В данном исследовании мы показали функциональное перекрывание SFK и p38MAPK для облегчения процесса адгезии нёбных MEE в органной культуре нёба. Фармакологическое конкурентное ингибирование обеих киназ приводило к неспособности адгезии нёбных MEE.

E-cadherin и integrins играют важную роль в процессе адгезии нёбных половин (Frebourg et al., 2006, Martinez-Sanz et al., 2008, Munger and Sheppard, 2011). Чтобы исследовать участие SFK в E-cadherin- и integrin-обеспечиваемой адгезии нёбных половин, осуществляли двойное иммунофлюоресцентное мечение. Мы идентифицировали совместную локализацию активной SFK с E-cadherin и интегринами в межклеточных контактах, где слипались нёбные половинки, это указывает на потенциальную роль функции SFK вовремя ст. нёбной адгезии. Real time QPCR выявило паттерн экспрессии SFK во время нёбной адгезии и идентифицировало Fyn как наиболее высоко активируемый ген среди трех повсеместно экспрессирующихся членов семейства SFK. Fyn участвует в позитивной регуляции E-cadherin обеспечивающей межклеточную адгезию кератиноцитов in vitro (Calautti et al., 1998, Calautti et al., 2002). In vivo, однако, делеция Fyn и Src была необходима, чтобы вызывать нарушение адгезии клеток кератиноцитов (Calautti et al., 1998). Fyn, по-видимому, наиболее подходящая среди трех SFK, но может существовать функциональное перекрывание в регуляции нёбной адгезии. Каждый отличающийся член может по-разному активироваться в ходе культивирования органа в течение 48 ч, это может приводить к непрерывной экспрессии фосфорилированной формы. Последовательность активации SFK предоставляет доказательство умеренного уровня активации, происходящего даже перед адгезией противостоящих MEE, это может быть результатом инициальных изменений молекул клеточной адгезии, чтобы подготовить MEE к адгезии. Максимум активации SFK не наблюдался вплоть до наступления адгезии противостоящих MEE. В предыдущих публикациях выявлена парадоксальная роль SFK в становлении адгезии клеток. Клеточная адгезия нуждается в активной SFK, но избыточная активация SFK приводит к разрушению адгезии, как это наблюдается на трансформированных онкогеном или митогенами стимулированных клетках (McLachlan et al., 2007). Следовательно, дифференциальная интенсивность phospho-SFK в MEE перед и после нёбной адгезии может указывать на разные роли SFK на разных ст. Позитивные эффекты нёбной адгезии и негативные эффекты во время слияния нёбных половин, где была нарушена E-cadherin обеспечиваемая межклеточная адгезия в MEE, т.к. шов по срединной линии был разорван, и мезенхима оказывалась неразрывной между обеими нёбными половинами.

Мы осуществили органную культуры нёба с PP2, который является обычно используемым ингибитором SFK. PP2 блокирует нёбную адгезию во всех трех регионах срединной линии, подтверждая, что SFK позитивно регулирует процесс нёбной адгезии. Однако, мы неожиданно установили, что др. ингибитор SFK, SU6656, оказывает очень ограниченный эффект на нёбную адгезию, несмотря на то, что может ингибировать фосфорилирование SFK, также, как и PP2. Мы полагаем, что это обусловлено разными неспецифическими эффектами как PP2, так и SU6656 на др. киназы (See Fig. 4A). Киназы ингибирующиеся более чем на 50 % с помощью PP2, но не SU6656 - это p38MAPK, CK1, CSK, RIP2 и GAK (Bain et al., 2007). Т.к. p38MAPK стоит ниже интегринов (Aikawa et al., 2002, Han et al., 2002), то мы полагаем, что p38MAPK также участвует в процессе нёбной адгезии. Поэтому мы попытались осуществить органную культуры нёба с комбинациями ингибиторов, используя SU6656 в комбинации с ингибиторами p38MAPK, или SB203580 или BIRB0796. SB203580 ингибировал CK1, RIP2 и GAK более чем на 50%, но не BIRB0796 (Fig. 4A). Разная специфичность между ними позволяет нам исключить потребность в CK1, RIP2 и GAK для адгезии. Оба p38MAPK ингибитора, также, как и SU6656 не ингибируют CSK, как это делает PP2 (Bain et al., 2007, Fig. 4A), это указывает, что CSK не нужна для процесса нёбной адгезии. Использование по одиночке или SU6656, или p38MAPK ингибиторов не ингибирует нёбную адгезию, но конкурентное ингибирование SFK и p38MAPK вызывает неспособность к нёбной адгезии (Fig. 4A and B). Т.о., SFK и p38MAPK обнаруживают перекрывание для облегчения необходимых событий фосфорилирования, важных для нёбного слияния (Fig. 4C).

PP2 и комбинации SU6656 и p38MAPK ингибиторов обнаруживают разные эффекты на адгезию в заднем регионе. Все три региона срединной линии нёба после воздействия PP2 были отнесены к неадгезивной группе (Median: 0, 0.3 and 1.0 в переднем, среднем и заднем регионах, соотв. Однако задний регион нёба, обработанный как SU6656, так и p38MAPK ингибиторами, был отнесен к группе с частичной адгезией (Median: 1.5 и 2.1 в SU6656/30 µ M BIRB0796 и SU6656/SB203580 соотв.). В отличие от комбинации SU6656 и p38MAPK ингибиторов, PP2 обнаруживал дополнительное умеренное ингибирование в отношении PKA и S6K (Bain et al., 2007, Fig. 4A). Обе передачи сигналов интегринов стоят ниже (Lim et al., 2008, Malik and Parsons, 1996). PKA регулирует также интегрин, обеспечивающий клеточную адгезию (Whittard and Akiyama, 2001). Следовательно, эти киназы могут играть роль в региональной регуляции развития нёба вдоль переднезадней оси. Мы не можем исключить участие др. киназ, чувствительных к PP2 и специфических для заднего региона, приводящих определённому региональному ответу на ингибиторы.

Базируясь на результатах органной культуры и в реальном времени QPCR, p38MAPK α и δ оказались главными изформами, действующими совместно с членами семейства SFK, Src, Fyn и Yes во время нёбной адгезии. В данном исследовании показана функциональная перекрываемость SFK и p38MAPK в облегчении процесса нёбной адгезии, обеспечиваемой с помощью E-cadherin и integrin (Fig. 4C). TGF-β играет важную роль в нёбной адгезии (Kaartinen et al., 1995). Он активирует SFK и p38MAPKs (Pechkovsky et al., 2008, Wendt and Schiemann, 2009), а общение между TGF-β и адгезивными рецепторами наблюдается также в др. системах (Galliher and Schiemann, 2006, Galliher-Beckley and Schiemann, 2008, Kim et al., 2009). Было бы интересно проверить взаимоотношения между TGF-β адгезивными рецепторами и киназами во время нёбной адгезии. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы уверенно продемонстрировать, какие из членов семейства SFK и изоформы p38MAPK участвуют в этом процессе и идентифицировать вышестоящие и нижестоящие сигнальные молекулы, регулирующие стадию адгезии. Возможно участие др. связанных с интегринами нижестоящих сигнальных молекул, таких как FAK и из Rho семейства GTPases в процессе адгезии.