Посещений:
МОРФОГЕНЕЗ ОБОНЯТЕЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ

Роль N-myc

Progressive effects of N-myc deficiency on proliferation, neurogenesis, and morphogenesis in the olfactory epithelium
Walter Wittmann, Thomas Schimmang, Lena Gunhaga
Develop Neurobiol 74: 643–656, 2014

N-myc belongs to the myc proto-oncogene family, which is involved in numerous cellular processes such as proliferation, growth, apoptosis, and differentiation. Conditional deletion of N-myc in the mouse nervous system disrupted brain development, indicating that N-myc plays an essential role during neural development. How the development of the olfactory epithelium and neurogenesis within are affected by the loss of N-myc has, however, not been determined. To address these issues, we examined anN-mycFoxg1Cre conditional mouse line, in which N-myc is depleted in the olfactory epithelium. First changes in N-myc mutants were detected at E11.5, with reduced proliferation and neurogenesis in a slightly smaller olfactory epithelium. The phenotype was more pronounced at E13.5, with a complete lack of Hes5-positive progenitor cells, decreased proliferation, and neurogenesis. In addition, stereological analyses revealed reduced cell size of post-mitotic neurons in the olfactory epithelium, which contributed to a smaller olfactory pit. Furthermore, we observed diminished proliferation and neurogenesis also in the vomeronasal organ, which likewise was reduced in size. In addition, the generation of gonadotropin-releasing hormone neurons was severely reduced in N-myc mutants. Thus, diminished neurogenesis and proliferation in combination with smaller neurons might explain the morphological defects in the N-myc depleted olfactory structures. Moreover, our results suggest an important role forN-myc in regulating ongoing neurogenesis, in part by maintaining the Hes5-positive progenitor pool. In summary, our results provide evidence that N-myc deficiency in the olfactory epithelium progressively diminishes proliferation and neurogenesis with negative consequences at structural and cellular levels


