WNT белки составляют семейство сигнальных молекул, контролирующих пролиферацию, выбор судьбы, полярность и миграцию в ходе эволюции метазоа [1]. Путем использования различных рецепторов и ко-рецепторов на клеточной мембране, эти белки активируют контекст-зависимую внутриклеточную сигнальную сеть, чтобы индуцировать разнообразные биологические реакции [2]. Нарушения регуляции передачи сигналов WNT часто ассоциируют с болезнями человека [3]. Передача сигналов WNT в первую очередь ассоциирует в болезнями костей, так установлено, что мутации потери функции в WNT ко-рецепторе LRP5 вызывает синдром osteoporosis-pseudoglioma syndrome (OPPG) (Gong et al., 2001). Напротив, дефицит секретируемого ингибитора WNT, SOST, или мутации в LRP5 отражают устойчивость WNT к ингибиторам, таким как SOST или DKK1, что приводит к избыточной массе кости у пациентов [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Кроме того, мутации в WTX, ингибиторе передачи сигналов WNT/β-catenin, выявили причину X-linked sclerosing bone dysplasia, известной как OSCS у человека [10], [11]. У мышей делеция LRP5 или глобально или специфически вызывает в костях мышей остеопению [12], [13], тогда как экспрессия формы, дающей увеличение костной массы, LRP5 увеличивает разрастание кости [13], [14]. Более того, мыши, лишенные одного из аллелей DKK1 или обоих аллелей SOST обнаруживают избыточную костную массу [15], [16]. В целом генетические доказательства у человека и мыши подтверждают важность передачи сигналов WNT для формирования кости.
Сеть внутриклеточной передачи сигналов WNT, участвующая в формировании кости, изучена недостаточно [17]. Работы на эмбрионах мыши показали, что делеция β -catenin, или LRP5 и LRP6, в остеогенных предшественниках устраняет дифференцировку остеобластов, указывая, что β-catenin, скорее всего, является критическим компонентом сети передачи сигналов WNT, ответственной за остеобластогенез у эмбрионов [18], [19], [20], [21], [22]. Однако эти мыши погибают при рождении и поэтому непригодны для оценки обеспечивает или нет β-catenin функцию WNT в формировании постнатальной кости. Мы и др. недавно показали, что делеция β-catenin в клетках, экспрессирующих Osx, избирательно у постнатальных мышей уменьшает продолжительность жизни и активность остеобластов, а также усиливает адипогенез в костном мозге [23], [24]. Помимо β-catenin, активация PKCδ или CAMKII с помощью WNT посредством передачи сигналов phosphatidylinositol, как было установлено, способствует дифференцировке остеобластов [25], [26]. Кроме того, множественные WNT лиганды, как было установлено, активируют mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) [27], [28]. Недавно мы показали, что WNT белки также активируют mTORC2, чтобы стимулировать гликолиз [29]. mTORC1 отличается от mTORC2 тем, что он уникально содержит Raptor и остро чувствителен к rapamycin [30]. Поскольку передача сигналов mTORC1 является центральным механизмом интеграции внеклеточных и внутриклеточных сигналов при анаболическом метаболизме, то это может потенциально обеспечивать функцию WNT во время формирования кости. В целом WNT белки могут способствовать костному анаболизму посредством сигнальной сети, состоящей из множественных взаимосвязанных модулей.
Несмотря на четкую роль передачи сигналов WNT, физиологические WNT лиганды, способствующие формированию кости, только начинают выявляться. WNT1 недавно был увязан с физиологией костей у человека, т.к. гетрозиготные и гомозиготные мутации были идентифицированы у пациентов с наследственным рано начинающимся остеопорозом или osteogenesis imperfecta, соотв. [31], [32], [33], [34]. У мышей WNT10B участвует в постнатальном образовании кости [35], [36], но фенотип уменьшения костной массы у Wnt10b -/- мышей появляется позднее в жизни, чем у Lrp5-/- животных [37], указывая, что LRP5 может взаимодействовать с др. WNT лигандами на более ранних стадиях. У эмбрионов мыши WNT7B специфически экспрессируется в остеогенной надхрящнице; делеция Wnt7b в предшественниках скелетных остеобластов вызывает задержку оссификации, но фенотипические отклонения умеренные и в основном исчезают после рождения, скорее всего, обусловленные избытком лиганда WNT [18], [25]. Кроме того, WNT5A экспрессируется как в надхрящнице, так и хряще у эмбрионов мыши [18], [38]. Показано, что WNT5A, экспрессируемый клетками клона остеобластов, способствует генезу как остеобластов, так и остеокластов, но дефицит WNT5A вызывает общее снижение костной массы у постнатальных мышей [26], [39].
В данном исследовании мы изучали способность WNT7B в противовес WNT5A в регуляции костной массы
in vivo. Мы продемонстрировали, что WNT7B драматически усиливает образование кости. Механистические исследования идентифицировали mTORC1 в качестве важного медиатора для костной анаболической функции WNT7B.
Discussion
Мы предоставили доказательства, что WNT7B является мощным костным анаболическим белком как во время эмбриогенеза, так и у постнатальной жизни мышей. В частности, WNT7B заметно усиливает как количество, так и функцию остеобластов. Далее мы идентифицировали mTORC1 в качестве важного медиатора WNT-обеспечиваемого анаболизма костей. На механистическом уровне WNT белки активируют mTORC1 посредством передачи сигналов PI3K-AKT.
