Хотя расщепление нёба у Pax9-дефицитных мышей впервые было описано более 15 лет тому назад (Peters et al., 1998), молекулярные механизмы участия Pax9 вразвитии нёба не выявлены. В данном исследовании мы установили, что Pax9 регулирует передачу мезенхимно-эпителиальных сигналов и формирование АР паттерна во время роста нёба и что Pax9 действует выше Osr2, чтобы регулировать рост и подъем нёбных створок.

Передача реципрокных сигналов между эпителием и нервным гребнем, происходящим из мезенхимы, играет критическую роль в росте вторичного нёба (Bush and Jiang, 2012; Lan and Jiang, 2009; Rice et al., 2004; Welsh and O'Brien, 2009). Мы установили, что нарушение паттерна экспрессии Shh в эпителии нёба, находится среди самых ранних обнаружимых дефектов во время развития нёба у Pax9^del/del мутантных мышей. Замечательно, что экспрессия мРНК Shh в эпителии нёба также нарушается у Pax9^fNeo/delWnt1-Cre мутантных эмбрионов (Fig. 5), демонстрируя, что Pax9-обеспечиваемая регуляция транскрипции в мезенхиме нёба, происходящей из нервного гребня, косвенно регулирует экспрессию Shh в эпителии нёба. предыдущее исследованик патогенеза расщепления нёба у Msx1^-/- мутантных мышей продемонстрировало роль для Bmp4, действующего ниже Msx1 в мезенхиме нёба, но выше экспрессии Shh в эпителии нёба в передней его части (Zhang et al., 2002). В то время как Zhang et al. (Zhang et al., 2002), используя метод гибродизации in situ срезов, подтвердили, что экспрессия Msx1 и Bmp4 ограничена передним регионом нёба, наш метод гибридизации in situ препаратов в целом чётко выявил экспрессию мРНК Bmp4 в дискретном домене в задней части нёба на ст. E12.5 и E13.5 (Fig. 8E,G). Levi et al. (Levi et al., 2006) описали результаты гибридизации in situ тотальных препаратов для экспрессии мРНК Bmp4 на ст. E13.5 в нёбе и также выявили домен сильной экспрессии Bmp4 в задней части нёба (Levi et al., 2006). Мы осуществили гибридизацию in situ целой серии фронтальных срезов нёба мышай на ст. E13.5 и подтвердили отдельные домены экспрессии мРНК Bmp4 в переднем и заднем регионах нёбных створок (Fig. 8I,K,M). Более того, Levi et al. (Levi et al., 2006) показали, что экспрессия мРНК Bmp4 в передней части нёба, но не в задней части, редуцирована у Msx1^-/- эмбрионов по сравнению с эмбрионами дикого типа (Levi et al., 2006). Мы установили, что задний домен экспрессии мРНК Bmp4 существенно подавлен у Pax9^del/del мутантных эмбрионов, указывая тем самым, что Pax9 регулирует экспрессию Bmp4 в задней части нёба независимо от Msx1. Предыдущее биохимическое исследование показало, что Pax9 д. активировать экспрессию репортера luciferase, управляемого промотором гена или Msx1 или Bmp4 в совместно трансфицированных COS7 клетках (Ogawa et al., 2006). Итак, эти данные подтверждают, что Pax9 непосредственно регулирует экспрессию Msx1 и Bmp4 в нёбной мезенхиме и что экспрессия Bmp4 в задней части нёба также может участвовать в поддержании экспрессии Shh в эпителии нёба.

Помимо Bmp4, экспрессирующийся в мезенхиме Fgf10 участвует в поддержании экспрессии Shh в эпителии нёба, при этом Fgf10 и Shh действуют в виде позитивной петли обратной связи, регулируя рост нёба (Lan and Jiang, 2009; Rice et al., 2004). Экспрессия мРНК Fgf10 подавляется в мутантных Pax9^del/del нёбных створках. Мы установили, что экспрессия мРНК Fgf10 также подавляется у мутантов Osr2^-/- в нёбных створках и что экспрессия мРНК Osr2 существенно подавляется в Pax9^del/del мутантных нёбных половинках. Более того, мы установили, что экспрессия мРНК Fgf10 mRNA восстанавливается в субнаборе из Pax9^{Osr2KI/Osr2KI} мутантных нёбных створок, это коррелирует с частичным восстановлением морфогенеза нёба у Pax9^{Osr2KI/Osr2KI} мутантных эмбрионов. Эти данные подтверждают, что Pax9 может регулировать экспрессию Fgf10 развивающейся нёбной мезенхиме посредством Osr2.

