PROGRESSIVE ANTERIOR TO POSTERIOR BODY DEVELOPMENT IN VERTEBRATES

Позвоночные как большинство особей с билатеральной симметрией развиваются прогрессивно спереди кзади. Цефалические структуры и ростральная часть туловища развиваются первыми из передней части эпибласта и мезодермы и энтодермы, которая возникает рано из первичной полоски. На более поздний стадии первичной полоски (день эмбриогенеза 7.2, E7.2) у мышей и на стадии дефинитивной полоски у эмбрионов кур (ст. 4, в соотв. Hamburger and Hamilton, HH), область полоски продолжает вносить вклад в производные для удлиняющихся туловища и хвоста (Schoenwolf, 1977; Kinder et al.,1999). Этот процесс соответствует тому, что обозначается как формирование первичного тела. К моменту закрытия заднего нейропора у мышей (около E10.0, после возникновения 30 пар сомитов) и у эмбрионов кур (около 14 HH и 22 пар сомитов), ткани продолжают происходить из хвостовой почки скорее, чем из первичной полоски, которая оказывается интернализованной. Область передней части полоски и узелка существует как chordo-neural hinge (CNH), а остальная часть полоски как ventral ectodermal ridge (VER). Генерация ткани для удлиняющейся кзади пояснично-крестцовой области и хвоста затем происходит из CNH. Эта фаза была названа формированием вторичного тела. Некоторые морфогенетические перемещения во время этого процесса и экспрессия генов ассоциируют с этой фазой удлинения тела, подтверждая, что осевое удлинение из хвостовой почки является продолжением более раннего процесса элонгации туловища (Gont et al., 1993; Benazeraf and Pourquie, 2013). В соотв. с этой идеей, мутации, затрагивающие процесс осевого удлинения,как было установлено, затрагивают как формирование первичного, так и вторичного тела (see below). Однако, удлинение вторичного тела отличается от первичной фазы тем фактом, что лежащие в основе морфологические механизмы в меньшей степени используют конвергентное удлинение (convergence extension) и ингрессию, из предшественников, располагающихся в CNH нише. Напр., удлинение нервной трубки возникает за счет кавитации (образовании полости) скорее, чем за счет боковых возвышений и закрытия нервной пластинки.

AXIAL PROGENITORS IN THE EMBRYONIC GROWTH ZONE

Мечение клеток в узелке и первичной полоске эмбрионов кур уже давно подтвердило существование стволовых клеток в этих местах (Selleck and Stern, 1991,1992). Последующие эксперименты, отслеживающие вклад одиночных клеток в ранних сомитах эмбрионов кур c помощью time-lapse изображений подтвердили, что предшественники, похожие на стволовые клетки, остаются в задней части эпибласта, тогда как их производные обнаруживают себя более кпереди в удлиняющейся нейральной оси (Mathis et al.,2001). У мышей клональный анализ одиночных клеток эпибласта у гаструлирующих эмбрионов выявил случаи эпибластных клеток в передней части первичной полоски, которая вносит вклад в производные вдоль оси, включая некоторые из тех, что остаются области узелка после периода однодневного культивирования (Lawson et al., 1991; Forlani et al.,2003). Некоторые из этих предшественников непосредственно позади узелка, как было установлено, дают производные как нейроэктодермы, так и мезодермы (Forlani et al., 2003). Долговременные исследования c помощью анализа ретроспективных клонов показали, что некоторые осевые предшественники дают производных в разные ткани, распространяющиеся на большие ростро-каудальные расстояния и удлиняющиеся назад в область узелка (Nicolas et al.,1996; Mathis and Nicolas, 2000). Достигнут существенный прогресс в характеризации генерации осевых тканей из первичной полоски и хвостовой почки. Эксперименты по серийным трансплантациям в ранние сомиты эмбрионов мышей и кур продемонстрировали, что предшественники, подобные стволовым клеткам, располагаются в stem зоне, расположенной в небольшом регионе между узелком и передней частью первичной полоски (node-streak border, NSB; Fig. 1) и в последствие в CNH хвостового зачатка (Cambray and Wilson,2002, 2007; McGrew et al., 2008). Эти клетки вносят вклад в производные в течение длительных периодов эмбриогенеза, на всех уровнях удлиняющегося туловища в нервную трубку и мезодерму. Гетеротопические трансплантации подтверждают, что свойствами эти осевые предшественники, похожие на стволовые клетки, были наделены c помощью расположения в эмбрионе скорее, чем унаследованы клетками (Cambray and Wilson, 2007; McGrew et al., 2008). Некоторые клетки caudo-lateral epiblast (CLE, Fig. 1) в самом деле, д. вносить вклад в популяцию осевых предшественников, подобных стволовым клеткам, после того как они задвинуты в NSB c помощью морфогенетических гаструляционных движений (Cambray and Wilson,2007). Недавний ретроспективный клональный анализ у мышей выявил, что только предшественники, генерируемые популяциями клональных клеток, колонизирующие большинство уровней оси, включая стволовую зону и CNH, являются бипотентными предшественниками для мезодермы и нейроэктодермы, которые располагаются в задней части эмбриона (Tzouanacou et al., 2009). Кроме того, помимо вопроса о догме, связанной с порядком происхождения трех зародышевых листков во время гаструляции, данное исследование продемонстрировало, что способ генерации производных мезодермы и нейральных структур из бипотентных предшественников остается тем же самым вдоль всего туловища. Эти данные предоставляют солидный аргумент в пользу развития хвостовой почки как продолжения процесса гаструляции. Несмотря на это, некоторые подклассы производных клонов от одиночных нейро-мезодермальных предшественников могут быть различены, в зависимости от изменений в композиции пула осевых предшественников, активного во время развития от туловища к хвосту (Tzouanacou et al., 2009). Большинство клонов вносят вклад в производные региона CNH, где располагаются предшественники, но передняя граница вклада варьирует. Количество клонов с передней границей в позиции их производных в регионе туловища было выше, чем их количество на уровне головы и хвоста. С этой точки зрения увеличение количества нейро-мезодермальных предшественников между гаструляцией (когда закладываются голова и шея) и поздними стадиями (стадия ранних сомитов, когда генерируется туловище) (Tzouanacou et al., 2009). Это также указывает на уменьшение пула предшественников на стадии хвостовой почки, когда формируется хвост. Подклассы клонов, происходящие из одиночных нейро-мезодермальных предшественников, по-видимому, хорошо соответствуют разным анатомическим регионам эмбриона мыши. Эти данные открывают возможность, что состав популяции нейро-мезодермальных предшественников изменяется со временем и также в зависимости от осевого уровня распространения ткани. Перестройка пула осевых стволовых клеток может соответствовать изменениям в активности генов, важных для модуляции этих популяций. Гены кандидаты на роль модуляции являются генами, мутации которых нарушают осевое удлинение зависимым от дозы способом. Пул предшественников, по-видимому, истощается в хвостовой почке к концу удлинения оси (Tzouanacou et al., 2009). Figure 1.

