Посещений:
ЗУБНАЯ МЕЗЕНХИМА: ВЫБОР ОДОНТОГЕННОЙ СУДЬБЫ

Роль передачи сигналов FGF и β-catenin

FGF signaling sustains the odontogenic fate of dental mesenchyme by suppressing β-catenin signaling
Chao Liu, Shuping Gu, Cheng Sun, Wenduo Ye, Zhongchen Song, Yanding Zhang and YiPing Chen
Development. 2013 Nov;140(21):4375-85.

Odontoblasts and osteoblasts develop from multipotent craniofacial neural crest cells during tooth and jawbone development, but the mechanisms that specify and sustain their respective fates remain largely unknown. In this study we used early mouse molar and incisor tooth germs that possess distinct tooth-forming capability after dissociation and reaggregation in vitro to investigate the mechanism that sustains odontogenic fate of dental mesenchyme during tooth development. We found that after dissociation and reaggregation, incisor, but not molar, mesenchyme exhibits a strong osteogenic potency associated with robustly elevated β-catenin signaling activity in a cell-autonomous manner, leading to failed tooth formation in the reaggregates. Application of FGF3 to incisor reaggregates inhibits β-catenin signaling activity and rescues tooth formation. The lack of FGF retention on the cell surface of incisor mesenchyme appears to account for the differential osteogenic potency between incisor and molar, which can be further attributed to the differential expression of syndecan 1 and NDST genes. We further demonstrate that FGF signaling inhibits intracellular β-catenin signaling by activating the PI3K/Akt pathway to regulate the subcellular localization of active GSK3β in dental mesenchymal cells. Our results reveal a novel function for FGF signaling in ensuring the proper fate of dental mesenchyme by regulating β-catenin signaling activity during tooth development.


Рисунки к статье

Разнообразные церепно-лицевые органы и ткани, такие как Мекелев хрящ, кость верхней и нижней челюсти, тройничный ганглий и дентин-продуцирующие одонтобласты, происходят из клеток черепно-лицевой части нервного гребня (Chai et al., 2000; Chung et al., 2009). Несмотря на происхождение из одной и той же популяции предшественников, черепно-лицевые кости и зубы обладают отличающимися онтогенетическими, морфологическими и гистологическими характеристиками (Lumsden, 1988; D'Souza et al., 1999; Chai et al., 2000; Zhang et al., 2005; James et al., 2006). Хорошо известно, что множественные сигнальные пути, включая Wnt, TGFβ/BMP, Hh и FGF, участвуют в регуляции каждой ступени развития зубов (Thesleff and Mikkola, 2002; Tummers and Thesleff, 2009), но механизмы, которые специфицируют и гарантируют одонтогенетическую судьбу в зубной мезенхиме, остаются в основном неизвестными.
Передача сигналов FGF участвует в регуляции развития зубов rна нескольких самостоятельных ступенях. Передача сигналов FGF может участвовать в спецификации одонтогенетической судьбы как в зубном эпителии, так и зубной мезенхиме, как показывает экспрессия Fgf8 в презумптивном зубном эпителии и индукция им Pitx2 и Pax9, самых ранних молекулярных маркеров зубного эпителия и мезенхимы, соотв. , чтобы детерминировать место формирования зуба (Neub?ser et al., 1997; Trumpp et al., 1999; St Amand et al., 2000). На стадии бутона, эпителиальные белки FGF4 и FGF8, скорее всего, активируют Fgf3 в зубной мезенхиме посредством Msx1 и Runx2, а FGF3, в свою очередь, возможно вместе с FGF10, действует в обратном направлении на зубной эпителий, чтобы индуцировать и поддерживать экспрессию Shh в эмалевых узелках (Bei and Maas, 1998; Kettunen et al., 2000; Aberg et al., 2004). На стадии шапочки экспрессия нескольких FGFs в эмалевом узелке стимулирует клеточную пролиферацию в зубном эпителии, приводя к образованию эпителиальных складок и формированию паттерна кончика зуба (cusp) (Jernvall et al., 1994; Jernvall and Thesleff, 2000). Более того, высвобождение передачи сигналов FGF от супрессии с помощью Sprouty факторов приводит к образованию зубов в регионе diastema, указывая на потенциальную роль передачи сигналов FGF в регуляции одонтогенной судьбы (Klein et al., 2006; Li et al., 2011b).
Важная роль канонической передачи сигналов Wnt (Wnt/β-catenin) в развитии зубов хорошо документирована (Liu and Millar, 2010). Многие Wnt лиганды экспрессируются в развивающихся зубах, преимущественно в эпителиальном компоненте, при этом WNT5A, не канонический Wnt, в мезенхиме (Dassule and McMahon, 1998; Sarkar and Sharpe, 1999). Эти Wnt лиганды, по-видимому, действуют внутритканевым и межтканевым способом, чтобы регулировать развитие зубов. Делеция в эпителии Catnb (Ctnnb1 - Mouse Genome Informatics), гена, кодирующего β-catenin, или Gpr177 (Wls - Mouse Genome Informatics), продукт которого необходим для секреции Wnts, приводит к аресту развития зубов на ст. почки (бутона) или ранней ст. шапочки (Liu et al., 2008; Zhu et al., 2013). развития наблюдается у мышей, лишенных Catnb в зубной мезенхиме (Chen et al., 2009). Напротив, постоянная активация передачи сигналов β-catenin в ротовом эпителии вызывает образование эктопических зубов (Jarvinen et al., 2006; Liu et al., 2008). Хотя активность передачи сигналов β-catenin присутствует в зубной мезенхиме резцов на ст. E12.5 (Fujimori et al., 2010), такая активность никогда не была описана в мезенхиме резцов после E12.5 и не была обнаружена в развивающейся мезенхиме коренных зубов, при использовании нескольких репортерных линий мышей с передачей сигналов Wnt/β-catenin, включая BATGAL, TOPGAL и TCF/Lef-lacZ мышей (Liu et al., 2008), подтверждая, что активность Wnt/β-catenin поддерживается на очень низком уровне, если вообще существует, в зубной мезенхиме. Повышенная передача сигналов Wnt/β-catenin приводит к образованию похожей на кость ткани в зубной пульпе (Chen et al., 2009; Li et al., 2011a). Т.о., тонко настроенный уровень передачи сигналов Wnt/β-catenin sважен для собственно развития зубов.
Здесь мы исследовали механизмы, лежащие в основе наших предыдущих находок, что зачатки зубов ранних моляров и резцов обладают различающейся способностью после диссоциации и реагрегации in vitro (Song et al., 2006).

