93.
Более того, Xist lncRNA способна координировать, по крайней мере, три самостоятельные функции, чтобы соответствовать своей роли в XCI. Эти функции обеспечиваются за счет разных генетических доменов в lncRNA, которые необходимы для замалчивания транскрипции (A-повторы) [60], рекрутирования PRC2 (B-F-повторы) [74] и локализации на хроматине (C-повтор) 94 and 95 - все они необходимы для собственно XCI. Не смотря на эти четкие генетические роли, точные молекулярные механизмы, с помощью которых Xist координирует эти функции, остаются неясными из-за белков, которые непосредственно взаимодействуют с Xist и всё ещё в основном неизвестны.
Итак, эти результаты подтверждают, что некоторые lncRNAs могут создавать уникальные ансамбли хроматиновых регуляторных комплексов и др. белковых комплексов, которые обычно не обнаруживают межбелковых взаимодействий (Figure 1B). Действуя как каркас для регуляторных белков, lncRNAs могут координировать регуляцию генной экспрессии путем рекрутирования набора белков, необходимых в комбинации для общей регуляции специфических наборов генов мишеней (Figure 1C).
Mechanisms of lncRNA recruitment to genomic DNA
lncRNAs могут распознавать сайты геномной ДНК посредством разных механизмов. Три общих механизма предложены для объяснения, как lncRNAs, которые рекрутируют белковые комплексы на геномную ДНК, распознают специфические сайты мишени (Figure 1A). (i) РНК полимераза может прикреплять lncRNA к месту её транскрипции и из этого места lncRNA может действовать на свои соседние гены. Этот механизм может объяснить локализацию Neat1 lncRNA, которая необходима для транскрипции, чтобы действовать даже когда присутствуют большие количества non-nascent РНК [42]. (ii) lncRNAs может взаимодействовать с ДНК путем непосредственной гибридизации нуклеиновых кислот. Сюда входят традиционные взаимодействия от спаривания оснований, которые объясняют специфичность РНК компонента теломеразы для повторов тепломерной ДНК [96]. Кроме того, lncRNAs могут взаимодействовать с ДНК посредством triplex-обеспечиваемых взаимодействий, которые могут объяснить локализацию специфических не кодирующих РНК на промоторах рибосомальной ДНК [97]. (iii) lncRNAs могут физически взаимодействовать с белками, связывающими ДНК. В самом деле, локализация Drosophila roX lncRNAs зависит от их взаимодействия с ДНК связывающим белком CLAMP, чтобы распознавать специфические сайты связывания ДНК 65, 98-100. Этот механизм может также объяснить локализацию Xist и Firre: обе lncRNAs, как полагают, взаимодействуют с hnRNPU/SAF-A ДНК связывающим белком, который необходим для их локализации на ДНК 45 and 101.
Однако эти механизмы - прикрепления с помощью полимеразы, гибридизации и обеспечиваемого с помощью ДНК связывающих белков рекрутирования - в отдельности может быть недостаточным для объяснения того, как lncRNA локализуется на специфических сайтах. Напр., roX lncRNAs локализуются благодаря своему взаимодействию с CLAMP, но они не взаимодействуют со всеми сайтами генома, где локализуется CLAMP
98 and 102. Сходным образом, Xist и Firre взаимодействуют с hnRNPU/SAF-A
45 and 101, всё же каждый локализуется на сильно отличающихся сайтах геномной ДНК. Это говорит о том, что специфичность может зависеть не от одного фактора, могут участвовать множественные независимые факторы, включая эти описанные выше, которые вместе и обеспечивают специфичность локализации. Не смотря на эти примеры остается в основном неизвестно, как большинство lncRNAs распознается и локализуется на геномной ДНК.