Некоторые аспекты удлинения осевых тканей из зоны предшественников вусё же выяснены. Одним из оставшихся вопросов является то, что не все ткани да данном осевом уровне происходят от резервуара стволовых клеток, расположенного в передней части полоски и CLE, позднее CNH в хвостовой почке. Tzouanacou с колл. (Tzouanacou et al., 2009) продемонстрировали, что этот способ происхождения используется частично параксиальной мезодермой и нервной трубкой. Относительно параксиальной мезодермы, предыдущие эксперименты показали , что только медиальные части сомитов возникают c помощью стволовых клеток (Selleck and Stern,1991; Eloy-Trinquet and Nicolas, 2002; Iimura et al., 2007). Клетки, которые д. вносить вклад в латеральную часть сомита, возникают из более каудальной части первичной полоски и фланкирующего её эпибласта и, как полагают, оказываются "организованными" впоследствии в соответствии с их медиальными сомитными аналогами, когда сомиты формируются (Freitas et al., 2001; Wilson et al., 2009). Нет доказательств подобного стволовым клеткам способа генерации мезодермы латеральной пластинки. Гомотопические трансплантации меченных субрегионов в и вдоль первичной полоски эмбрионов на ст. ранних сомитов и, впоследствии культивируемых в течение двух дней (Cambray and Wilson, 2007), подтвердили происхождение латеральной пластинки мезодермы на уровнях задней части полоски (Tam and Beddington, 1987; Kinder et al., 1999). У эмбрионов, которым были трансплантированы клетки из задних регионов полоски, не содержащей предшественников, покидали первичную полоску. Эти латеральная пластинка мезодермы д., поэтому возникать из задней части первичной полоски из полностью проникшей проксимальной части эпибласта. Энтодерма также следует своему собственному способу элонгации. Только ранняя и наиболее передняя дефинитивная энтодерма возникает из региона узелка (Lawson et al., 1991), тогда как энтодерма туловища расширяется от этой ранней энтодермы без участия предшественников в задней зоне роста. Более того, продемонстрирован вклад в виде интеркаляции первичной энтодермы в эпителиальную энтодерму кишки (Kwon et al., 2008). Процесс экспансии латеральной пластинки мезодермы и энтодермы, т.о., отличается от такового для происходящей из стволовых клеток медиальной мезодремы и нейроэктодермы. Возникновение всех этих тканей, тем не менее, следует, по крайней мере, некоторым общим правилам, поскольку все они затрагиваются мутациями, вызывающими арест задней осевой элонгации (to be discussed in the next section).

Итак, по крайней мере частично, параксиальная мезодерма и нейроэктодерма туловища и хвоста генерируется из популяции бипотентных предшественников, располагающихся на NSB внутри задней ростовой зоны, при наличии некоторого вклада со стороны CLE (Fig. 1). Точная популяция и физическая степень этой зоны предшественников пока не определена и способ возникновения латеральной мезодермы туловища и дефинитивной энтодермы, нуждается в лучшем понимании.

