Мезенхима эмбриональных легких состоит из клеток, которые принадлежат к различающимся клонам, включая миогенные, адипогенные, хондрогенные, нервные и др. клоны. Большинство из этих типов клеток возникает эндогенных (или resident) популяций предшественников, тогда как немногие (напр., нервные клетки) возникают из экзогенных источников (нервный гребень). Детерминация клеточных судеб, по-видимому, происходит в результате действия сложной сети аутокринных и паракринных сигналов, приводящих к пролиферации и дифференцировке клон-ограниченных, а также популяций мультипотенных клеток предшественников.

Fgf10 является ранним маркером для субмезотелиальной мезенхимы (Bellusci et al., 1997) , а уровни его экспрессии, как было установлено, являются критическими для поддержания как эпителиальных, так и мезенхимных предшественников (Ramasamy et al., 2007). Домен экспрессии Fgf10 в эмбриональных легких тщательно исследован. Данные по Northern blotting и quantitative PCR (qPCR) показали, что транскрипты Fgf10 прогрессивно накапливаются в эмбриональных легких между E11.5 и E18.5 (Bellusci et al., 1997; El Agha et al., 2012). In situ гибридизация для Fgf10 и X-Gal окрашивание Fgf10-lacZ лёгких показали, что экспрессия Fgf10 ограничена кончиками дистальной мезенхимы вплоть до ст. E14.5, после чего экспрессия становится дисперсной по всей мезенхиме (El Agha et al., 2012; Mailleux et al., 2005;Ramasamy et al., 2007; Tiozzo et al., 2012). Наши данные по отслеживанию клонов выявили две волны экспрессии Fgf10, каждая из которых характеризуется самостоятельным рисунком в терминах локализации клеток, а также потенциала дифференцировки (Fig. 8A). Первая волна состоит из Fgf10-позитивных клеток, меченных на ст. E11.5, а также их производных, она дает клетки, располагающиеся в основном в дистальной части мезенхимы на ст. E18.5 (особенно в дополнительно доле) и вносит вклад в миогенный (PBSMCs и VSMCs) , а также в адипогенный (lipofibroblasts) клоны. Напротив, вторая волна, состоящая из Fgf10-позитивных клеток, меченных на ст. E15.5, а также из их производных, дает клетки, которые оказываются рассеянными по всей мезенхиме на ст. E18.5 и дают адипогенные, но не миогенные, клоны. Fig. 8.

Отслеживание клонов Fgf10-позитивных клеток со ст. E10.5 показало, что эти клетки вносят вклад в клон гладкомышечных клеток, если проверяются на ст. E13.5, E15.5 и E18.5; однако процент αSma⁺ RFP⁺ клеток по сравнению с общим количеством RFP⁺ клеток обнаруживает снижение между E15.5 и E18.5. Т.к. общее количество Fgf10-позитивных клеток (меченных на ст. E11.5) обнаруживает резкое увеличение между E12.5 и E15.5, а затем на ст. E18.5, как показывает FACS анализ (а также демонстрируется с помощью time-lapse изображений на ст. E12.5 во время морфогенеза ветвления лёгких), мы пришли к заключению, что снижение количества αSma⁺ RFP⁺ клеток по сравнению с общим числом RFP⁺ клеток на ст. E18.5, скорее всего, обусловлено экспансией αSma^- RFP⁺ популяции за счет αSma⁺ RFP⁺ популяции. Др. словами, ограничение фракции αSma⁺ RFP⁺? которая возникает между E10.5 и E15.5 приводит к разбавлению популяции αSma^- RFP⁺, которое продолжается и после ст. E15.5. Это подтверждается нашим наблюдением, что αSma⁺ клетки редко пролиферируют, когда исследуются на ст. E13.5, E15.5 и E18.5 (supplementary material Fig. S4). Пролиферативная способность Fgf10-позитивных клеток была также продемонстрирована с помощью time-lapse изображений на ст. E18.5 лёгочных эксплантатов, которые были индуцированы с помощью tamoxifen на ст. E11.5 (supplementary material Movie 2) или E15.5 (data not shown). Более того, первичные культуры легочной мезенхимы на ст. E18.5 (индуцированы tamoxifen на ст. E11.5 или E15.5) показали, что ~40% RFP⁺ клеток подвергались митозу во время культивирования в течение 24 ч (supplementary material Movie 3).