Рисунки к статье

Семейство myc прото-онкогенов состоит из c-myc, N-myc и L-myc, трех родсвенных генов, участвующих в разнообразных биологических процессах, таких как пролиферация, дифференцировка и апоптоз [rev. (Henriksson and Luscher, 1996; Facchini and Penn, 1998; Eilers and Eisenman, 2008)]. Мыши, дефицитные по c-myc или N-myc, погибают приблизительно на день эмбриогенеза 10 (E10) или E12, соотв. (Charron et al.,1992; Trumpp et al., 2001), тогда как дефицит L-myc не приводит к летальному фенотипу (Hatton et al., 1996). N-myc-дефицитные эмбрионы обнаруживают задержку развития органов, которые обычно экспрессируют высокие уровни N-myc, такие как сердца, легкие и кишечник (Charron et al., 1992). Интересно, что эти онтогенетические дефекты N-myc мутантов появляются, несмотря на компенсаторное увеличение экспрессии c-myc (Stanton et al., 1992), это указывает на важность функций N-myc во время развития. Условная делеция N-myc в клетках нейрональных предшественников предотвращает ранний летальный фенотип и показывает насколько критическим фактором является N-myc во время развития нервной системы (Knoepfler et al., 2002; Dominguez-Frutos et al., 2011; Kopecky et al., 2011). Дефицитные по N-myc мыши обнаруживают аномальное поведение в соответствии с двукратным уменьшением массы головного мозга, включая тяжелые дефекты в мозжечке (Knoepfler et al., 2002). Кроме того, уловная делеция N-myc отической плакоде тяжело нарушает развитие внутреннего уха, включая нарушение морфологии и дезорганизацию иннервации (Dominguez-Frutos et al., 2011; Kopecky et al., 2011).
Как часть периферической нервной системы, обонятельные плакоды дают обонятельный эпителий (также известный как основной обонятельный эпителий) и вомероназальный орган. В целом, обонятельные сенсорные нейроны обонятельного эпителия передают восприятия запахов, тогда как вомероназальный орган детектирует феромоны и обе структуры проецируют аксоны в разные регионы мишени обонятельных луковиц. Кроме того, как полагают, нейроны с gonadotropin-releasing hormone (GnRH) происходят из эпителия вомероназального органа и медиальной стенки обонятельной ямки (Schwanzel-Fukuda and Pfaff, 1989; Wray et al., 1989). GnRH нейроны мигрируют в ассоциации с аксонами, происходящими из обонятельного эпителия и вомероназального органа, в направлении гипоталамуса в переднем мозге (Wray et al., 1994; Norgren et al., 1995; Yoshida et al., 1995). Продукция GnRH в гипоталамусе контролирует репродуктивную систему позвоночных путем стимуляции высвобождения gonadotrophins из передней части гипофиза, это влияет на функцию гонад [rev. (Wray, 2010)]. Кстати, отсутствует корреляция между N-myc и GnRH нейронами.
Обонятельный эпителий является одним из немногих регионов нервной системы, где нейрогенез сохраняется в течение всей жизни за счет генерации обонятельных сенсорных нейронов. Поэтому он может служить модельной системой для изучения регуляторных процессов во время эмбрионального и взрослого нейрогенеза (Cau et al., 1997; Kawauchi et al.,2009; Tucker et al. 2010; Fletcher et al., 2011; Maier et al., 2011; Packard et al.,2011). Нейрогенез в обонятельном эпителии начинается уже на стадии обонятельной плакоды у мышей и кур, а клон сенсорных нейронов содержит клетки, подобные стволовым, клетки нейрональных предшественников на разных стадиях созревания и постмитотические обонятельные нейроны (Kawauchi et al., 2005; Maier and Gunhaga,2009; Wei et al., 2013). Разные типы клеток могут обнаруживать экспрессию специфических молекулярных маркеров; подобные стволовым клетки предшественники экспрессируют basic helix-loop-helix репрессорный ген Hes5 (Cau et al., 2000; Maier and Gunhaga, 2009), клетки непосредственных нейрональных предшественников характеризуются экспрессией Neurogenin1 (Ngn1) (Cau et al., 2002; Maier and Gunhaga, 2009), а клетки, готовые выйти из клеточного цикла, экспрессируют маркер терминальной нейрональной дифференцировки NeuroD1 (Cau et al., 2002). Все постмитотические нейроны экспрессиют генеральные нейрональные маркеры HuC/D (Fornaro 2003) и Tuj1 (Wei et al., 2013), тогда как субнабор нейронов экспрессирует LIM-гомеодоменовый транскрипционный фактор Lhx2 (Hirota and Mombaerts, 2004; Kolterud et al., 2004). Однако, возможное влияние myc протоонкогенов на развитие обонятельного эпителия и нейрогенез в нем, не было исследовано.
В данной работе мы анализировали влияние N-myc на развитие обонятельного эпителия и нейрогенез в нём, используя недавно описанную линию мышей, у которых дефицит N-myc ограничен Foxg1-позитивными клетками (Dominguez-Frutos et al., 2011). Экспрессия Foxg1 (также известного как brain factor-1) обнаруживается уже при начале нейрогенеза в обонятельной плакоде мышей на ст. E9.5 (Xuan et al., 1995), а также на более поздних стадиях обонятельного развития (Kawauchi et al., 2009). Наши результаты показали прогрессирующий эффект нехватки N-myc, заключающийся в снижении пролиферации, нейрогенеза и в нарушении морфогенеза обонятельного эпителия мышей со ст. E10.5 вплоть до E13.5. На ст. E13.5, популяция похожих на стволовые клеток предшественников истощалась и снижались пролиферация и генерация нейронов, приводя к тяжелому уменьшению обонятельного эпителия. Т.о.,, N-myc является существенным фактором для постоянного нейрогенеза и для собственно развития обонятельного сенсорного эпителия.