TRANSCRIPTION FACTORS AND SIGNALS MODULATING THE AXIAL STEM CELL NICHE

Давно описаны спонтанные и индуцированные мутации (T Brachyury, T Bra, Dobrovolskaja-Zavadskaja, 1927; Danforth Short Tail, Sd, Danforth, 1930; Dunn et al., 1940), которые вызывают заднее укорочение у эмбрионов мышей. Генетическое кодирование T-box транскрипционного фактора T Bra было установлено уже давно и был клонирован ген в конце 1980-х (Herrmann et al., 1990). Генетическое событие, вызывающее дисгенез задних эмбриональных тканей у Sd мутантов было охарактеризовано лишь недавно и было показано, что событие инсерции ретротранспозона ведет к подавлению активности T Bra (Lugani et al., 2013; Vlangos et al.,2013). Обширное количество информации было получено при помощи этих процессов и экспрессии генов, затрагиваемых геном T Bra у эмбрионов мышей (Beddington et al., 1992; Wilson and Beddington, 1997). T Bra экспрессируется в и вдоль всей первичной полоски и в хорде (Fig. 1). T Bra нулевые клетки эпибласта обнаруживают нарушение миграции из первичной полоски во время гаструляции и их скопление нарушает процесс осевой элонгации. Дефект зависим от дозы гена T (Wilson and Beddington, 1997). Хотя T Bra является самым ранним признаком формирования мезодермы у эмбрионов, T Bra нулевые мутанты генерируют переднюю часть мезодермы и формируют первые 6 сомитов. Это место дихотомии между генерацией ткани на переднем и заднем уровнях. Др. экспериментальные исследования прояснили, что передача сигналов Wnt участвует выше T Bra, в контроле как инициации транскрипции гена в полоске эпибласта (Rivera-Perez and Magnuson, 2005; Tortelote et al., 2013) , так и в поддержании его экспрессии (Yamaguchi et al., 1999; Galceran et al., 2001). Прорыв был достигнут в исследованиях функции T Bra (вместе со вторым T Bra геном) у рыбок данио. Действие T Bra на элонгацию оси у эмбрионов, как было установлено, обеспечивается с помощью передачи сигналов Wnt, посредством того, что канонический Wnt путь действует ниже T Bra с помощью процесса регуляции позитивной петлей обратной связи (Martin and Kimelman, 2008). T Bra, т.о., действует путем поддержания передачи сигналов Wnt в задней части растущего эмбриона. Соответственно экзогенные Wnt сигналы устраняют заднее укорочение у мутантов T Bra рыбок данио (Martin and Kimelman, 2008). Эти находки согласуются с тем фактом, что Wnt3a нулевые мутанты у мышей имеют сильное укорочение задней части, как T Bra нулевые эмбрионы (хотя некоторые фенотипические признаки отличаются между этими двумя мутантами). Спонтанная гипоморфная мутация Wnt3a (Vestigial tail, Vt), как полагают, нарушает регуляторный элемент гена Wnt3a (Greco et al., 1996), также вызывает заднее осевое укорочение, хотя и в меньшей степени, чем при полной инактивации гена. Задний осевой рост, следовательно, зависит от дозы или силы передачи сигналов Wnt в ростовой зоне эмбриона.

Путь Wnt является не единственным стимулирующим эффектором, контролирующим осевое удлинение. Мутации, инактивирующие Fgf receptor 1 (FgfR1) вызывают раннюю гибель и укорочение задних регионов эмбриона (Deng et al., 1994; Yamaguchi et al., 1994) помимо др. дефектов. Гипоморфные мутации в FgfR1 также приводят к заднему укорочению эмбрионов (Partanen et al., 1998). Активная транскрипция Fgf8 в задних эмбриональных тканях происходит исключительно в регионе первичной полоски. Работы на курах показали, что транскрипты сохраняют свое присутствие более кпереди благодаря своей стабильности (Dubrulle and Pourquie,2004). Во время продукции образующихся осевых тканей, удлиняющих ось, понижающийся градиент Fgf8 мРНК и белка генерируется в связи с этим, играя минимальную роль во фронте волны, специфицирующей границы новых сомитов в presomitic mesoderm (PSM) (Dubrulle and Pourquie, 2004). Fgf8 транскрипты и белки у эмбрионов кур и мышей присутствуют т. о., более широко, чем транскрибируется ген (Fig. 1). Инактивация с помощью условий Fgf4 и Fgf8, используя Cre рекомбиназу для управления активностью промоторов в первичной полоске также полностью устраняет осевое удлинение и ведет к подавлению активности T Bra (Wahl et al., 2007; Naiche et al., 2011; Boulet and Capecchi, 2012). Эксперименты с использованием химерных эмбрионов показали, что клетки эпибласта, полностью лишенные FgfR1, неспособны проникать через и вместо этого накапливаются в первичной полоске (Ciruna et al., 1997). Более поздняя инактивация Fgfs, по-видимому, нарушает поддержание популяций предшественников для осевого удлинения из хвостовой почки (Boulet and Capecchi, 2012). Передача сигналов Wnt и Fgf, как полагают, действует выше одна другой (Aulehla et al., 2003; Wahl et al., 2007), затрудняя построение сети с участием их вместе с T Bra в осевой элонгации.