lncRNAs can exploit the 3D conformation of the nucleus to search for targets
Недавние результаты подкрепили потенциальный общий механизм, с помощью которого lncRNAs находят регуляторные мишени путем исследований 3D конформации ядра. Напр., Xist использует трехмерную ядерную организацию, чтобы расположить сайты ДНК мишеней, сначала с помощью локализации на геномных сайтах, которые находятся в тесной пространственной близости к их собственному транскрипционному локусу 44 and 103. Перемещение Xist в разные геномные места приводит к его релокализации на новые сайты геномных мишеней, это определяется их близким пространственным расположением к новым сайтам интеграции Xist [44]. Др. lncRNAs, как было установлено, также используют пространственную близость, чтобы идентифицировать сайты мишени 37,98 and 104. HOTTIP локализуется вдоль HoxA кластера, который находится в тесной пространственной близости к её собственному транскрипционному локусу [47].
Это взаимодействие между близостью управляемым поиском и локализацией lncRNA не ограничивается взаимодействиями, которые происходят на той же самой хромосоме, но могут также происходить между хромосомами, поскольку регионы, которые присутствуют на разных хромосомах, могут находиться в тесной пространственной близости в ядре [105] (Figure 2B). В самом деле CISTR-ACT lncRNA располагается на сайтах, присутствующих на той же самой хромосоме, также, как и на сайтах на разных хромосомах, которые находятся в тесной пространственной близости к локусу её транскрипции [46]. Эта модель управления близостью может также объяснить локализацию HOTAIR, первый пример транс регуляторной lncRNA. HOTAIR транскрибируется с HoxC локуса и регулирует экспрессию генов в HoxD локусе, который присутствует на др. хромосоме [64]. В самом деле, Hox генные локусы, несмотря на присутствие на разных хромосомах, часто взаимодействуют др. с др. в тесной пространственной близости в ядре
13, 106 and 107. Такая модель близостью управляемого поиска может объяснить очевидные наблюдения как цис, так и транс обусловленных регуляторных механизмов разных lncRNAs и может подтвердить, что эти кажущиеся дивергентными механизмы обнаруживают общий принцип близости внутри ядра (Figure 2).
Figure 2.
Long noncoding RNAs (lncRNAs) can utilize a proximity-guided search to localize to target genes. (A) lncRNAs can regulate genes (green box) on its own chromosome (left panel). In the nucleus, this regulation can occur if the lncRNA locus is in close physical proximity to its target sites (middle panel). For example, Xist localizes to genes across the X-chromosome (right panel).(B) lncRNAs can also regulate expression of genes on different chromosomes (blue box, left panel). In the nucleus, this can also occur when the lncRNA locus and its targets are in close proximity (middle panel). An example is Firre, which localizes to targets that are present across several chromosomes (right panel). (C) The concentration of a lncRNA will be highest (dark red - inner circle) near its site of transcription and will decrease (light red - outer circles) the further the distance is from its site of transcription, creating a concentration gradient of lncRNA abundance (red cloud, intensity indicates average lncRNA concentration). This spatial gradient establishes a nuclear domain with a high lncRNA concentration, where they can interact with site-specific targets (dark blue arrows). Conversely, lncRNAs outside of the nuclear domain will have a lower probability of interacting with site-specific targets (light blue arrows) due to decreased lncRNA concentration. Abbreviation: Pol II, RNA polymerase II.