DISCUSSION


Нейрогенез - это процесс, с помощью которого генерируются нейроны из нейральных стволовых клеток и предшественников. Немногие структуры нервной системы поддерживают нейрогенез в течение всей жизни, включая обонятельный эпителий, относящийся к периферической нервной систме. Нейрогенез обонятельного эпителия происходит упорядоченным образом, а специфические типы клеток в клоне нейронов могут быть идентифицированы с помощью отличающихся маркеров (Cau et al., 2002; Beites et al., 2005; Murdoch and Roskams, 2007; Maier and Gunhaga, 2009). Кроме того, обонятельный эпителий обладает потенциалом восстанавливаться почти полностью после повреждения [rev. (Schwob, 2002)], это делает эту структуру ценной модельной системой для изучения регуляторных механизмов нейрогенеза. Несмотря на расширение наших знаний о контроле обонятельного нейрогенеза (Duggan et al., 2008; Tucker et al., 2010; Gokoffski et al., 2011; Maier et al., 2011; Packard et al., 2011), мало известно о том, как члены семейства myc влияют на развитие и нерогенез в обонятельном эпителии. Наши результаты предоставили доказательство, что N-myc необходим для нормального развития обонятельного эпителия, чобы поддерживать пролиферацию, нерйогенез и последующий морфогенез обонятельной ямки и вомероназального органа.
Наши результаты показали, что хотя N-myc экспрессируется начиная со ст. E9.5 в обонятельной плакоде, при инициации обонятельного нейрогенеза, первые изменеия у N-myc-дефицитных мышей наблюдались несколько позже, на ст. E11.5. На этой стадии, N-myc-/- эмбрионы обнаруживают снижение нейрогенеза по всему обонятельному эпителию, тогда как снижение пролиферации обнаруживается только в медиальной части. Эти результаты указывают на то, что критическая роль N-myc в обонятельном эпителии ограничивается стадиями упрочившегося нейрогенеза. Наша находка, что N-myc необходим для поддержания пролиферации и нейрогенеза согласуется с предыдущими исследованиями, показавшими, что N-myc регулирует пролиферацию в головном мозге и дифференцировку в головном мозге, внутреннем ухе и сетчатке (Knoepfler et al., 2002; Martins et al., 2008; Dominguez-Frutos et al., 2011; Kopecky et al., 2011). В соответствии с нашими результатами данные из лаб. LaMantia также показали, что на ст. E11.5 происходит быстрая пролиферация в медиальной части обонятельного эпителия, тогда как пролиферация в латеральной части протекает медленно и симметричным образом (Tucker et al., 2010). Интересно, что быстро делящиеся клетки предшественников в медиальном домене обонятельного эпителия, как полагают, дают обонятельные сенсорные нейроны, вомероназальные нейоны и GnRH нейроны (Tucker et al., 2010). Базируясь на результатах, что высокие уровни экспрессии N-myc обнаруживаются в быстро делящихся предшественниках и низкие уровни N-myc в более медленно делящихся клетках, было предположено, что N-myc регулирует клеточный цикл нейрональных предшественников (Knoepfler et al., 2002; Wey et al., 2010; Dominguez-Frutos et al.,2011). Поэтому возможно, что более высокие уровни экспрессии N-myc, выявляемые в медиальной части обонятельного эпителия определяют быстро делящиеся клетки нейрогенных предшественников. Более того, это может объяснитть, почему снижение пролиферации наблюдается только в медиальной части N-myc-дефицитного обонятельного эпителия.
На ст. E11.5 вомероназальный орган является частью медиального обонятельного эпителия, но не на ст. приблизительно E13, когда вомероназальный орган отделяется и развивается независимо. Кроме того, GnRH нейроны являются первыми, обнаруживаемыми на ст. E11 в медиальной стенке развивающегося обонятельного эпителия, а позднее в отделившимся вомероназальном органе (Schwanzel-Fukuda and Pfaff, 1989; Wray et al., 1989). Более того, было показано, что GnRH нейроны мигрируют в ассоциации с аксонами, происходящими из обонятельного эпителия и вомероназального органа в направлении к гипоталямусу в переднем мозге (Wray et al., 1994; Norgren et al., 1995; Yoshida et al., 1995). Наш анализ N-myc-/- эмбрионов показал, что уже на ст. E11.5, что медиальная часть обонятельного эпителия меньше и обнаруживает менее заметный