Открытие важности поддержания ниши для предшественников стало критическим продвижением в понимании осевой элонгации. У мышей эта важность была подчеркнута экспериментами Wilson с коллегами. Они показали, что CLE, регион, обычно генерируемый мезодермой, для ограниченной части оси, приобретает свойства внесения вклада в мезодерму и нейроэктодерму в течение длительного периода времени, если трансплантируется в местоположение осевых стволовых клеток в наиболее переднюю часть первичной полоски (Cambray and Wilson, 2007). Отсутствие молекулярного определения ниши осевых стволовых клеток, очень специфической области на переднем конце первичной полоски, поддерживающей сохранение в течение длительного времени осевых предшественников (NSB и CNH), сильно озадачило. В отсутствие уникальных маркеров, попытки идентифицировать генетические признаки этой зоны привлекло внимание к важным игрокам, участвующих в осевом удлинении, таких как Wnt3a и Fgf8, и к генам ко-экспрессии, ассоциированным с ранней плюрипотентностью и с дифференцировкой ранней мезодермы, такими как Sox2 и T Bra, соотв., у мышей (Cambray and Wilson, 2007; Wilson et al., 2009) и эмбрионов кур (Delfino-Machin et al., 2005; Olivera-Martinez et al., 2012). Однако все эти игроки сами по себе экспрессируются более широко, чем территория, определяемая для ниши осевых стволовых клеток (Fig. 1). Активность раннего энхансера (N1) гена Sox2, по-видимому, перекрывается с передней частью первичной полоски и CLE, и, следовательно, не ограничена в течение длительного времени с зоной осевых предшественников (Takemoto et al., 2011) (Fig. 1). Идентификация долговременных осевых предшественников остается неуловимой, что не позволяет выделять самообновляющиеся осевые стволовые клетки и определять их свойства и транскриптом. Исследования совместной экспрессии Sox2 и T Bra иммуно-гистохимии оказались далеки от того, чтобы определить субпопуляции клеток, которые могли бы рассматриваться как мультипотентные осевые стволовые клетки, как это недавно было показано на хвостовой почке эмбрионов кур Olivera-Martinez et al. (2012).

CELL FATE DECISION AND GERM LAYER EXPANSION DURING AXIAL EXTENSION

Выбор клетками судьбы и соотв. дифференцировки является критическим для осевого роста, т.к. предшественники самообновляются. Доказательства для существования долговременных нейро-мезодермальных предшественников, располагающихся в передней части полоски и CLE (позднее CNH) (Cambray and Wilson, 2002, 2007; McGrew et al., 2008), и недавнее открытие тесного родства между нейроэктодермой и мезодермой среди производных этих осевых производных из этих осевых предшественников (Tzouanacou et al., 2009; Kondoh and Takemoto, 2012; Martin and Kimelman, 2012) стали ключом к пониманию контроля судеб клеток во время осевого удлинения. Все мутанты, упомянутые выше, которые нарушают заднюю осевую элонгацию, обладают эктопической нейроэктодермальной тканью в местах, где обычно мезодерма обрывается. T Bra мутантные эмбрионы (Yamaguchi et al., 1999), Wnt3a мутанты (Yoshikawa et al., 1997) и химерные эмбрионы, содержащие FgfR1 мутантные клетки эпибласта (Ciruna et al., 1997) , все они образуют эктопическую нервную трубку на её наиболее задних осевых уровнях. Молекулярный генетический механизм, лежащий в основе этого отклонения от нормального поведения, и взаимная зависимость между дифференцировкой мезодермы и нейроэктодермы были недавно разъяснены (Takemoto et al., 2011; Kondoh and Takemoto, 2012). Ранний N1 энхансер гена Sox2, активный в осевых стволовых клетках CLE, обычно отключается, как только клетки проникают через первичную полоску (Takemoto et al., 2011) под действием репрессирующего влияния Tbx6 в мезодерме. Если Tbx6 отсутствует, то N1 остается активным после проникновения через полоску и развиваются нервные структуры вместо PSM и сомитов. В этом случае, осевое удлинение невозможно из-за ареста продукции параксиальной мезодермы. Работа на рыбках данио показала, что каноническая передача сигналов Wnt необходима для мезодермальной дифференцировки бипотентных нейро-мезодермальных осевых предшественников (Martin and Kimelman, 2012). Инактивирование передачи сигналов Wnt в этих предшественниках заставляет производных формировать исключительно нервную ткань, а оставшийся эпибласт вместо этого подвергается epithelium-mesenchymal transition (EMT). Недавняя работа с использованием генетического анализа одиночных и двойных мутантов мышей позволила предположить упорядоченность, по крайней мере, некоторых из этих событий, связанных с осевым удлинением. Wnt3a, как было установлено, регулирует процесс ингрессии с помощью EMT, а Tbx6, как полагают, действует на иерархически более низком уровне в мезодерме после ингрессии (Nowotschin et al., 2012). Поддержание популяции осевых стволовых клеток с помощью передачи сигналов Wnt также является функциональным компонентом осевого роста, которые не отличается сам по себе фенотипически достаточно сильно от функции в EMT. Арест ингрессии эпибласта через первичную полоску и истощение пула осевых стволовых предшественников на уровне полоски, поэтому трудны для различения.

Итак, достигнут прогресс в понимании выбора клеточных судеб во время возникновения задних нейральных и мезодермальных тканей из осевых стволовых клеток. Стало ясно, что передача сигналов Wnt и Fgf модулирует потенциал дифференцировки в мезодерму и нейроэктодерму долговременных предшественников. Эта модуляция затрагивает баланс между продукцией ткани и дифференцировкой, регулирующей удлинение оси тела.