Эта модель близостью управляемого поиска использует свойство, уникальное для РНК по сравнению с белками, которое заключается в её способности функционировать немедленно после транскрипции. В этой модели локальная концентрация lncRNA зависит прежде всего от её пространственного удаления от места её транскрипции, так что сайт, который будет находиться ближе будет иметь более высокую концентрацию, а сайт, который дальше, будет обладать низкой концентрацией. Всё же близость в отдельности недостаточна, чтобы объяснить взаимодействие, поскольку мРНК также присутствуют в высокой концентрации, но не действуют в зависимости от пространственной близости к локусу свой транскрипции. Сходным образом, Firre lncRNA взаимодействует со специфическими сайтами ДНК, которые находятся в пространственной близости к локусу
Firre, но не взаимодействует со всеми сайтами в пространственной близости [45]. Вместо этого др. механизмы, такие как закрепление, гибридизация или взаимодействия по связыванию ДНК, скорее всего, необходимы для собственно локализации lncRNA на специфических сайтах. В самом деле, roX lncRNAs взаимодействует со специфическими сайтами ДНК, определяемыми присутствием CLAMP ДНК элементов, только когда эти сайты присутствуют в тесной пространственной близости
98 and 104. Эти два компонента - близость и специфичность последовательностей - могут объяснить расположение многих lncRNAs. В частности, lncRNA может обладать высокой вероятностью взаимодействия с сайтом мишенью в регионе с высокой концентрацией, но она будет также обладать низкой вероятностью взаимодействия с сайтом мишенью в регионе низкой концентрации - даже если она обладает высоким сродством к этому сайту (Figure 2C). Важно, что такая стратегия может объяснить, как lncRNAs, которые в целом имеют низкую концентрацию, могут реально идентифицировать свои гены мишени путем поиска в тесной пространственной близости к своему транскрипционному локусу скорее, чем поиск по всему ядру.
lncRNAs are essential for the establishment and maintenance of nuclear domains
Недавние исследования подтвердили др. связь между lncRNAs и ядерной организацией - т.е. некоторые lncRNAs, как было установлено, играют критическую роль в сведении вместе ДНК, РНК и белков, чтобы активно формировать некоторые аспекты 3D ядерной организации. Мы обсудим примеры lncRNAs, которые устанавливают ядерные домены на разных уровнях организации от ядерных телец до энхансер-промотор взаимодействий (Figure 3).
Figure 3.
Long noncoding RNAs (lncRNAs) can shape 3D nuclear architecture across various levels of organization. (A) Actively transcribed Neat1 (red line) is required to establish the formation of the paraspeckle nuclear body (red cloud), which is an RNA-protein (gray) nuclear domain that is the site of nuclear retention of RNAs, such as the CTN RNA (black). (B) Xist (red line) establishes an intrachromosomal nuclear domain (red cloud) by nucleating near its transcription site (white box) and spreading to DNA sites in spatial proximity to its locus. (C)Firre establishes an interchromosomal nuclear domain and brings together targets on chromosomes 2, 15, and 17 into close physical proximity to its transcriptional locus on the X-chromosome. (D)lncRNAs acting at enhancers, such as the PRNCR1 and PCGEM1 lncRNAs, maintain the interaction between enhancer and promoter regions and may do this by interacting with proteins that can modify chromatin.
Nuclear bodies: Neat1 establishes the paraspeckle
Ядерные тельца paraspeckle состоят из разных РНК и белков, которые пространственно локализуются совместно и, как полагают, являются местами хранения редактируемых adenosine-to-inosine РНК 8 and 9. Недавние исследования продемонстрировали важную роль Neat1 lncRNA в формировании paraspeckles 42, 43 and 108. В частности, Neat1, как было установлено, располагается внутри paraspeckle 43, 108 and 109, а потеря ею функции приводит к потере paraspeckle домена 43 and 108. Напротив, индукция Neat1 достаточна для становления paraspeckle домена [42]. Более того, рекрутирование Neat1 на трансгенный сайт достаточно для создания paraspeckles в этом месте 42 and 110. В самом деле, синтетическое привязывание Neat1 к региону геномной ДНК достаточно для образования araspeckles, но прикрепление ассоциированных с paraspeckle белков, таких как PSP1, к ДНК недостаточно для сборки paraspeckles [110]. Транскрипция Neat1 необходима для становления и поддержания paraspeckles путем рекрутирования ассоциированных с paraspeckle белков на геномный локус Neat1 [42]. Соотв. нарушение транскрипции Neat1, даже без снижения общего уровня Neat1, приводит к потере paraspeckles [42].
Итак, эти исследования продемонстрировали, что Neat1 выполняет архитектурную роль в становлении и поддержании ядерных доменов paraspeckle путем использования в качестве затравки локуса его транскрипции и рекрутирования ассоциированных белков для создания РНК-Белок ядерного компартмента.