проспективный вомероназальный орган, а на ст. E13.5 вомероназальный орган сильно уменьшен в размере. Далее наши результаты предоставили доказательства, что генерация GnRH нейронов снижена приблизительно до 85% на ст. E13.5 у N-myc-дефицитных эмбрионов. Клиническим аспектом снижения количества GnRH нейронов в гипоталамусе является синдром Kallmann (MacColl et al., 2002; Balasubramanian et al.,2010). Пациенты с синдромом Kallmann страдают от репродуктивной дисфункции, в частности от гипогонадотропного гипогонадизма и иногда от anosmia (потери обоняния). Два гена, KAL и KAL2 (fibroblast growth factor 1 receptor) оказались связаны с небольшим процентом случаев синдрома Kallmann (Franco et al., 1991; Legouis et al., 1991; Dode et al., 2003). Поэтому большинство пациентов с синдромом Kallmann's имеют мутации в неизвестном гене, среди которых данное наше исследование идентифицировало N-myc в качестве гена кандидата. Эмбриональное происхождение предшественников GnRH нейронов спорное, помимо обонятельного эпителия, аденогипофизная плакода и клетки нервного гребня считаются в качестве возможного источника нейронов GnRH у рыбок данио (Whitlock et al., 2003). Однако у мутантных мышей или с отсутствием или нарушениями передней части гипофиза, GnRH нейроны развиваются нормально в ассоциации с вомероназальым органом (Metz and Wray, 2010). Независимо от источника GnRH нейронов наши результаты показывают, что нормальное развитие медиальной стенки обонятельной ямки и вомероназального органа является критическим для генерации GnRH нейронов. Является ли уменьшение GnRH нейронов у N-myc-/- эмбрионов прямым влиянием, вызываемым потерей активности N-myc или является вторичным эффектом, обусловленным нарушением развития медиальной стенки обонятельного эпителия и вомероназального органа, ещё предстоит определить.
Наши результаты показывают прогрессивное снижение пролиферации и экспрессии Notch1 в N-myc-дефицитном обонятельном эпителии, а на ст. E13.5 Hes5+ пролиферативный пул клеток полностью теряется. Наши данные также показали прогрессивное уменьшение генерации нейронов. Более того, хотя структура носа была неотличима у мышей дикого типа и мутантов, морфология обонятельного эпителия была уродливой и обонятельный эпителий и вомеронезальный орган были значительно меньше в размере у N-myc-/- мышей. Наши результаты показали, что уменьшение в размере обонятельных структур не обусловлено повышенной гибелью клеток, а скорее вызвано снижением пролиферации. Кроме того, наш серологический анализ разных популяций клеток показал, что генерируемые HuC/D+ нейроны меньше у N-myc мутантов. Однако, хотя серологический анализ был ограничен HuC/D+ нейронами, др. популяции клеток также могут быть затронуты. Т.о., наши результаты подтверждают, что уменьшение пролиферации и нейрогенеза в комбинации с малыми размерами клеток ответственны за тяжелую атрофию обонятельного эпителия и вомероназального органа у N-myc-дефицитных мышей. Эта гипотеза находится в согласии с находками, что myc гены могут активировать экспрессию некоторых генов. которые участвуют в регуляции размера клеток, синтезе белков и росте (Iritani and Eisenman, 1999; Coller et al., 2000; Boon et al., 2001). Вслед за предыдущим исследованием подтверждено, что уменьшение размеров клеток может объяснить меньший размер головного мозга N-myc-дефицитных мышей (Knoepfler et al., 2002).
Поскольку N-myc, как было установлено, широко экспрессируется в нервной системе, то экспрессия c-myc ограничена др. тканями и органами (Stanton et al., 1992). Интересно, что повышенная экспрессия c-myc обнаружена на ст. E10.5 в нейроэпителии N-myc-дефицитных мышей (Stanton et al., 1992), указывая на компенсаторную петлю обратной связи myc генов в нервной системе. Однако, усиление экспрессии c-myc оказалось недостаточным для ослабления тяжелого фенотипа делеции N-myc (Stanton et al., 1992). Наши данные показали, что потеря N-myc в обонятельном эпителии мыши не стимулирует увеличения уровней активности c-myc. С др. стороны, N-myc, как было установлено, восстанавливает важную роль c-myc во время эмбрионального развития и компенсирует большинство его функций (Malynn et al., 2000).