CDX AND HOX GENES IN AXIAL ELONGATION

Участие дополнительных транскрипционных факторов в управлении осевым удлинением посредством стимуляции передачи сигналов Wnt и Fgf недавно было дополнено. Cdx гены (ортологи Drosophila caudal) экспрессируются в задней ростовой зоне подобно Wnt3a и Fgf8 (Young et al.,2009) (Fig. 1). Мутации, инактивирующие три Cdx гена, нарушают осевое удлинение, при этом тяжесть зависит от комбинации инактивированных аллелей (Savory et al., 2009, 2011; Young et al., 2009; van de Ven et al., 2011; van Rooijen et al.,2012). Неспособность завершить элонгацию задних тканей у Cdxмутантов, по крайней мере, частично устраняется генетически избыточностью функции пути Wnt или за счет добавления экзогенного Fgf в культуру к мутантным эмбрионам (Young et al., 2009; van Rooijen et al., 2012). Область действия Cdx генов соответствует удлинению оси эмбрионального туловища и хвоста у мышей. Снова это подчеркивает различие, упомянутое выше, в генетическом механизме, лежащем в основе генерации задних осевых тканей относительно расположенных более кпереди цефалических и затылочных структур. Потеря все трех Cdx генов сопровождается расширением экспрессии T Bra после сгенерированных пяти сомитов (van Rooijen et al., 2012). Хотя Cdx- связывающие последовательности были идентифицированы в проксимальном вышестоящем регионе гена T Bra (Savory et al., 2009),T Bra обычно инициируется и продолжает экспрессироваться вплоть до ранних сомитных стадий у Cdx нулевых мутантов (van Rooijen et al., 2012). Эти данные могут указывать на то, что Cdx белки участвуют в поддержании транскрипции T Bra в задней ростовой зоне во время развития туловища, но они не существенны для инициальной экспрессии T гена в первичной полоске в начале гаструляции. Альтернативно, потеря Cdx может вызывать истощение клеток со свойствами предшественников в регионе полоски, вызывая исчезновение тканей, которые экспрессируют T Bra в первичной полоске. Экспрессия T Bra в хорде не затрагивается у Cdx нулевых эмбрионов (van Rooijen et al., 2012). Подобно мутациям в T Bra, нарушения передачи сигналов Wnt и Fgf, дефицит Cdx затрагивают выбор дифференцировки в нервную ткань или мезодерму, поскольку частично Cdx мутанты обнаруживают эктопическую нервную ткань (van de Ven et al., 2011). Данные, собранные относительно мутантов Cdx, следовательно, что Cdx белки влияют на активность самообновляющихся бипотентных осевых предшественников, участвуя в их поддержании и в выборе ими дифференцировки во время осевого роста. T Bra, Cdx, Wnt и Fgf все они необходимы зависимым от дозы способом, чтобы способствовать задней осевой элонгации. Продукты этих генов, т.о., обладают свойствами, ожидаемыми от регуляторов тонкой настройки пула нейро-мезодермальных осевых предшественников и их дифференцировки согласно Tzouanacou et al. (2009).

Остаются важные вопросы, нуждающиеся в ответах, чтобы понять точные молекулярные взаимодействия между Cdx транскрипционными факторами и ключевыми эффекторными Wnt и Fgf путями. Метод репортеров с фрагментами промотора Wnt3a в трансфицированных клетках в культуре подтвердили прямую роль Cdx в стимуляции транскрипции Wnt3a (Savory et al., 2009). Однако не было продемонстрировано специфического влияния мутаций Cdx на компоненты Wnt и Fgf путей, несмотря на некоторые анализы транскриптома в задних тканях мутантных Cdx эмбрионов (van de Ven et al., 2011).

Др. осложнение связано с функциональными взаимоотношениями между Cdx и их родственниками, генами Hox (Young et al., 2009). Hox гены также экспрессируются в задней ростовой зоне во время закладки туловища и хвоста (Young et al., 2009). Было показано, что Hox гены в середине кластеров (Hoxb8, напр.) могут устранять заднее укорочение у мутантов Cdx. Неизвестно в точности, активируют ли эти Hox гены и Cdx те же самые или перекрывающиеся серии нижестоящих генов мишеней. Поразителен в любом случае тот факт, что последние гены Hox кластеров оказывают противоположное влияние на осевой рост. Преждевременная активация этих Hox13 генов не допускается в задней ростовой зоне (Young et al., 2009). Hox13 гены осуществляют доминантно-негативный эффект на активность Cdx и на более ранних членов Hox кластеров, противодействуя их функции. Эта ситуация сравнима в принципе с действием временной колинеарности Hox генов (Duboule, 1994, 2007; Iimura and Pourquie, 2006; Tschopp et al., 2009). Hox13 гены являются кандидатами на роль обычной инициации торможения осевого удлинения в месте перехода от туловища к хвосту, предотвращая арест заднего роста. В генетической сети, осуществляющей контроль осевой элонгации, гены Hox/Cdx д. вносить представление о временных и позиционных характеристиках осевых тканей, которые д. генерироваться. Cdx и Hox гены д. интегрировать пространственные и временные компоненты, которые контролируют осевой рост.