DISCUSSION


Elevated β-catenin signaling in the dental mesenchyme is detrimental to normal odontogenesis


Множественные Wnt лиганды экспрессируются в зубном эпителии развивающихся зубов и действуют внутри эпителия, чтобы регулировать раннее развитие зубов (Zhu et al., 2013). Эти экспрессирующиеся в эпителии Wnts воздействуют на зубную мезенхиму и формируют Wnt-BMP петлю (circuit) обратной связи, при этом экспрессирующийся в мезенхиме белокBMP4 обеспечивает эпителиально-мезенхимные взаимодействия во время раннего развития зубов (O'Connell et al., 2012). Потребность в передаче сигналов β-catenin в зубной мезенхиме для раннего развития зубов проявляется арестом развития моляров на стадии почки и расщеплением плакоды резца у мышей, обнаруживающих тканеспецифическую инактивацию гена Catnb в зубной мезенхиме (Chen et al., 2009; Fujimori et al., 2010), хотя вклад в фенотип за счет нарушений клеточной адгезии в отсутствие β-catenin, не может быть исключен. Однако, действует ли передача сигналов β-catenin в мезенхиме рано развивающихся зубов остается спорным. Хотя передача сигналов активности β-catenin была обнаружена в зубной мезенхиме в ходе всего развития зубов при использовании Axin2lacZ knock-in аллеля (Lohi et al., 2010), др. репортерные линии передачи сигналов β-catenin оказались неспособны выявить позитивную активность (Liu et al., 2008). Учитывая тот факт, что Axin2 экспрессируется в зачатках развивающихся зубов и что отсутствие Axin2 приводит к усилению активности передачи сигналов β-catenin тканеспецифическим способом (Yu et al., 2005a; Lohi et al., 2010; Qian et al., 2011), экспрессия аллеля Axin2lacZ в зубной мезенхиме может быть следствием гаплонедостаточности Axin2. Тем не менее, эти наблюдения подтверждают, что активная передача сигналов β-catenin в зубной мезенхиме тонко регулируется на низком уровне, чтобы осуществить его физиологическую функцию.
Принимая это во внимание наше исследование показало, что активная передача сигналов β-catenin сильно активируется в мезенхимных клетках реагрегатов резцов, приводя к неспособности образования зубов и к превращению одонтогенных клеток в остеогенные клетки, это указывает на передачу сигналов β-catenin как на мощный остеогенный регулятор (Hartmann, 2006). Сходным образом, была описана похожая на кость ткань, формирующаяся в пульпе зубов, ассоциированная с избыточной активностью β-catenin (Chen et al., 2009; Li et al., 2011a). Т.о., повышенная передача сигналов β-catenin должна менять одонтогенетическую программу в зубных мезенхимных клетках и превращать их в остеогенные клетки.

