Астроциты, как полагают, являются относительно инертными клетками, выполняющими множественные роли в развитии, созревании и в повреждениях или болезнях ЦНС [1,2]. Напр., астроциты играют ключевую роль в синаптогенезе, поддержании ионов и уровней трансмиттеров, ы метаболическом гомеостазе и поддержании нейронов после повреждений [3]. Несмотря на их важность, всё ещё недостаточно изучены факторы, необходимые для дифференцировки этих клеток.
В зрелом зрительном нерве имеются три типа клеток макроглии: типа I и типа II астроциты и олигодендроциты [4]. Астроциты типа I возникают из экспрессирующих PAX2 нейроэпителиальных клеток эмбрионального оптического стержня и субпопуляция этих клеток мигрирует из оптического стержня на поверхность сетчатки, где они ассоциируют с поверхностными сосудами, чтобы сформировать гематоретинальный барьер [5-7]. Кроме того, астроциты типа I из этого клона остаются в зрительном нерве по соседству с глазным яблоком (globe) внутри глиальной тонкой пластинки, сеть хрящевых лучей облечена астроцитами, аналогичными таковым решетчатой пластинки (lamina cribrosa) человека [8]. Олигодендроциты, клетки, формирующие миелин ЦНС, возникают из клеток предшественников олигодендроцитов, которые мигрируют из вентральной части диэнцефалона в зрительный нерв посредством зрительного перекреста (chiasm). Клетки предшественники олигодендроцитов также дают астроциты типа II, по крайней мере, in vitro, но имеются противоречивые сообщения в литературе, относительно происхождения этого in vivo [4,9]. Растет понимание, что секретируемые внешние и внутренние сигналы необходимы глиальным клеткам для развития, включая leukemia inhibitory factor (LIF), bone morphogenetic proteins (BMPs), sonic hedgehog (SHH) и их внутриклеточные сигнальные пути [7,10-12]. Имеются также доказательства, что эпигенетические факторы кооперируют с передачей сигналов этих трех путей [13,14]. Однако мало известно о роли специфических эпигенетических факторов, играющих роль в развитии глии зрительного нерва.
Expression of HDACs in murine optic nerve. Western blot analysis of HDAC proteins in E16, P5 and P30 murine optic nerve was performed to check the specificity of the antibodies used for the study. Blots were normalized to β-TUBULIN. Densitometric graphs for each HDAC panel show quantification of protein levels expressed as fold-change from E16. p менее 0.05 was considered statistically significant and represented by a single *, whereas p менее 0.005 is represented by **. Bars show mean?±?SEM of three samples per timepoint. Note that the apparent increase in band intensities for some P5 samples (e.g. HDAC2, 3 and 4) reflect increased protein loading in those lanes.
Таблица 1. Localization of HDACs in murine optic nerve
Эпигенетика это изучение факторов, которые изменяют активность транскрипции без изменения последовательности самой ДНК. Эти факторы включают метилирование ДНК и модификации гистонов [15]. Гистоны могут быть модифицированы посредством пост-трансляционных модификаций, таких как ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинирование и сумоилирование [16]. Ацетилирование хвостов гистонов регулируется с помощью двух крупных семейств энзимов: histone acetyl transferases (HATs) и histone deacetylases (HDACs). Добавление ацетильными группами к гистоновым отпрыскам (offsets) позитивного заряда гистоновым хвостам приводит к расслаблению структуры хроматина, которое в свою очередь приводит к большей доступности для общих и клеточно-специфических транскрипционных факторов к связывающим элементам внутри ДНК [17]. HDACs обычно ассоциируют с репрессией транскрипции, хотя имеются также сообщения, что активность HDAC ассоциирует с активацией транскрипции [18,19]. Далее и HATs, и HDACs могут соотв. ацетилировать и деацетилировать не гистоновые белки в цитоплазме, воздействуя тем самым на экспрессию или функцию белков [20-25].
В то время как HDACs, как известно, играет важную роль в развитии глиальных клеток и в болезненных состояниях в др. регионах ЦНС, отсутствует информация о паттернах экспрессии HDAC в развивающемся зрительном нерве. Определяли пространственно-временные паттерны экспрессии метилированного гистона 3 (K9), ацетилированного гистона 3 (K18) и HDACs 1-6 и 8-11 в развивающемся зрительном нерве мыши, сфокусировавшись на peripapillary глиальных ламинарных регионах. Используя RT-qPCR и western blot анализ, мы установили, что HDACs 1-11 экспрессируются в зрительном нерве. Иммуногистохимия с двойным мечением показала три паттерна глии вдоль зрительного нерва: 1) главным образом ядерную локализацию (HDACs 1 and 2), 2) цитоплазматическую и ядерную на одной или нескольких стадиях развития (HDACs 3, 5, 6, 8 and 11) и 3) цитоплазматическую на всех исследованных стадиях развития (HDACs 4, 9, 10). Это исследование является первой важной ступенью по идентификации HDACs, которые могут участвовать в конформации хроматина во время дифференцировки астроцитов зрительного нерва.
Итак, иммунореактивность ацетилированных и метилированных гистонов H3 локализуется совместно в ядрах большинства SOX2 позитивных глиальных клеток в головке зрительного нерва и соседнем оптическом нерве на всех стадиях развития. HDACs 1-11 экспрессируются в глиальных клетках зрительного нерва на всех трех стадиях развития зрительного нерва у мышей, но обнаруживают различия во времени в общих уровнях и субклеточной локализации. HDACs 1 и 2 были преимущественно в ядрах в ходе всего развития зрительного нерва и созревания глиальных клеток. HDACs 3, 5, 6, 8 и 11 были преимущественно цитоплазматическими, но обнаруживали ядерную локализацию, по крайней мере, на одной из стадий развития зрительного нерва. HDACs 4, 9 и 10 были преимущественно цитоплазматическими с незначительной или отсутствием ядерной экспрессии в ходе всех исследованных стадий развития.
Полученные результаты показали, что HDACs 1, 2, 3, 5, 6, 8 и 11 были локализованы в ядрах SOX2 позитивных клетках глии на определенных стадиях развития и созревания зрительного нерва, это подтвердило предыдущие сообщения об экспрессии HDAC в стареющем зрительном нерве. Эти HDACs являются кандидатами для дальнейшего исследования, чтобы понять, как ремоделирование хроматина посредством ацетилирования и метилирования влияет на развитие глии, а также участвует в реакции на её повреждение.