Выяснение роли Cdx и Hox генов в сети взаимодействующих игроков, работающих во время осевого роста и тканевой дифференцировки ещё далеко от более полного молекулярно-генетического анализа доступных одиночных и множественных мутантных мышей. Необходимо более исчерпывающее картирование молекулярных взаимодействий между разными транскрипционными факторами и их геномными мишенями.

CONTROL OF BODY LENGTH DURING EVOLUTION

Эксперименты Cambray and Wilson (2002) показали, что долговременные нейро-мезодермальные предшественники начинают терять свою активность в месте перехода от туловища к хвосту после генетически запрограммированного снижения передачи сигналов Wnt и Fgf в "стареющей" нише предшественников у растущих эмбрионов мышей. Этот переход соответствует сокращению PSM, которое, как было установлено, у эмбрионов кур предвещает окончание сомитогенеза и добавления задних тканей (Gomez et al., 2008). Этот переход также коррелирует с вехами активации собранных в кластеры Hox генов: активацией Hox13 генов. Эти гены, как полагают, способствуют окончанию осевого роста (Young et al., 2009). Сравнительный анализ экспрессии Hox генов во время эмбриогенеза corn змеи и животных с более коротким телом показал, что два из четырех Hox13 паралогов не экспрессируются в ростовой зоне эмбрионов змей, тогда как все четыре экспрессируются в относительно более коротком тела чешуйчатых, ящерицы с хлыстовидным хвостом (Di-Poi et al., 2010). Эти находки подтвердили, что потеря экспрессии двух Hox13 генов может коррелировать с задержкой прекращения торможения осевого удлинения, что должно приводить к более продолжительному удлинению туловища. Присутствие высокого количества ДНК повторов внутри кластеров Hox у змей, которое не обнаруживается в кластерах у млекопитающих (Di-Poi et al., 2010), подтверждает, что ослабление четко контролируемой временной прогрессии экспрессии Hox генов играет роль в возникновении более длинного тела у позвоночных в ходе эволюции.

Роль родственных Hox генов Cdx в росте оси тела, по-видимому, эволюционно законсервирована. Потребность в caudal/Cdx для генерации осевых тканей кзади от головы было продемонстрировано не только у мышей, но и также у насекомых с коротким (большой мучной хрущак) и промежуточным (сверчок) зародышевым диском и у ракообразных Artemia (Copf et al., 2004; Shinmyo et al., 2005). Родоначальники этих филогенетически удаленных видов уже использовали Cdx транскрипционные факторы для конструкции своего туловища и задних структур. Это демонстрирует, что удлинение оси из задней ростовой зоны является основным способом элонгации оси у животных с билатеральной симметрией (Akam, 1989; Jacobs et al., 2005) и что Cdx/Wnt/Fgf это - составляющие для эволюционно законсервированного генетического набора инструментов для генерации туловища и хвоста (Copf et al., 2004; Shinmyo et al., 2005; Beermann and Schroder,2008; Beermann et al., 2011).

ROLE OF RETINOIDS IN THE WNT/FGF CONTROL OF AXIAL LENGTHENING

Маршруты передачи сигналов retinoic acid (RA) и компонентов её пути. Тонкая регуляция этого пути, как известно, важна для хорошо контролируемого осевого роста и делает возможным взаимодействие этого пути с каждым из упомянутых выше одиночных эффекторов. Гены, кодирующие транскрипционные факторы T Bra и Cdx, и передача сигналов Wnt и Fgf все они, как было установлено, затрагиваются недостатком или избытком биосинтеза RA (Abu-Abed et al., 2001; Sakai et al.,2001; Diez del Corral and Storey, 2004; Vermot et al., 2005; Ribes et al., 2009; Zhao and Duester, 2009). Передача сигналов RA у ранних эмбрионов пространственно ограничена с помощью RA-синезирующих и метаболизирующих ферментов, Raldh2 и Cyp26a1, соотв. RA-чувствительные домены высоко динамичны во время хода заднего развития от стадии первичной полоски и сомитогенеза до завершения формирования оси.

На ранних сомитных стадиях комплементарные домены биосинтеза и деградации RA генерируются в задней части эмбриона. Сомиты и передняя часть PSM экспрессирует Raldh2, который генерирует RA, которая затем диффундирует в покрывающую её нервную пластинку (Sirbu and Duester, 2006; Ribes et al., 2009). Эти активности источника и деградации создают градиент концентраций RA с максимумом в сомитах, постепенно убывая кзади до минимума в первичной полоске и в регионе стволовой зоны, где экспрессируется Cyp26a1. Распределение RA т.о., противоположно градиенту Fgf8, упомянутому ранее. Во время формирования туловища, становится очень чёткой дихотомия между зоной задних стволовых клеток, экспрессирующей Fgf, Wnt, T Bra, Cdx и Cyp26a1, и зоной дифференцировки с высокой биоактивностью RA. Клетки, покидающие заднюю зону предшественников подвергаются воздействию высоких уровней RA и низких Fgf8. Они затем вступают в дифференцировку в каудальную часть нервной пластинки или сегменты сомитов. RA очищается в нишах стволовых клеток c помощью Cyp26a1, экспрессия которого зависит от передачи сигналов Fgf (Wahl et al., 2007; Boulet and Capecchi, 2012) и от Cdx (Savory et al., 2009; Young et al., 2009; van Rooijen et al., 2012) и T Bra (Martin and Kimelman, 2010; Vidigal et al., 2010). Воздействие на эмбрионы сверхфизиологических уровней RA, воздействуя ими на мать, или вследствие деффектов деградации RA, вызывает тяжелые осевые укорочения (Kessel and Gruss, 1991; Shum et al., 1999; Abu-Abed et al., 2001; Sakai et al., 2001). Временное воздействие RA во время сомитогенеза ограничивает передачу сигналов Fgf и Wnt и экспрессию T Bra в зоне предшественников (Iulianella et al., 1999; Shum et al., 1999; Diez del Corral et al.,2003; Wilson et al., 2009). Соотв., Fgf противодействует передаче сигналов RA, по крайней мере, частично, путем репрессии экспрессии Raldh2 в регионе, где эти игроки перекрываются (Diez del Corral et al., 2003; Wahl et al., 2007; Olivera-Martinez et al., 2012). Т.о., большое количество экспериментальных доказательств показывает, что RA необходима для индукции нейральной дифференцировки из производных осевых предшественников и что удаление RA из ростовой зоны необходимо для поддержания генетической программы предшественников во время формирования туловища.