FGF signaling inhibits β-catenin signaling in the dental mesenchyme


Во время развития и физиологических процессов передача сигналов Wnt в точности регулируется рядом модуляторов на внутри- и внеклеточном уровнях (Clevers and Nusse, 2012). Кроме того, интенсивность передачи сигналов Wnt/β-catenin также регулируется путем взаимодействия с др. путями передачи сигналов. В развивающихся зубах экспрессируются несколько внутриклеточных антагонистов Wnt, включая Dkks, Sfrps и SOSTDC1 (Leimeister et al., 1998; Laurikkala et al., 2003; Fjeld et al., 2005), а потеря Smad4в зубной мезенхиме приводит к подавлению Wnt ингибиторов DKK1 и SFRP1, приводя к повышению активности β-catenin и последующему образованию похожих на кость структур (Li et al., 2011a). В данном исследовании мы показали, что экзогенное воздействие DKK1 неспособно предупредить эктопическую активацию передачи сигналов β-catenin в мезенхиме резцов, а экзогенное воздействие WNT10B не может индуцировать реакцию канонической передачи сигналов в молярной мезенхиме, указывая тем самым на существование внутриклеточного регуляторного механизма активности β-catenin в зубной мезенхиме. Эти наблюдения объясняют также, почему активность β-catenin сохраняется на очень низком уровне, если вообще сохраняется, в зубной мезенхиме, несмотря на экспрессию множественных канонических Wnts в зубном эпителии.
Далее мы показали, что FGFs, включая экспрессируемый в мезенхиме FGF3 и происходящие из эндотелия FGF4 и FGF8, супрессируют активность β-catenin в мезенхиме резцов. Удивительно, воздействие экзогенного FGF3 не только ингибирует активность β-catenin и остеогенез в реагрегатах резцов, но и также восстанавливает одонтогенетическую способность в смысле образования зубов в реагрегатах. Определенно, поскольку механохимический контроль мезенхимных конденсаций, как было установлено, является критическим для развития зубов (Mammoto et al., 2011), то вклад в мезенхимные конденсации передачи сигналов FGF, чтобы сформировать зубы, не может быть исключен.
Эти результаты указывают на новую функцию передачи сигналов FGF в регуляции одонтогенной судьбы путем ослабления передачи сигналов β-catenin за счет предупреждения локализации в ядре β-catenin. Поскольку происходящие из эпителия FGF4 и FGF8 также ингибируют активность передачи сигналов β-catenin в зубной мезенхиме, как и др. FGFs, такие как Fgf9 и Fgf10, и они совместно экспрессируются в развивающихся зубах (Kettunen and Thesleff, 1998; Kettunen et al., 2000), то отсутствие дефектов зубов у Fgf3 нулевых мышей может быть приписано функциональному перекрыванию между этими FGFs (Mansour et al., 1993). Это может также объяснить, почему зубы формируются в тканевых рекомбинантах из интактного зубного эпителия и лишенного FGF мезенхимного реагрегата для резцов (data not shown).

FGF signaling inhibits mesenchymal β-catenin signaling through activating the PI3K/Akt pathway


