Спонтанно возникший мутант Lp был использован для изучения роли Vangl2 в развитии сердца [26], [27], [30]. Однако, значительные морфологические дефекты, характеризующие Lp/Lp, включая краниорахишизис и полную ротацию оси, ограничивает использование для выяснения роли Vangl2 во время морфогенеза сердца. Мы первоначально предполагали, что дефекты петлеобразования сердца, наблюдаемые у Lp/Lp могут быть вторичными по отношению к тяжелым дефектами закрытия нервной трубки и осевого поворота [26]. В самом деле, аномалии аортальной дуги, которые сильно выражены у Lp/Lp и Vangl2flox/flox; Sox2-Cre и Vangl2flox/flox; PGK-Cre мутантов, описанные здесь, могут быть вторичными по отношению к этим крупным аномалиям в форме тела, т.к. только они наблюдаются в присутствии краниорахишизиса. Напротив, мы показали, что аномалии тракта оттока являются первичными дефектами. Сложность, добавляемая присутствием др. эмбриональных дефектов, вместе с вкладом ряда разных популяций клеток в развивающийся тракт оттока, делает анализ глобальной потери Vangl2 неадекватным с целью установления её точной роли в развитии сердца. Здесь мы описали генерацию условных целенаправленных делеций Vangl2, которые будучи экспрессируемые глобально воспроизводят аномалии тракта оттока, наблюдаемые у Lp/Lp. Используя эту модель, мы показали, что экспрессия Vangl2 в Isl1-Cre экспрессирующем SHF существенна для нормального развития тракта оттока.

Наши данные подтвердили, что экспрессия Vangl2 в недифференцированной популяции SHF (экспрессирующей Isl1-Cre) из дистальной части тракта оттока, которая является критической для развития тракта оттока, поскольку делеция в Mlc2v-Cre-экспрессирующем миокарде тракта оттока и в Tie2-Cre-экспрессирующем эндотелии приводит к развитию нормального тракта оттока. Однако, находка укорочения тракта оттока со ст. E9.5, аномалий перемещения мышечных клеток из стенки тракта оттока в подушки (процесс миокардиализации) были также найдены у Vangl2flox/flox; Isl1-Cre эмбрионов на ст. E13.5, как и у Lp/Lp эмбрионов [30], демонстрируя, что миокард тракта оттока не восстанавливается от более ранних аномалий. В стенке дистальной части оттока переход клеток от недифференцированной формы (экспрессирующей белок Isl1) к дифференцированному миокарду (с последующей потерей Isl1 и усилением активности маркеров поперечнополосатых мышц, включая myosin heavy chain и cardiac troponin I). Интересно, что Vangl2 теряется из клеточной мембраны и локализуется в цитозоле на проксимальной границе переходной зоны, где клетки дифференцируются в миокард. Т.о., это переключение с мембранного на цитоплазматический Vangl2, вместе с потерей ядерного Isl1, определяет проксимальную границу переходной зоны. Имеются убедительные доказательства, подтверждающие, что Vangl2 активен, когда он ассоциирован с мембраной, т.к. мутации, блокируют функцию ассоциации с мембраной [33]. T. о., мы подтвердили, локализованный в мембране Vangl2 в переходной зоне, которая наделяет клетки планарной полярностью, поддерживая их эпителиальный фенотип. Если ассоциация с мембраной теряется, то клетки теряют свое типичное эпителиальное проявление и дифференцируются. Хотя Vangl1, близкий гомолог Vangl2 экспрессируется у ранних эмбрионов, домен его экспрессии более ограничен, чем домен Vangl2 [37], [38]. Мутанты Vangl1 не дают мутантного фенотипа в тракт е оттока [37]. Т.о., очевидно, что Vangl2 является принципиальным Vangl геном, действующим в раннем сердце. Мы не обнаруживали фенотипических отклонений в тракте оттока, когда мы взаимно скрещивали Vangl2flox мышей с Nkx2.5-Cre линией. Однако, анализ домена экспрессии Nkx2.5-Cre показал, что хотя он экспрессируется достаточно рано, чтобы делетировать Vangl2 в предшественниках кардиомиоцитов [31], его экспрессия была пятнами в дистальной части тракта оттока, а экспрессия Vangl2 сохранялась в этих клетках. Т.о., эти данные согласуются с идеей, что Vangl2 необходим в недифференцированных клетках скорее, чем в дифференцированных производных SHF.