В месте перехода от туловища к хвосту (E10.0), передача сигналов Fgf и Wnt снижается, PSM уменьшается в объеме (Gomez et al., 2008), а RA-продуцирующий домен затем упирается в зону предшественников в хвостовой почке. Уровни Cyp26a1 снижаются кзади на этой ст. как у эмбрионов кур, так и мышей. Неожиданно, Raldh2, как было установлено, оказывается временно индуцированным в локальной области хвостовой почки (Tenin et al., 2010; Olivera-Martinez et al., 2012). RA в этом месте, как полагают, биологически активна у эмбрионов кур, т.к. это ведет к снижению экспрессии Fgf, Wnt и T Bra, апоптозу и завершению оси (Olivera-Martinez et al., 2012). В экспериментах по совместному культивированию, хвостовая почка эмбрионов кур, как было установлено, активирует RARE-lacZ в линии репортерных клеток, тогда как хвостовая почка мышей, по-видимому, не является эндогенным источником RA в том же самом испытании (Tenin et al., 2010). Возможно, что RA не играет роль в завершении формирования оси тела мышей. У Raldh2 мутантных эмбрионов, подвергнутых временному воздействию RA для преодоления ранней онтогенетической летальности, кзади расположенный Fgf8 подавляется, а осевая элонгация завершается нормально (Cunningham et al., 2011). Механизм завершения формирования оси, возможно, отличается у этих двух организмов. Пока неизвестно, как различия в механизме завершения образования оси возникли во время эволюции. Итак, эти данные снова подчеркивают дифференциальную регуляцию разных анатомических регионов оси тела.

CONCLUSIONS AND ADDITIONAL FUTURE PROSPECTS

Trunk and tail tissues in vertebrates stem from the embryonic posterior growth zone that harbors a niche for the maintenance of axial progenitors, some of which are self-renewing and bipotent for mesoderm and neurectoderm. The progenitor niche ages at mid-gestation, upon genetically programmed decrease of Wnt and Fgf signaling. These processes foreshadow the termination of axial growth. The aging process can be reversed, as the niche and its progenitors can be rejuvenated upon transplantation into the corresponding region of a younger embryo (Cambray and Wilson, 2002). The molecular genetic characterization of the long-term progenitor niche, within the region of overlap between the activity domains of the key effectors of axial growth, is an important remaining goal in future research. Given the fact that the effectors in the progenitor niche, Wnt and Fgf, are regulated by the transcription factors T Bra and Cdx/Hox in feed-back loop relationships (Martin and Kimelman, 2008; Young et al., 2009; van Rooijen et al., 2012), the transcriptional control of these transcription factors in the growth zone is a major steering component in axial growth. Understanding the regulation of these regulators might shed light on the upstream command of key events of posterior morphogenesis such as the emergence of the Fgf8 gradient that is crucial for posterior axial growth (Diez del Corral and Storey, 2004; Dubrulle and Pourquie, 2004; Naiche et al., 2011; Boulet and Capecchi, 2012). A pioneer study regarding the transcriptional regulation of the Fgf8 locus has just been published (Marinic et al., 2013) and promises to lead to unveiling regulatory events driving posterior embryonic growth. The establishment of the epistatic relationship between the players in the network driving axial extension, and the precise mapping of the productive binding events of the key transcription regulators at their genomic targets, will be essential to fully understand the genetic program underlying axial tissue growth and patterning.

A conclusion of the data reviewed above is that the rules governing axial elongation anterior to the trunk, within the trunk and at the termination level of the tail, follow different principles. The phenotype of T Bra and Cdx null mutants indicates that the corresponding gene products are needed for axial elongation posterior to the 5/6 most anterior somites. This suggests a scenario whereby early Wnt signaling (Wnt3) is enough to ensure extension of the anterior axial structures, whereas trunk and posterior elongation requires prolonged Wnt signaling (Wnt3a) maintained by T Bra and Cdx. Early lethality of the Wnt3mutants that fail to undergo gastrulation (Liu et al., 1999) precludes assessing the validity of this hypothesis. The same may hold true for Fgf signaling. EarlyFgf4 and Fgf8 may suffice for occipital tissue elongation but fall short of supporting more posterior trunk and tail growth when they are inactivated shortly thereafter by T Bra-driven Cre recombination (Naiche et al., 2011). Fgf and Wnt may, therefore, play a continued role in maintaining the progenitors for axial extension in the different windows of developmental time. Boosting of both pathways by Cdx and T Bra might mark the occipital/post-occipital transition. An unknown in this scenario is whether anterior tissues are laid down at all from a population of long-term neuro-mesodermal precursors.

