Во время процесса образования эндохондриальной кости, который приводит к становлению диафизарных POCs и эпифизарных SOCs, происходит скоординированный переход от пролиферации к терминальной дифференцировке и гипертрофии хондроцитов, который завершается минерализацией гипертрофическими хондроцитами своего ECM и происходит апоптоз или аутофагическая гибель клеток [2], [4], [7]. Инвазия эндотелиальных клеток начинается с генерации васкуляризованных хрящевых каналов из надхрящницы в терминальный слой апопических хондроцитов, заканчивающаяся образованием новых капилляров в POCs[19]. В центрах оссификации васкуляризация, как было установлено, происходит прежде гипертрофии, минерализации матрикса и последующего апоптоза или аутофагической гибели хондроцитов [19]. Для создания подходящих условий для сосудистой инвазии, мы установили скоординированный переход от пролиферации к терминальной дифференцировке и гипертрофии хондроцитов, тонко регулируемого под контролем транскрипционных факторов RUNX2 и DLX5 в исследованных ростовых пластинках человека. Вновь формируемые кровеносные сосуды предоставляют доступ мириадам различных клеток предшественников с высокой специализацией, участвующих в развитии центров оссификации [9]-[11], [35]. Мы нашли доказательства появления клеток предшественников CD90+ из мезенхимного клона в POC и SOC, но клетки предшественники из миелоидного клона, экспрессирующие CD133, были чрезвычайно редки. В POCs, но не в SOCs, одиночные клетки предшественники CD133+ могут быть обнаружены рядом с незрелыми сосудами и сосудистыми аркадами с выстилкой из CD34+ эндотелиальных клеток. Интересно, что клетки предшественники CD90+ из мезенхимного клона обнаруживают тенденцию поиска физического контакта с CD34+ незрелыми эндотелиальными клетками из вновь сформированных эндотелиальных разрастаний. Эти незрелые сосуды лишены abluminal покрытия с α -SMA+ гладкомышечными клетками, которые важны для стабилизации сосудов, поскольку они предупреждают удаление лишних сосудов [36]. Возможно, что только скоординированное и тонко настроенное конкурентное развитие незрелых CD34+ эндотелиальных клеток и субэндотелиальных CD90+ предшественников гладкомышечных клеток является обязательным предварительным условием для успешного образования новых сосудов в POCs, а также в SOCs. Субэндотелиальные гладкомышечные клетки могут развиваться из перицитов. Эти клетки могут привлекаться из соседних резидентных мезенхимных клеток путем репликации, миграции и дифференцировки из др. перицитов из растущего сосудистого зачатка или они могут возникать из мезенхимных предшественников [35], [37]. Имеется физиологическая необходимость в перекрестной дифференцировке клеток соединительной ткани в образовании новых кровеносных сосудов, а именно необходимость в адаптации к разным тканям, которые присутствуют по соседству одна с д-ру во время процесса стабилизации сосудов [37]. Несмотря на обширные исследования, мы не обнаружили доказательств появления клеток эндотелиальных предшественников, экспрессирующих CD133 и VEGFR-2 в POCs и SOCs. Скорее всего, что новые сосуды были сформированы путем разрастания новых капилляров из уже существующих сосудов, происходящих из костной манжетки или c помощью intussusception скорее, чем образования сосудов de-novo c помощью клеток эндотелиальных предшественников, экспрессирующих CD133 и VEGFR-2. Недавно было показано, что эндохондральная оссификация необходима для формирования ниш для гематопоэтических стволовых клеток [36]. Matrigel, включающий клетки предшественники с поверхностными маркерами CD105+Thy1? (CD90), отсортировывающийся с 15.5 дня после спаривания, может быть рекрутирован если трансплантируется под почечную капсулу взрослых мышей, хозяина продуцируемых сосудов, продуцирует полученные от донора эктопическую костную ткань непосредственно из хряща и генерирует полости костного мозга, заселенные происходящими от хозяина долговременно воспроизводимыми HSCs [36]. Эти результаты могут подтвердить гипотезу, что клетки предшественники CD133+, обнаруживаемые в POCs и SOCs из полидактиличных пальцев участвуют в образовании ниш для будущих стволовых клеток скорее, чем для васкулогенеза.

Васкуляризация в GOR и ROL, которая служит в качестве резервуара для пред-хрящевых клеток в зародышевом слое [38], а в случае ROL удерживает клетки от просачивания наружу при осевой нагрузке, как было установлено, более развита, чем в соотв. центрах оссификации. Интактная зона надхрящницы с оптимальной васкуляризацией важна для продольного роста кости, т.к. переломы Salter-Harris типа IV внутри GOR приводят к тяжелым нарушениям роста [39], [40]. Небольшие капилляры с CD34+ эндотелиальными клетками, стабилизированными c помощью α -SMA+ гладкомышечных клеток, которые обнаруживаются с началом GOR и ROL. GOR, как было установлено, поддерживает свои свойства предшественников точно также как ниши для стволовых клеток костного мозга и обладают обширной сосудистой сетью [9], [10]. Клетки предшественники в перихондриальном GOR у самок белых кроликов из Новой Зеландии, экспрессирующих STRO-1, Jagged1 и bone morphogenetic protein receptor 1a (BMPr1a) и имеют морфологию, сходную с мезенхимными стволовыми клетками. Мы обнаружили клетки предшественники из мезенхимного клона, экспрессирующие CD90 и в определенной степени CD105 в базальном слое GOR в соответствии с предыдущими сообщениями [9]-[11], [35]. Когда эти мезенхимные клетки предшественники дифференцировались, то они теряли экспрессию CD90 и CD105 и перемещались в апикальную часть GOR, чтобы распространиться позднее по всему хрящу. В мышиной модели эти экстенсивно пролиферирующие клетки, как было установлено, включают BrdU в свою ДНК спустя 10-12 дней после добавления BrdU, и трансфицированные клетки из GOR первоначально мигрируют обратно в перихондриальный желоб и позднее глубже в эпифиз [41] или на поверхность суставного хряща [9]. Кроме того, надхрящница и надкостница, соседствующие с эпифизом, оказывались сильно васкуляризованными и обладали множественными одиночными CD133+ клетками-предшественниками.

8 из незрелых исследованных ростовых пластинок обнаруживали или хрящевые зачатки, или начинающиеся центры оссификации. Хрящевые зачатки, формируемые в результате конденсаций мезенхимы и последующей дифференцировки в хрящ, первоначально являются бессосудистыми структурами, которые поддерживаются за счет получения кислорода и питательных веществ путем диффузии [42]. На этой ст. развития ростовой пластинки кислородная задолженность из-за отсутствия кровеносных сосудов усиливает анаболический метаболизм в хондроцитах ростовой пластинки и активирует hypoxia-inducible factors (HIFs) [11], [43]. HIF-1α необходим для выживания хондроцитов во время гипоксии, он стимулирует продукцию коллагена типа II и индуцирует экспрессию разных изоформ VEGF в хондроцитах. VEGF сначала присутствует в хрящевом ECM, а после деградации ECM с помощью MMPs like MMP-2, MMP-9 и MMP13, высвобождается VEGF и может соединяться с VEGFR1 и 2 сосудистых эндотелиальных клеток и пре-остеобластов, способствуя тем самым инвазии сосудов и замещению хряща костью [44]. На этой стадии развития кости мы не обнаружили доказательств экспрессии VEGFR1 или VEGFR2 эндотелиальными клетками или клетками предшественниками эндотелия.