Во время удлинения тракта оттока у эмбрионов кур клетки перемещаются из пролиферативного пула внутри дорсальной части перикардиальной стенки в дистальную часть тракта оттока не как индивидуальные клетки, а как единый слой [6]. Это сходно с перемещением эпителиальных слоёв в др. системах органов [39], [40]. Хотя этот механизм добавления клеток к тракту оттока не был подтверждён на млекопитающих, очевидно, что аналогичный процесс имеет место. Как только они достигают региона дистальной части тракта оттока, то происходящие из SHF клетки затем приобретают более эпителиальный фенотип (т.e. сильная поляризованная экспрессия E-cadherin), чем они обладали будучи в мезотелии дорсальной части стенки перикарда. Внутри этой вновь эпителизированной ткани, передача сигналов Vangl2 регулирует апикально-базальную поляризованную экспрессию ряда маркеров стратифицированной эпителиальной ткани, включая Scrib и PKCζ [41], [42]. Мы обнаружили заметно аномальное распределение этих маркеров в стенке дистальной части тракта оттока Vangl2flox/flox; Isl1-Cre эмбрионов с редуцированным апикальным доменом и расширенным базо-латеральным доменом. Более того, анализ положения MTOCs в клетках дистальной части тракта оттока подтвердил, что планарная поляризация клеток также нарушена в этой ткани. Т.о., и апикально-базальная и планарная клеточная полярность, по-видимому, регулируются с помощью Vangl2 в раннем тракте оттока (Fig. 8 K, L).

Мы полагаем, что поляризация клеток в дистальной части тракта оттока и последующее приобретение эпителиального фенотипа связаны с элонгацией сосудов тракта оттока. В частности, мы полагаем, что организация клеток в псевдо-стратифицированный эпителий гарантирует, что тракт оттока будет удлиняться скорее, чем утолщаться. Эпителии характеризуются клетками с сильными боковыми прикреплениями (включая содержащие E-cadherin слипчивые соединения), которые удерживают клетки в слое. Наши данные подтверждают, что Vangl2 играет ключевую роль в регуляции планарной полярности в дистальной части тракта оттока, так что клетки оказываются одинаково ориентированными в плоскости эпителия. Когда Vangl2 теряется в таких клетках стенки дистальной части тракта оттока, то клетки ротируют по отношению к своим соседям, приводя к неправильному расположению соединительных комплексов и нарушению типичного эпителиального фенотипа ткани (see Fig. 8 K-M for simplified cartoon). Наше наблюдение, что Vangl2 также, по-видимому, регулирует апикально-базальное расположение маркеров, может добавлять к этому фенотипическому отклонению и дальнейшее неправильное расположение клеточных соединений. Т.о., Vangl2, по-видимому, важен для формирования и поддержания слое-подобной структуры клеток, которая необходима для формирования эпителиальной трубки. Утолщенным, укороченным тракт оттока выглядит в отсутствие Vangl2, напоминая в некоторых случаях следствия нарушения передачи сигналов PCP при гаструляции у эмбрионов позвоночных, когда движения конвергенции и вытягивания сужают и удлиняют развивающиеся эмбрионы (reviewed in [18]). Оба процесса, скорее всего, участвуют в ремоделировании соединений [40], однако сходство финального фенотипа может быть обманчивым, поскольку клетки SHF добавляются к дистальному концу удлиняющегося тракта оттока, тогда как конвергенция и удлинение во время гаструляции происходят прирожденно в клетках с фиксированными полюсами. В самом деле, описанный нами процесс не выглядит непосредственно аналогичным с любыми др. системами органов млекопитающих. Однако имеются сходства с описанными ролями генов PCP в удлинении трахейных трубок у Drosophila [43] и Vang1 (единственный у червей vang/strabismusgene) специфически при формировании кишечной трубки C.elegans [44]. В обоих случаях нарушения передачи сигналов PCP приводит к дезорганизации поляризованных маркеров и межклеточных взаимоотношений и к укорочению эпителиальной трубки. Во время раннего развития тракта оттока недифференцированные клетки SHF, экспрессирующие Isl1, перемещаются из мезотелия дорсальной части стенки перикарда в тракт оттока перед дифференцировкой в кардиомиоциты. Этот процесс происходит преждевременно у Vangl2flox/flox; Is1-Cre мутантов. Т.о., приобретение организованного эпителиального фенотипа может быть важным как физически для создания длины трубчатой структуры дистальной части тракта оттока, так и для предупреждения преждевременной дифференцировки клеток. Осуществляется ли последний вклад непосредственно в фенотипическое отклонение, остается неизвестным. Интересно, что Wnt5a, активатор передачи сигналов PCP, регулируется с помощью Tbx1 [45], одного из ключевых транскрипционных факторов, участвующих в поддержании клеток SHF в пролиферативном, недифференцированным состоянии [10]. Т.о., Vangl2 может действовать с такими же др. транскрипционными факторами, чтобы регулировать действие клеток SHF в удлиняющемся тракте оттока.