Tissue morphogenesis in body regions at different axial levels has been shown earlier to obey distinct rules and to differentially depend on specific unravelled molecular genetic circuits. The oscillatory activity of genes inherent to the segmentation clock such as Lunatic fringe is differentially required for thoraco-lumbar and sacro-caudal body patterning of the presomitic mesoderm (Shifley et al., 2008; Stauber et al., 2009). Shifley and colleagues suggest that the process of primary versus secondary body formation may impact on the regulation of rostro-caudal patterning by the segmentation clock during the various stages of anteroposterior axis development. Not only the sclerotome, but also the myotome, seems to be differentially controlled during primary and secondary body formation: PDGF? receptor mutants were found to exhibit myotome defects in the 20 most rostral somites and to appear normal in the caudal somites (Soriano, 1997). Myogenesis has indeed been shown to be controlled by different strategies during ontogenesis of the different regions of body development. Trunk and head muscles are generated by paraxial mesoderm that is, respectively, segmented and unsegmented (at least not segmented in the same way as the trunk) into somites (reviewed by Sambasivan et al., 2011). Cranial and somitic myogenesis clearly depends on distinct genetic networks (Sambasivan et al., 2011). Comparison of these processes in different chordates suggests that the neck muscles appeared at a transition zone between the cranial and trunk mesoderm and ancestral vertebrates do not seem to have possessed neck muscles (Sambasivan et al., 2011). Strikingly the endoderm of the developing embryonic body has been recently shown also to differentially depend on well-defined signaling pathways. Wnt/?-catenin signaling is crucially important for the formation of definitive endoderm of the mid- and hindgut, whereas it is dispensable for foregut formation (Engert et al., 2013).

Another difference between the progenitors of the anterior-most, and trunk part of the axis concerns their sensitivity to RA. The early axial progenitor niche at primitive streak stages expresses Raldh2 (Vermot et al., 2005; Ribes et al.,2009) whereas the presence of RA in the growth zone during trunk elongation is detrimental to the progenitors (see above). The biphasic response of embryonic axial progenitors exhibiting initial compatibility of RA exposure with self-renewal, and later drifting towards differentiation in the presence of RA was reported to be observed as well in murine embryonic stem cells in culture (Stavridis et al., 2010). These dynamic changes in niche composition with developmental time make it even more difficult than appreciated so far to understand the essential properties of the axial progenitors and their niche.

Many aspects of tissue generation from the progenitor zone remain to be elucidated, as set out in the different sections above. In addition, the recent arousal of interest for additional parameters to be considered in the control of morphogenesis is expected to bring new light to the phenomenon of posterior embryonic growth. Besides the involvement of cell adhesion, known to be controlled during gastrulation, cell flow and fluidity change in posterior tissues during axial elongation have recently been evoked as potential regulators of axial growth in zebrafish embryos (Lawton et al., 2013). The authors found that the movement of cells from the dorso-medial zone, the remnant site of gastrulation, to the PSM depends on decreasing Fgf and Wnt signal concentrations. This migration within the tailbud is accompanied by a change in cell flow and tissue fluidity. Previous work in chicken embryos showed that high Fgf signaling promotes cell motility in the posterior PSM, that this motility decreases as cells approach the segmentation boundary in the low values of the Fgf gradient, and that disruption of the motility gradient results in slowing down of axial elongation (Benazeraf et al., 2010). The distribution of non-canonical Wnt and Fgf signaling, known to affect cell migration directly or indirectly, would generate a balanced equilibrium between the cell flow rate, the emergence of differentiated derivatives, and the coherence of collective cell migration within the tailbud. Disrupting the Wnt and Fgf gradients would introduce chaos in cell flux, aberrant elongation of the trunk, and in some cases inappropriate localization of tissue derivatives such as neurectoderm. It is evident that we are far from completely apprehending the complexity of signaling regulating the morphogenetic event of posterior axial growth. Future progress in these respects is anticipated. The design of non-intrusive methods to genetically label selected groups of cells in developing embryos in culture, and the development of live imaging technology during progressing embryogenesis in vivo should allow for precise clarification of the role of each effector in the process of axial elongation.

Region-specific regulation of posterior axial elongation during vertebrate embryogenesisRoel Neijts, Salvatore Simmini, Fabrizio Giuliani, Carina van Rooijen, Jacqueline Deschamps Developmental Dynamics 243:88-98, 2014.

Region-specific regulation of posterior axial elongation during vertebrate embryogenesis
Roel Neijts, Salvatore Simmini, Fabrizio Giuliani, Carina van Rooijen, Jacqueline Deschamps
Developmental Dynamics 243:88-98, 2014.