Intrachromosomal regulatory domains: Xist compacts the X-chromosome
Вовремя XCI, неактивная Х хромосома делается компактной и перемещается на периферию ядра, чтобы сформировать внутрихромосомный домен, наз. тельце Барра [52]. Это 3D реструктурирование Xi осуществляется с помощью Xist lncRNA 52 and 111. В самом деле интеграция Xist в трансгенные места, включая и аутосомы, достаточна для молчания, компактности и перемещения хромосомы, на которую интегрирована Xist 59 and 112. Xist распространяется от своего локуса транскрипции в инициальные сайты, которые находятся в тесной пространственной близости [44]. От этих сайтов Xist затем распространяется по всей Х хромосоме. Этот процесс распространения, как известно, вызывает существенные изменения в архитектуре Х хромосомы 52 and 111. Эти структурные изменения зависят от домена A-повтора Xist, того самого домене, необходимого для замалчивания транскрипции, поскольку делеция A-повтора приводит к исключению активно транскрибируемых регионов из территории молчащей Х хромосомы 44 and 51.
Итак, эти исследования продемонстрировали, что Xist необходима для реструктурирования регионов геномной ДНК, чтобы создать РНК-обусловленный молчащий ядерный компартмент. Xist осуществляет эту функцию путем распространения по Х хромосоме и включения генов в молчащий Xist компартмент [44].
Interchromosomal regulatory domains: Firre forms a trans-chromosomal compartment
Многие гены, которые присутствуют на разных хромосомах, могут часто оказываться в общих регионах ядра. Эти межхромосомные ядерные домены часто определяют по присутствию генов с общей функциональной ролью или по регуляции общими факторами
105, 113 and 114. Недавно lncRNA, наз. Firre, была идентифицирована, базируясь на её роли в адипогенезе [66]. Эта lncRNA, как было установлено, локализуется в одиночном ядерном домене, содержащем многие гены, прежде всего, участвующие в энергетическом метаболизме
45 and 66. Этот одиночный ядерный домен включает локус транскрипции Firre на Х хромосоме, а также, по крайней мере, 5 генов, расположенных в разных хромосомах, включая хромосомы 2, 9, 15 и 17
45. Важно, что делеция локуса Firre приводит к снижению совместной локализации транс-хромосомных контакторв внутри этого ядерного домена [45]. Случайная интеграция Firre с разными хромосомными регионами приводит к появлению новых ядерных фокусов, подтверждая, что Firre может быть достаточен для создания ядерного компартмента в месте его интеграции [45]. Итак, эти результаты подтверждают, что Firre необходим для поддержания и может также быть необходим для становления образования транс-хромосомного ядерного компартмента, содержащего гены мишени с общей функцией.
Enhancer-promoter interactions: lncRNAs acting at enhancers can promote chromosomal looping
Регуляция генов использует физические взаимодействия между регионами дистального энхансера и промоторами, которые они регулируют. Недавние исследования показали, что некоторые lncRNAs могут действовать как регионы активных энхансеров. Некоторые lncRNAs, как полагают, играют роль в обеспечении хромосомных взаимодействий между регионом энхансера и ассоциированного с ним промотора35, 37, 48, 115-117. Напр., estrogen-induced [116] и androgen-induced lncRNAs [35], как было установлено, поддерживают образование петель ДНК между регионами энхансера и промотора и благодаря этому взаимодействию способствуют активации чувствительных к эстрогенам генов и активируемых рецептором андрогена генов, соотв. Эти результаты подтверждают, что некоторые lncRNAs действуют как энхансеры, необходимы для поддержания 3D хромосомных петель между энхансером и ассоциированным с ним промотором.