Конечно, mTORC1, по-видимому, обеспечивает увеличение активности остеобластов, но не их количество в ответ на WNT7B. В наших генетических экспериментах, индуцибельная делеция Raptor не устраняет полностью S6 фосфорилирование, вызываемое помощью WNT7B в экстрактах костных белков. Следовательно, наблюдаемая степень корреляции в активности остеобластов может быть недооценена в отношении вклада mTORC1 в функцию остеобластов, индуцированную WNT7B. Из-за той же самой причины мы не можем исключить возможность, что оставшаяся часть WNT7B-индуцированной активности mTORC1 вызывает увеличение количества остеобластов у компаундных мутантов. Альтернативно, гиперактивация mTORC2 может быть фактором, вносящим вклад, т.к. мы наблюдали передачи сигналов mTORC2 в костях у Osx-Wnt7b мышей (data not shown). Более того, поскольку WNT7B также активирует PKCδ посредством передачи сигналов phosphoinositide [25], то активация PKCδ может вносить вклад в индуцированный с помощью WNT7B остеобластогенез. С др. стороны, наши данные не подтвердили, что β-catenin является лавным эффектором функции WNT7B в данных условиях. Во-первых, WNT7B не активирует передачи сигналов β-catenin в ST2 клетках, хотя он индуцирует дифференцировку остеобластов. Во-вторых, исследования in vivo с аллелем TOPGAL оказались неспособны определить усиление передачи сигналов β-catenin костях ColI-Wnt7b или Osx-Wnt7b эмбрионов. Наконец, фенотип костей у мышей Osx-Wnt7b отличается от такового у мышей со стабилизированной формой экспрессии β-catenin, экспрессируемого в клетках клона Osx, который характеризуется преждевременной минерализацией и супрессией экспрессии OC [21]. В целом понимание механизмов, лежащих в основе мощной костной анаболической функции WNT7B, может предоставить молекулярные мишени для разработки новых анаболических лекарств.
Помимо сильного костного анаболического эффекта WNT7B также, по-видимому, супрессирует количество остеокластов в области костной поверхности. Эта находка верна у мышей, начинающих экспрессировать WNT7B у эмбрионов (ColI-Wnt7b) и у мышей, экспрессирующих его только постнатально (Runx2-Wnt7b with Dox). В любой модели тотальная активность резорбции кости, измеряемая по сывороточному CTX-1, была или повышенной или не менялась в зависимости от возраста, при сравнении с контрольным выводком. Т.о., мы пришли к выводу, что эффект WNT7B на остеобласты не приводит к фенотипу с высокой костной массой. Тем не менее в будущем было бы интересно установить механизм супрессии количества остеокластов с помощью WNT7B.
Мы показали, что ингибирование GSK3 супрессирует базовый уровень фосфорилирования S6, но не его индукцию с помощью WNT3A. Это наблюдение противоречит предыдущим сообщениям, что ингибирование GSK3 обусловливает активацию mTORC1 с помощью WNT3A [27], но это согласуется с др. исследованием, идентифицировавшим GSK3 в качестве активатора S6K1 посредством прямого фосфорилирования [41]. Основой расхождения между этими исследованиями пока неизвестны. Тем не менее наши результаты подтверждают альтернативную модель, что WNT белки активируют mTORC1 посредством передачи сигналов PI3K-AKTg.
Предыдущие исследования показали участие др. WNT белков в контроле костной массы. Wnt10b -/- мыши обнаруживают инициальное увеличение костной массы в возрасте 1 мес., но с возрастом обнаруживается потеря кости [35], [37]. Трансгенные мыши, избыточно экспрессирующие WNT10B или с FABP4 или OC промотора обнаруживают повышенную костную массу у постнатальных мышей [35], [36]. Однако WNT10B-индуцированный костный фенотип WNT5A был описан, как редуцирующий костную массу у постнатальных мышей и WNT5A, как было установлено, стимулирует дифференцировку остеобластов путем супрессии PPARG-обусловленного адипогенеза и генез остеокластов посредством усиления активности RANK в предшественниках макрофагов [26], [39]. Однако избыточная экспрессия WNT5A в нашем исследовании не вызывала очевидного эффекта на костную массу. Возможно небольшой размер выборки недостаточен для выявления минорных изменений. Более того, WNT5A может оказывать эффекты на формирование и резорбцию кости, которые компенсируют один другого в модели избыточной экспрессии. Тем не менее данное исследование идентифицировало WNT7B как потенциальный анаболический WNT лиганд у мыши.
Было бы интересно отметить, что несмотря на мощную костную анаболическую активность, WNT7B не увеличивает с очевидностью толщину длинных костей. Это наблюдение в какой-то степени неожиданно, поскольку SOST-дефицитные или мутанты LRP5, вызывающие увеличение костной массы, обнаруживают четкое усиление надкостничного роста [15], [42]. Возможно, что SOST и LRP5 регулируют эндогенные WNT лиганды, которые отличаются сигнальными свойствами от WNT7B, или что уровень WNT7B, экспрессируемый с локуса Rosa26 в нашей модели не достигает необходимого порога в компартменте надкостницы. С др. стороны, мы не можем исключить возможности, что мутации в SOST или LRP5 могут изменять активность др. не-WNT сигналов, отвественных за рост надкостницы.