Хотя Osr2^-/- и Pax9^del/del мутантные мыши имеют расщепление нёба, но фенотип нёба не тот же самый. Osr2^-/- мутантные эмбрионы обнаруживают снижение пролиферации мезенхимных клеток вдоль AP оси нёбных створок на ст. E13.5 (Lan et al., 2004), тогда как мутантные эмбрионы Pax9^del/del обнаруживают снижение пролиферации мезенхимных клеток только в заднем регионе и обнаруживают уродливые нёбные створки, лишенные латеральных зазубрин (indentation). Однако, и Osr2^-/- и Pax9^del/del мутантные эмбрионы имеют дефекты подъема нёбных створок (Lan et al., 2004; and this study). Мы установили, что экспрессия мРНК Osr2 значительно подавлена в мутантных Pax9^del/del нёбных створках, начиная с E12.5, и что восстановление экспрессии Osr2 в нёбной мезенхиме посредством аллеля Pax9^Osr2KI восстанавливает подъем нёбных створок и морфогенез задней части нёба у примерно 50% Pax9^{Osr2KI/Osr2KI} мутантных мышей (Fig. 10). Является ли Osr2 непосредственной мишенью для транскрипционной регуляции с помощью Pax9, нуждается в дальнейших исследованиях, однако, поскольку поддержание экспрессии мРНК Osr2 в развивающихся нёбных створках нуждается в активной передаче сигналов Shh (Lan and Jiang, 2009), но экспрессия Shh существенно нарушена в Pax9^del/del мутантном нёбе. Более того, хотя морфогенез задней части нёба восстанавливается у Pax9^{Osr2KI/Osr2KI} эмбрионов по сравнению с мутантами Pax9^del/del, восстановление Osr2 в нёбной мезенхиме посредством аллеля Pax9^Osr2KI было недостаточным, чтобы восстановить эффекты потери Pax9 на экспрессию Bmp4, Msx1 и Shh в развивающемся нёбе. Более того, мы установили, что экспрессия мРНК Osr2 mRNA была более значительно снижена в среднем и заднем регионах мутантного Pax9^del/del нёба, это коррелировало со снижением экспрессии мРНК Shh в средней и задней областях у этих мутантных эмбрионов. Итак, эти результаты подтверждают, что Pax9 играет первостепенную роль в регуляции мезенхимно-эпителиальных взаимодействий, используя передачу сигналов Bmp4 и Shh, и что Osr2 действует иерархически ниже этих путей, чтобы регулировать пролиферацию клеток нёба и подъем нёбных створок.

Дефекты подъема нёбных створок приписываются уродству или физической обструкцией языка в некоторых мутантных линиях мышей (Barrow et al., 2000; Dudas et al., 2004; Gendron-Maguire et al., 1993; Murray et al., 2007; Wang et al., 2003). У Мутантных Pax9^del/del эмбрионов, неспособность к подъему нёбных створок также сопровождается аномальной морфологией языка (Fig. 2K,L,R). Однако, мы установили, что Pax9^del/del мутантные эмбрионы имеют дефекты в экспрессии Shh, Msx1 и Bmp4 со ст. E12.5, и обнаруживают аномально расширенный регион средины нёба на ст. E13.5, это указывает на то, что мутантные нёбные створки уже были уродливы за 1 день до времени обычного подъема нёбных створок. Аномальное расширение нёбных створок в срединном регионе нёба коррелирует с нарушением передне-задней границы в нёбных створках, тогда как отсутствие indentation (образования зубов) латеральнее нёбных створок коррелирует с ранним онтогенетическим арестом закладки зачатков молярных зубов у мутантных эмбрионов. Т.к. все Pax9^{Osr2KI/Osr2KI} эмбрионы также обнаруживают арест развития зародышей молярных зубов (Zhou et al., 2011), но примерно половина этих мутантов формирует слитые задние чатсти вторичного нёба (Fig. 10L), дефект развития зубов вряд ли является детерминирующим фактором подъема нёбных створок. Однако, мы установили, что некоторые, но не все из Pax9^{Osr2KI/Osr2KI} эмбрионов имеют восстановленную экспрессию мРНК Fgf10 в нёбной мезенхиме, это коррелирует с частичным восстановлением нёбного морфогенеза у этих мутантов. Т.о., хотя мы и не исключаем возможный вклад аномальных окружающих структур, включая зачатки зубов и язык, в нарушения подъема нёбных створок у мутантных Pax9^del/del эмбрионов, наши данные подтверждают критическую роль Pax9-зависимой экспрессии генов внутри развивающихся нёбных половин для подъема нёбных створок.

Хотя 50% эмбрионов Pax9^{Osr2KI/Osr2KI} на поздних сроках обнаруживают слияние задних частей нёба, все мутантные эмбрионы имеют расщепление передней части нёба. Дефект расщепления передней части нёба коррелирует со снижением экспрессии Msx1 в передней части нёба у Pax9^del/del и Pax9^{Osr2KI/Osr2KI} эмбрионов (Fig. 12C,D). Поскольку Msx1 не экспрессируется в задней части нёба, то эти результаты указывают, что Pax9 регулирует развитие нёба посредством различающихся молекулярных путей в переднем и заднем регионах нёба. Подобно передней нёбной мезенхиме, мезенхима развивающихся зачатков зубов обнаруживает частичное перекрывание экспрессии Msx1, Pax9 и Osr2 (Zhang et al., 2009; Zhou et al., 2011). Мы недавно установили, что Msx1 и Osr2 interact physically действуют противоположным образом в регуляции мезенхимной одонтогенной активности (Jia et al., 2013; Zhang et al., 2009; Zhou et al., 2011). Возможно, что взаимодействие Msx1-Osr2 может играть важную роль в развитии передней части нёба. У Pax9^{Osr2KI/Osr2KI} эмбрионов снижение экспрессии Msx1 затрагивает пути нежестоящего взаимодействия Msx1-Osr2, это могло бы объяснить дефект расщепления передней части нёба. Итак, эти результаты показывают, что Osr2 и Pax9 взаимодействуют с отличающимися молекулрными путями в передней и задней частях нёба. Мутантные Pax^{9Osr2KI/Osr2KI} мыши представляют собой ценный инструмент для тщательного анализа сети регуляторных генов, контролирующих развитие и формирование паттерна нёба.