Поскольку всё ещё неизвестно о том, как эти lncRNAs действуют на работу энхансеров, то первая информация получена от двух специфических lncRNAs, которые экспрессируют на высоком уровне в раке простаты [35]. PRNCR1 lncRNA соединяется с регионами энхансера андрогенным рецепторами регулируемых генов и, как полагают, рекрутирует DOT1L гистоновую метилтрансферазу на энхансер. Рекрутирование этого хроматинового белка в свою очередь рекрутирует вторую lncRNA, PCGEM1, в тот же самый регион. PCGEM1 lncRNA, как полагают, взаимодействует с Pygo2, считывающий H3K4me3, который может распознавать группы моделирования в регионах активного промотора [35]. Посредством рекрутирования этих белков эти lncRNAs, по-видимому, облегчают образование петли между регионами энхансера и промотора, приводя к последующей активации гена мишени [35]. Эти результаты подтверждают, что lncRNAs, действуя как энхансеры, могут рекрутировать регуляторные белки хроматина, чтобы создавать взаимодействия высокого сродства между разными регионами ДНК и посредством этого влиять на изменение положения регионов энхансера и промотора, приводя их в тесную пространственную близость.
Итак, эти и др. результаты [41] демонстрируют, что некоторые lncRNAs играют важную роль в становлении и поддержании ядерных структур высокого порядка на разных уровнях ядерной организации от ядерных телец до взаимодействий энхансер-промотор.
A proposed model for lncRNA-mediated organization of nuclear structure
Поскольку имеются некоторые доказательства, что lncRNAs могут рекрутировать регуляторы хроматина, модифицируя структуру хроматина, регулируя экспрессию генов, поиск пространственной близости и перемещая гены в ядерный домен, то как эти механизмы работают вместе, создавая динамический ядерный компартмент, остается неизвестно. Важная информация может быть получена в исследованиях формирования ядерных телец, которое зависит от многих молекул, включая РНК, ДНК и белок, соединяющихся вместе в одном ядерном регионе 4, 118 and 119. Этот процесс нуждается в локализации инициального фактора затравки (nucleating), который дает начало организации и рекрутирует др. факторы в это место 4 and 119. Напр., закрепление индивидуальных РНК или белков, которые присутствуют в тельцах Cajal в случайных местах генома, достаточно, чтобы дать начало образованию новых телец Cajal в этом месте 110 and 120. В этом контексте хорошо изученных ядерных телец, таких как тельца Кахаля и ядрышки, участвующие белки имеют домены, которые позволяют им взаимодействовать с самими собой, создавая тем самым предпочтительные взаимодействия между молекулами с теми же самыми характеристиками 118, 119, 121 and 122. Такая самоорганизация создает высокие локальные концентрации определенного набора молекул внутри пространственно ограниченного региона вокруг инициального фактора нуклеации (затравки) [119].
Этот процесс может объяснить сборку др. функциональных ядерных структур: ДНК содержащих общераспространенных паттернов модификаций хроматина [16], или ДНК, которые связаны с общераспространенными белками, такими как PRC2 13-15 или различных транскрипционных факторов 10-12, могут совместно давать кластеры в близком 3D соседстве. Поскольку точный механизм, приводящий к этим специфическим дальнодействующим взаимодействиям, в основном неясен [123], то очевидно, что сходное свойство самоорганизации может участвовать в этом, поскольку молекулы, обладающие общими характеристиками преимущественно взаимодействуют при 3D близости 124 and 125.
Базируясь на исследованиях, описанных выше, мы предложили модель того, как lncRNAs м. организовывать архитектуру ядра (Figure 4). Эта модель является расширением той, что первоначально предложена для Neat1 [42] и Xist [44]. В этой модели lncRNAs могут давать начало организации путем создания доменов с высокой локальной концентрацией lncRNA вблизи места их транскрипции. Это д. позволять lncRNAs создавать каркасы для различных белковых комплексов и тем самым создавать затравку для сборки комплексов lncRNA-белок, повышая эффективную концентрацию белков внутри этого домена
4 and 42. lncRNAs могут затем взаимодействовать с высоким сродством с сайтами мишенями, чтобы достигать специфичности и рекрутировать lncRNA-белковые комплексы на специфические сайты мишени. В этих мишенях lncRNA-белковые комплексы могут модифицировать состояние хроматина и благодаря этому м. действовать, чтобы осуществлять смену позиции сайтов ДНК на новые ядерные домены, обладающие той же модификацией хроматина или оккупированными белками [44]. Важно, действительно ли модификации хроматина или др. механизмы, такие как самоорганизация, базирующаяся на рекрутировании общих белковых комплексов, управляют сменой позиций (repositioning), но это ещё предстоит подтвердить. Предложенная модель не ограничивается образованием компартментов ДНК, но может также объяснить пространственную сборку доменов РНК и белка в ядре за счет сходного lncRNA-centric механизма
42, 110 and 122.