Недавно сообщалось, что мультипотентная популяция сердечно-легочных клеток предшественников (Wnt2⁺ Gli1⁺ Isl1⁺), происходящая из вторичного поля сердца (SHF), проникает в лёгкие, давая воздушные пути и VSMCs помимо др. клонов (Peng et al., 2013). Наша система отслеживания клонов не метит какие-либо клетки SHF, т.к. клетки меченного клона не обнаруживаются в сердце в данный момент времени, возможно из-за делеции интронных последовательностей, содержащих сайт связывания для транскрипционных факторов Isl1, Nkx2.5, Tbx5 и др. (El Agha et al., 2012). Но возможно, что субнабор Fgf10-позитивных клеток возникает из Isl1-позитивных клеток, происходящих из SHF.

FACS анализ выявил, что первая волна экспрессии Fgf10 объясняет ~0.5% из всех легких на ст. E18.5, тогда как вторая волна объясняет ~1.5% от всех легких на ст. E18.5. Это указывает на то, что во время развития эмбриональных легких не все Fgf10-экспрессирующие клетки происходят из Fgf10-позитивных материнских клеток; скорее, домен экспрессии Fgf10 расширяется за счет de novo индукции экспрессии Fgf10 (Fig. 8B). Однако экспансия клона из Fgf10-позитивных клеток нуждается в дальнейшем исследовании с использованием confetti или rainbow Cre-репортерных мышей, чтобы оценить степень гетерогенности этих клеток и определить, обладают ли они унипотентной или мультипотентной способностью. Анализ с помощью проточной цитометрии выявил, что субпопуляция рано и поздно меченных клеток приобретает экспрессию Pdgfra на поздних стадиях развития. Неожиданно, субпопуляция из поздних Fgf10-позитивных предшественников (вторая волна) также приобретает экспрессию Epcam. Epcam⁺ RFP⁺ клетки были далее проанализированы после FACS и они обнаружили отсутствие экспрессии Nkx2.1 и E-Cad, указывая, что эти клетки не представляют bona fide популяцию эпителиальных клеток. Однако они экспрессируют достоверные уровни Pro-Spc, как показывает иммунофлюоресценция (срезов легких и отсортированных клеток) и RT-PCR, и, по-видимому, теряют экспрессию Fgf10 между ст. P2 и P30. Кстати, отсутствуют доказательства событий мезенхимно-эпителиального перехода во время развития легких, а наша предварительная работа с Dermo1-Cre; R26R линией подтверждает, что мезенхимные клетки не интегрируются в легочный эпителий (De Langhe et al., 2008; Tiozzo et al., 2012). Сходным образом, мы показали, что Fgf10-экспрессирующие клоны являются чисто мезенхимными по природе и меченные клетки никогда не обнаруживались в легочном эпителии. Могут ли эти клетки 'полностью' дифференцироваться в настоящие эпителиальные клетки при определенных условиях (напр., при острых поврежденьях) предстоит выяснить.