Поскольку Wnt лиганды экспрессируются преимущественно в зубном эпителии развивающихся зачатков зубов, то эктопическая активация передачи сигналов β-catenin в мезенхимных реагрегатах резцов в отсутствие зубного эпителия, по-видимому, возникает в результате внутриклеточного снижения супрессии активности β-catenin. Это мнение в дальнейшем было подтверждено тем фактом, что экзогенное воздействие DKK1 неспособно предупредить активацию передачи сигналов β-catenin в изолированной мезенхиме резцов и тем, что экзогенный WNT10B не способен индуцировать передачу сигналов β-catenin в мезенхиме моляров. Ранее было показано, что передача сигналов FGF активирует каноническую передачу сигналов Wnt с помощью ингибирования GSK3β посредством PI3K/Akt пути в туморогенезе (Katoh and Katoh, 2006). Однако, передача сигналов FGF может также супрессировать передачу сигналов β-catenin путем активации GSK3β посредством PI3K/Akt пути в mESCs (Singh et al., 2012). В последней системе накопление активной GSK3β (p-GSK3βY216) в ядре способствует дифференцировке mESCs,тогда как активированный PI3K/Akt путь перемещает активную GSK3β в цитоплазму и способствует клеточной пролиферации (Bechard and Dalton, 2009).
В данном исследовании мы показали, что в клетках зубной мезенхимы передача сигналов FGF супрессирует передачу сигналов β-catenin за счет поддержания активной GSK3β в цитоплазме посредством активации пути PI3K/Akt. Это подтверждается повышенным уровнем p-AktSer473 и транслокацией p-GSK3βY216 из ядра в цитоплазму в диссоциированных клетках мезенхимы резцов в присутствии FGF3. Ингибирование пути PI3K/Akt облегчает импорт активных GSK3β и β-catenin в ядро, приводя к активации передачи сигналов β-catenin. Однако вносят ли вклад и др. зависимые от FGF пути, такие как путь Erk/Mek, также участвующий в репрессии передачи сигналов β-catenin, и действительно ли передача сигналов FGF регулирует неканоническую передачу сигналов Wnt в зубных мезенхимных клетках будет показано в дальнейших исследованиях.

Differential expression of syndecan 1 and NDST genes confers different osteogenic potency on incisor and molar mesenchyme after dissociation and reaggregation


Наше исследование показало, что несмотря на экспрессию Fgf3 в мезенхиме зачатков резцов и моляров на ст. E14.5, FGF3 сохраняется на клеточной поверхности мезенхимы моляров, но не мезенхимы резцов поле диссоциации и реагрегации. Сохранение FGF3 в реагрегатах моляров, по-видимому, обеспечивает одонтогенную судьбу и делает возможным одонтогенез, но отсутствие удержания FGF3 ведет к активации передачи сигналов β-catenin и к отклонению одонтогенной судьбы в реагрегатах резцов. Такая отличающаяся способность удержания FGF может быть приписана дифференциальной экспрессии syndecan 1 в мезенхиме резцов и моляров. Несколько syndecans, являющихся основными HSPGs клеточных мембран, экспрессируются в развивающихся зубах, при этом syndecan 1 обнаруживает наивысший уровень экспрессии (Thesleff et al., 1988; Vainio et al., 1989; Vainio et al., 1991; Vainio and Thesleff, 1992; Bai et al., 1994). Потребность в syndecan 1 для передачи сигналов FGF была описана у млекопитающих в развитии кортекса, при эпителиально-мезенхимных переходах и туморогенезе (Stepp et al., 2002;McDermott et al., 2007; Wang et al., 2012). Однако нулевые по syndecan 1 мыши не обнаруживают дефектов развития зубов, что указывает на функциональную компенсацию за счет др. syndecans (Alexander et al., 2000; Stepp et al., 2002). Наивысший уровень экспрессии syndecan 1 в мезенхиме моляров, по-видимому, является критическим для сохранения FGF3 в реагрегатах. Кроме того, NDSTs также регулирует передачу сигналов FGF во время органогенеза, т.к. цепочки heparan sulfate обеспечивают резистентность к энзимам переваривания и высокое сродство связывания FGF со стержнем протеогликана (Pan et al., 2006; Pan et al., 2008; Hu et al., 2009). Наивысший уровень экспрессии NDST в мезенхиме моляров по сравннению с таковым в мезенхиме резцов, должен в дальнейшем обеспечить наивысшее сульфатирование гепарана в HSPGs, включая syndecan 1, в мезенхиме моляров и д. вносить вклад в сохранение FGF3 (Lin, 2004; H?cker et al., 2005). Т.о., наивысшие уровни syndecan 1 и NDSTs ответственны за сохранение FGF3 в реагрегатах моляров. Это мнение в дальнейшем было подтверждено тем фактом, что избыточное переваривание с помощью трипсина или воздействия heparinases приводит к активации передачи сигналов β-catenin, отсутствию сохранения FGF3 и к неспособности образования зубов в молярных реагрегатах.
Итак, мы показали, что усиленная передача сигналов β-catenin связана с изменением судьбы клеток зубной мезенхимы и что передача сигналов FGF способна обеспечить одонтогенную судьбу путем супрессии внутриклеточной передачи сигналов β-catenin. Взаимодействие между передачей сигналов FGF и β-catenin, по-видимому, регулирует собственно выбор судьбы клетками черепно-лицевого нервного гребня во время формирования зубов и костей челюстей.