Figure 4.
A model for how long noncoding RNAs (lncRNAs) can dynamically shape nuclear organization. The proposed steps involved in lncRNA mediated assembly of nuclear organization roughly based on the proposed models for the Neat1 [42] and Xist [44]lncRNAs. (A) Transcription of a lncRNA can seed the formation of a lncRNA nuclear domain. (B) lncRNAs can bind to proteins in the nucleus (gray circles) to scaffold protein complexes. Formation of these complexes will nucleate the formation of a spatial compartment (red cloud, broken lines) near the transcriptional locus of the lncRNA. (C) lncRNAs can bind to specific DNA sites (white squares) to recruit lncRNA-protein complexes to target sites. (D) By recruiting these complexes to DNA, lncRNAs can guide chromatin modifications (blue histones), such as repressive histone modification (red marks). (E) Modified chromatin may be compressed and repositioned into a new nuclear region. (F) As the lncRNA continues to be transcribed from its transcriptional locus, it may iteratively bind to DNA sites (green regions), modify target sites, and reposition DNA into the lncRNA nuclear domain. This continuous process may act to maintain the nuclear domain established by a lncRNA. Abbreviation: PolII, RNA polymerase II.
Этот процесс распространения и смены позиции lncRNA может использовать повторяющиеся ступени, с помощью которых lncRNA, будучи активно транскрибируемой, сможет продолжать засеивать, нуклеировать, модифицировать и менять позицию генов в расширенный ядерный домен [44]. Напр., Xist распространяется на новые сайты на Х хромосоме путем взаимодействия в пространственной близости с генами, которые еще не подверглись замалчиванию, и затем к изменению позиции таких генов в всё увеличивающийся ядерный компартмент молчания [44]. После его становления lncRNA может поддерживать этот домен за счет продолжающейся транскрипции с места в тесной пространственной близости к вновь сформированному компартменту, подобно тому, как Neat1 оказывается необходим для поддержания paraspeckles благодаря продолжающемуся процессу транскрипции [42].
Possible implications of lncRNA-mediated nuclear organization in gene regulation
Становится ясно, что имеются функциональные ядерные домены, содержащие одинаковые паттерны модификации хроматина [16] или оккупированных белков
2, 10, 12 and 14. Однако не вся ДНК, которая модифицирована или связана со специфическими белками в ядре, пространственно локализована внутри одиночного ядерного домена
13 and 16. Предполагается, что разные lncRNAs могут устанавливать эти специфические ядерные домены путем создания каркаса и рекрутирования отличающихся комбинаций белков. (Figure 5A). Напр., ядро содержит множественные дискретные функциональные домены, которые обогащены белком polycomb (polycomb тельца)
14 and 15; один из таких доменов это неактивная Х хромосома [79], которая создаётся с помощью специфической lncRNA и пространственно отличается от др. обогащенных polycomb доменов в ядре.
Figure 5.
A hypothesis for how long noncoding RNAs (lncRNAs) may act to assemble dynamic and specific nuclear domains. (A) Nuclear domains that share the same proteins can interact in different regions of the nucleus. Zoom-in panels: we hypothesize that different lncRNAs may act to distinguish between these domains by scaffolding and assembling distinct domains. (B) Through linear co-regulation, operons can simultaneously regulate sets of genes (A, B, C and D, E, F) with shared regulatory functions. Activators (pink triangles) and repressor (green boxes) control operon expression under a particular cell state. We hypothesize that through spatial co-regulation, lncRNAs may nucleate the formation of nuclear domains to co-localize target genes upon induction of lncRNA expression. For example, upon induction of lncRNA1, genes A, B, and C are co-regulated in a nuclear domain (red cloud, broken lines). Under a different cell state, lncRNA1 expression is repressed, leading to the breakdown of thelncRNA1 nuclear domain and expression of lncRNA2 leads to formation of another nuclear domain (blue cloud, broken lines) containing genes D, E, and F.