Прослеживается связь между укороченным трактом оттока и двойным выходом из правого желудочка [46], [47]. Осуществляемое, регулируемое добавление клеток из SHF является критическим для удлинения сосудов, процесса, который нуждается в позиционировании проксимальных регионов сосудов так, чтобы они могут выстраиваться в соответствии с камерами желудочков. В отсутствие Vangl2, тракт оттока утолщается скорее, чем удлиняется. Такой укороченный, утолщенный тракт оттока неспособен выравниваться правильно с соотв. камерами желудочков, приводя в результате к двойному отверстию из правого желудочка и дефектам перегородки между желудочками (Fig. 8M). Вопрос, может ли этот механизм объяснить дефекты совпадения, такие как двойной выход из правого желудочка, у человека, пока исследуется.

Нарушения Vangl2, или по всему телу или в клоне SHF приводят к двойному выходу из правого желудочка и дефектами межжелудочковой перегородки. Мы не наблюдали аномалий, когда Vangl2 был делетирован в NCC, несмотря на то, что передача сигналов PCP, как было установлено, играет критическую роль в миграции NCC у лягушек и рыбок данио [17]. В самом деле недавние исследования показали, что передача сигналов Vangl несущественна для миграции NCC у мыши [38], это подтверждает, что миграция NCC регулируется по-другому у млекопитающих, чем у лягушек, рыб и птиц. Сходные аномалии тракта оттока мы наблюдали, когда делетировали Vangl2 специфически в клоне SHF, с аномалиями мышей, несущих мутации в др. генах PCP, включая Dvl 1-3, Wnt5a, Wnt11 и Fz1/Fz2 [48], [49], [50], [51], [52]. Скорее всего, существуют множественные причины двойного выхода из правого желудочка, строгие взаимоотношения между этой аномалией и мутациями генов пути PCP подтверждают, что передача сигналов PCP может быть фундаментальной для нормального подразделения перегородкой и расположения магистральных артерий по отношению к камерам желудочков. Также в конечном счет возникновение двойного выхода из правого желудочка наблюдается у мутантов Wnt11 ^-/-, обладающих аномалиями ранних стадий развития сердца. Сюда входят нарушения длины тракта оттока и нарушения цитоархитектуры кардиомиоцитов тракта оттока [51]. Передача сигналов TGFβ2, как было установлено, действует ниже Wnt11 в миокарде тракта оттока, а Wnt11 нулевые и Tgfβ2 нулевые эмбрионы обнаруживают аномалии апикально-базальных маркеров в стенке тракта оттока на ст. E11.5 [51]. Хотя более ранние стадии не были проанализированы и поэтому прямого сравнения с нашим исследованием невозможно, вероятно, что TGFβ2, действует ниже Wnt11 и Vangl2, и может участвовать в организации дистальной части тракта оттока и тем самым регулировать удлинение тракта оттока. Недавно Sinha et al, [53] изучали аномалии морфогенеза тракта оттока у мутантов Dvl2. Они пришли к заключению, что дефекты в результате этих аномалий касаются включения предшественников SHF из спланхнической мезодермы в дорсальную часть стенки перикарда перед перемещением в сосуды тракта оттока. Vangl2 экспрессируется в дорсальной части стенки перикарда, однако несмотря на тщательное исследование мы не обнаружили аномалий в этой области. Sinha et al (2012; [53]) не описывают фенотипических отклонений клеток в дистальной части тракта оттока у мутантов Dvl2 или исследованных маркеров поляризации клеток в этих эмбрионах. Т.о., остается неясным, является ли описанный нами механизм также компонентом мутантного фенотипа Dvl2. Однако, экспрессия Wnt11 ограничивается миокардом тракта оттока [51], подтверждая, что он может быть ключевым фактором в активации PCP, а значит и передачи сигналов Vangl2 в дистальной части тракта оттока. Т.о., очевидно, что передача сигналов PCP посредством Vangl2 и Wnt11 (и/или Wnt5a), играет важную роль в элонгации дистальной части тракта оттока, облегчая морфогенез сердца.