Альвеолярные миофибробласты и липофибробласты это два клеточных клона, которые довольно обильны во время постнатального образования альвеол. Эти типы клеток играют важные роли в формировании функциональных альвеол у новорождённых. В данном исследовании вклад Fgf10-позитивных клеток в эти два клона был исследован. Будучи меченными во время альвеолярной стадии развития легких, большинство Fgf10-экспрессирующих клеток давало липофибробласты, которые, как полагают, представляют собой нишу для стволовых клеток, которая передает сигналы соседним типа 2 альвеолярным эпителиальным клеткам паракринным способом (Barkauskas et al., 2013). Более того, минорная популяция Fgf10-экспрессирующих клеток дает миофибробласты, располагающиеся в паренхиме скорее, чем во вторичных перегородках. Альвеолярные миофибробласты, как полагают, происходят из Pdgfra-позитивных клеток, т.к. Pdgfa-нулевые новорожденные страдают от прекращения альвеологенеза из-за отсутствия этих клеток (Bostr?m et al., 1996; Lindahl et al., 1997). Сравнительно недавно, McGowan et al. показали, что экспрессия Pdgfra прямо коррелирует в экспрессией αSma и обратно коррелирует с продукцией нейтральных липидов (McGowan et al., 2008), показывая, что Pdgfra-позитивные клетки являются предшественниками для альвеолярных миофибробластов скорее, чем липофибробласты. Наш FACS анализ показал, что только ~10% Fgf10-экспрессирующих клеток, экспрессируют также Pdgfra постнатально (data not shown), это могло бы объяснить наше наблюдение, что Fgf10-экспрессирующие клетки преимущественно дают липофибробласты, чем миофибробласты (Pdgfra⁺). Липофибробласты происходят из пулов с множественными предшественниками и Fgf10-экспрессирующий пул вносит вклад в субнабор липофибробластов в легких (D.A.A., E.E.A. and S.B., unpublished). Хотя было предположено, что липофибробласты служат источником для альвеолярных миофибробластов во время формирования альвеол (Perl and Gale, 2009), наши данные указывают на то. что, по крайней мере, Fgf10-экспрессирующие липофибробласты не подвергаются подобной трансдифференцировке. Однако поскольку лиганды Fgfr2b, как было установлено, необходимы для образования альвеолярных миофибробластов во время гомеостаза (Perl and Gale, 2009; Ramasamy et al., 2007) , также как и для регенерации после удаления части легкого (Chen et al., 2012), то мы полагаем, что передача паракринных сигналов между Fgf10-позитивными клетками и Pdgfra-позитивными предшественниками, скорее всего, необходима для формирования клона альвеолярных миофибробластов во время формирования альвеол.

Fgf10-позитивные клетки были также исследованы во время гомеостаза легких у взрослых мышей. Несмотря на низкую эффективность Fgf10^iCre линии в мечении Fgf10-экспрессирующих клеток постнатально (El Agha et al., 2012), FACS анализ дезагрегированных взрослых легких выявил, что эти клетки составляют ~0.1% от всех легких. Субпопуляция Fgf10-экспрессирующих клеток (~10.5% от всего числа Fgf10-экспрессирующих клеток) обладает молекулярными характеристиками резидентных MSCs (Cd45^- Cd31^- Sca-1⁺) , которые ранее были описаны McQualter et al. (McQualter et al., 2009). Авт. сообщили, что Cd45^- Cd31^- Sca-1⁺ фракция во взрослых легких представляет собой мезенхимную популяцию резидентных клеток предшественников, которые также являются критическими для роста эпителиальных предшественников in vitro. Наши данные подтверждают находки McQualter et al. и предоставляют прямое доказательство, что экспрессия Fgf10 идентифицирует субнабор резидентных MSCs.

Наконец, Fgf10-позитивные клетки, меченные на ст. E11.5, сохранялись после рождения (P30), указывая, что эти клетки обладают способностью к самообновлению. Несмотря на это большинство этих клеток окрашивается краской для нейтральных липидов, указывая на их участие в обеспечении фенотипа липофибробластов.

Итак, описанное отслеживание клонов Fgf10-экспрессирующих клеток представило популяцию мезенхимных предшественников в легких in vivo. Эти клетки давали воздушные пути и VSMCs, а также липофибробласты во время эмбрионального развития. У новорожденных эти клетки вносили вклад в формирование липофибробластов, а также во время взрослой жизни, они представляют собой субнабор резидентных MSCs, которые могут играть критическую роль в регенерации легких после повреждений. Наши наблюдения, что некоторые производны от Fgf10-экспрессирующих клеток экспрессируют Pro-Spc показывают, как мало мы знаем об иерархии клонов в легочной мезенхиме. Необходима дальнейшая характеристика различных мезенхимных клонов в легких, ключевых сигнальных путей (напр. FGF, Wnt, Hedgehog), и в конечном счете необходимо воплощение накопленных знаний в новых терапевтических стратегий для лечения интерстициальных легочных болезней.