Поскольку ядерная организация, как известно, чрезвычайно динамична между разными клеточными состояниями, то как такая организация динамически устанавливается во время разных процессов, таких как клеточная дифференцировка, остается неясным 11, 106,126 and 127. Мы полагаем, что некоторые lncRNAs могут действовать как 'организационные центры', чтобы устанавливать специфичные для типа клетки ядерные домены, которые организуют гены со сходной функцией в тесное 3D соседство. Такая роль согласуется с наблюдением, что lncRNAs обладают экстраординарной специфичностью для типа клеток 26, 27 and 128, в противовес белкам, которые часто повторно используются во многих клеточных контекстах [129]. В этой модели ядерные компартменты могут быть динамически организованы просто благодаря активации или репрессии одиночного гена lncRNA (Figure 5B).
Эта предполагаемая роль lncRNAs в качестве организационных центров может представить собой идеальную стратегию того, как локализованные в ядре lncRNAs могут действовать, чтобы регулировать экспрессию генов. Поскольку lncRNAs обычно экспрессируются в низких концентрациях, то вероятность скоординированных находок множественных генов мишеней, которые распределены по всему ядру, будет низкой, в принципе приводя к неоднородной экспрессии этих генов. Имеется два теоретических решения: повышение концентрации lncRNA или образование в кластеры генов мишеней в пространственной близости. Т.к. оба подхода объясняют проблему наблюдаемого распределения генов, но повышенные уровни lncRNA не могут быть оптимальным решением, поскольку это д. приводить к субнасыщению каркасов lncRNA, при этом они д. быть ассоциированы с регуляторными белками (Figure 1B). Следовательно, регуляция с помощью lncRNA множественных рассредоточенных генов нуждается в выборе оптимального соотношения между оптимальностью находок всех генов (высокая экспрессия lncRNA) с оптимумом взаимодействия со всеми необходимыми регуляторными белками (низкая экспрессия lncRNA). Образование пространственных кластеров предоставляет идеальное решение, поскольку оно позволяет lncRNA легко находить все свои мишени, базируясь на пространственной близости, при этом lncRNA оказывается в высокой локальной концентрации, так как обеспечивает насыщение lncRNA регуляторных комплексов, чтобы скоординировано регулировать все свои гены мишени.
c
Concluding remarks
While the role of lncRNAs in establishing nuclear organization is attractive, many questions remain. Currently, there are only a few examples of lncRNAs that organize nuclear domains, and even for these few lncRNAs, how they organize these nuclear domains is largely unknown. Future studies will be required to determine whether this role may be a more general role for nuclear-retained lncRNAs and whether there may be general mechanistic principles by which lncRNAs act to shape nuclear domains. In particular, it will be important to identify additional lncRNA-mediated nuclear domains and characterize the dynamics of their formation across various cellular conditions. Such examples will allow us to dissect the precise mechanisms by which lncRNAs can organize nuclear domains and determine the various components required for domain assembly. To address these questions, it will be important to develop experimental systems, such as inducible lncRNA systems that enable precisely controlled formation of the associated nuclear domain, to dissect dynamic nuclear organization at the molecular level. Such experimental systems will enable the systematic perturbation of a lncRNA, including deletion of specific protein binding regions, and the measurement of their roles in the establishment and maintenance of nuclear domains. Finally, it will be essential to determine the role that lncRNA-mediated regulation of nuclear organization plays in the control of gene expression. While much work remains to be done, it is now clear that the roles of lncRNAs in regulating gene expression and establishing nuclear organization may be more tightly linked than previously appreciated.